专利名称：具有β-葡糖苷酶活性的新蛋白质及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的新蛋白质及其用途，详细地说，涉及来源于解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)的具有β -葡糖苷酶活性的新蛋白质、该蛋白质的类似体和改变体、编码这些蛋白质的多核苷酸、以及这些蛋白质的制造方法和用途。
背景技术：
纤维素是高等植物细胞的主要构成成分，广泛地天然存在。纤维素是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键聚合而成的高分子多糖，天然纤维素以结晶状或非结晶状态存在，进一步与其他成分、木质素、半纤维素类、果胶类等复杂地结合而构成植物组织。纤维素酶是分解纤维素的酶的总称，一般由微生物生产的纤维素酶包含多种纤维素酶成分。纤维素酶成分从其底物特异性方面出发，被分类为纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶3种，在作为产生纤维素酶的丝状菌的黑曲霉(Aspergillus niger)的情况下，认为最多产生4种纤维二糖水解酶、15种内切葡聚糖酶、15种β-葡糖苷酶。认为这些显示各种作用方式的多个酶互补表达协同效果，从而分解作为植物细胞壁的主成分的纤维素。葡糖苷酶被认为催化使葡萄糖从纤维寡糖、纤维二糖或与苷元形成β-D-吡喃葡萄糖基结合的配糖体中游离出来的反应，是在纤维素的糖化系的最终阶段和葡萄糖从配糖体的游离中重要的酶。从生物质转换乙醇具有可能容易获得、能够避免材料的燃烧或地下掩埋、和乙醇燃料清洁等优点。木材、农业残留物、草本性作物和都市的固体状垃圾作为乙醇制造用生物质被关注。这些材料主要包含纤维素、半纤维素和木质素。一旦纤维素被转化为葡萄糖，葡萄糖就容易地被酵母发酵成乙醇。另一方面，纤维二糖不会容易地被酵母发酵成乙醇，残留的纤维二糖造成乙醇收量的降低。更重要的是，纤维二糖对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶来说是强的抑制剂。因此水解中的纤维二糖的积累对于乙醇制造是不优选的。由于纤维素酶产生微生物一般基本不产生β -葡糖苷酶，因而在酶的水解中发生的纤维二糖的积累成为主要问题。为了促进从纤维二糖向葡萄糖的转化，在宿主中过量表达葡糖苷酶、增加葡糖苷酶的收量是促进从生物质向葡萄糖的糖化的有效方法。因此，期望用与导入纤维
素酶产生微生物并表达的、新的葡糖苷酶基因的分离。另一方面，关于丝状菌解纤维顶孢霉，已经报告了其生产糖化力强的纤维素酶 (非专利文献1)，在饲料用途和/或青贮料用途中具有高有用性(专利文献1-；3)。另外，关于所含有的纤维素酶成分(专利文献4-10)也进行了详细研究，明确了其与其他丝状菌同样地分泌多种纤维素酶成分。特别是关于纤维素酶中的葡糖苷酶活性，报告了活性显著高于里氏木霉(Trichoderma reesei)等的纤维素酶(专利文献11)。从这样的特性出发，作为分离葡糖苷酶基因的对象，解纤维顶孢霉受到关注。然而，到目前为止从解纤维顶孢霉分离出的基因还很少(专利文献9、10)，而且对于分离出的基因，到目前为止还没有成功地在除解纤维顶孢霉以外的丝状菌中表达。
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专利文献1 日本特开平7464994号公报专利文献2 日本特许第2531595号说明书专利文献3 日本特开平7-236431号公报专利文献4 日本特开2001-17180号公报专利文献5 国际公开97/33982号小册子专利文献6 国际公开99/011767号小册子专利文献7 日本特开2000/69978号公报专利文献8 日本特开平10-066569号公报专利文献9 日本特开2002/101876号公报专利文献10 国际公开2002/(^6979号小册子专利文献11 日本特公昭60-43卯4号公报非专禾Ij文献1 :“了夕D力卟手工，A · 了 >卜·· · K 4才口夕力卟 夂笑叉卜D — (Agricultural and Biological Chemistry)(日本)，1987 年，第 51 卷，第 65 页
发明内容
发明所要解决的课题本发明是鉴于这样的状况而做出的，其目标在于从解纤维顶孢霉中分离新的葡糖苷酶基因。本发明的进一步目标在于使分离出的葡糖苷酶基因在宿主中高表
达，增加从宿主的葡糖苷酶的收量。用于解决课题的方法本发明者们为了解决上述课题，对于来源于解纤维顶孢霉的葡糖苷酶的分离、纯化方法反复进行了深入研究，结果终于成功地在解纤维顶孢霉中鉴定出了与到目前为止已知的葡糖苷酶不同的新的葡糖苷酶。并且，还成功地分离出了编码所鉴定出的葡糖苷酶的基因。关于从解纤维顶孢霉中分离葡糖苷酶基因，认为经过长年试验也没有分离出本发明者们所发现的基因是由于，该基因所编码的蛋白质的疏水性高， 其分离、纯化困难的缘故。进而，本发明者们对于使分离出的来源于解纤维顶孢霉的β-葡糖苷酶基因在宿主中高表达，在宿主中生产具有优异的活性的葡糖苷酶的方法进行了深入研究，结果通过在β -葡糖苷酶基因中引入多个碱基的改变，在世界上首次成功地在除解纤维顶孢霉以外的丝状菌内高表达葡糖苷酶基因，并且使表达产物发挥高的葡糖苷酶活性。 由此，可以在宿主中高表达来源于解纤维顶孢霉的葡糖苷酶，增加葡糖苷酶的生产量。本发明者们发现，如果利用从这样制作的转化体获得的β -葡糖苷酶或纤维素酶制备物，则可以有效地进行从生物质向葡萄糖的糖化、和/或纤维素系底物的各种处理、改变， 从而完成了本发明。即，本发明涉及来源于解纤维顶孢霉的具有葡糖苷酶活性的新蛋白质、其类似体和改变体、编码这些蛋白质的多核苷酸、以及这些蛋白质的制造方法和用途，更详细地说，本发明提供下述方案。(1)编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的、下述⑴ (Vi)的任一项所记载的多核苷酸，
(i)编码包含序列号3所记载的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，(ii)包含序列号1或2所记载的碱基序列的编码区的多核苷酸，(iii)编码由在序列号3所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加了 1 个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸，(iv)编码包含与序列号3所记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，(ν)与由序列号1或2所记载的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸，(vi)从(i) (ν)所记载的多核苷酸中除去了编码信号序列的碱基序列的多核苷酸。(2)根据⑴所述的多核苷酸，来源于丝状菌。(3)根据( 所述的多核苷酸，丝状菌是解纤维顶孢霉。(4)编码具有β -葡糖苷酶活性的蛋白质的、下述(i)或(ii)所记载的多核苷酸，(i)编码包含序列号5所记载的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，(ii)包含序列号4所记载的碱基序列的编码区的多核苷酸。(5)多核苷酸，是由在序列号4所记载的碱基序列中置换、缺失、插入和/或添加了 1个或多个碱基的碱基序列构成的多核苷酸，该多核苷酸编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质，并且能在绿色木霉中表达。(6)根据( 所述的多核苷酸，能够使该多核苷酸在绿色木霉中表达的情况下的转化体中的葡糖苷酶活性，与绿色木霉的亲株中的葡糖苷酶活性相比，提高至5倍以上。(7)从(4) (6)的任一项所述的多核苷酸中除去了编码信号序列的碱基序列的多核苷酸。(8)表达载体，包含(1) (7)的任一项所述的多核苷酸。(9)宿主细胞，经(8)所述的表达载体转化。(10)由(1) (7)的任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。(11)根据(10)所述的蛋白质，是重组蛋白质。(12) (11)所述的蛋白质的制造方法，包括培养(9)所述的宿主细胞，由该宿主细胞和/或其培养物中采集所表达的蛋白质的工序。(13)纤维素酶制备物，包含(11)所述的蛋白质。(14)分解或转换纤维素材料的方法，包括用(10)所述的蛋白质或(1 所述的纤维素酶制备物处理纤维素材料的工序。(15)被分解或转换了的纤维素材料的制造方法，包括用(10)所述的蛋白质或 (13)所述的纤维素酶制备物处理纤维素材料、回收纤维素材料分解物的工序。(16)根据(1 所述的方法，纤维素材料分解物是糖。(17)洗剂组合物，包含(10)所述的蛋白质或(1 所述的纤维素酶制备物。(18)含纤维素的纤维的处理方法，包括使(10)所述的蛋白质、(13)所述的纤维素酶制备物、或(17)所述的洗剂组合物与含纤维素的纤维接触的工序。(19)废纸的脱墨方法，其特征在于，在将废纸用脱墨药品处理进行脱墨的工序中，使用(10)所述的蛋白质或(1 所述的纤维素酶制备物。(20)滤水性被改善了的纸浆的制造方法，包括用(10)所述的蛋白质或(1 所述的纤维素酶制备物处理纸浆的工序。(21)消化能力被改善了的动物样品的制造方法，包括用(10)所述的蛋白质或 (13)所述的纤维素酶制备物处理动物饲料的工序。(22)由(2)所述的多核苷酸所编码的蛋白质的表达被抑制了的丝状菌。发明的效果根据本发明，提供来源于解纤维顶孢霉的新的葡糖苷酶基因、和用于在宿主内高效地表达葡糖苷酶的、该葡糖苷酶基因的类似体和改变体。进而，提供高表达该葡糖苷酶、显示优异的葡糖苷酶活性的宿主。由此，可以作为纯化蛋白质或作为纤维素酶制备物，以高收量获得来源于解纤维顶孢霉的β -葡糖苷酶。
图1是显示质粒pBGLB的限制性酶图谱的图。
具体实施例方式肺本发明提供新的具有葡糖苷酶活性的蛋白质和编码该蛋白质的多核苷酸。在本发明中，“β-葡糖苷酶”是指显示β-葡糖苷酶活性的酶、S卩β-D-Glucoside glucohydrolase EC3. 2. 1. 21。“ β -葡糖苷酶活性”是指以外切机制水解纤维寡糖、纤维二糖、或与苷元形成β -D-吡喃葡萄糖基结合的配糖体，生成葡萄糖的活性。本发明的编码具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质的“多核苷酸”可包含例如，DNA 或RNA、或它们的修饰体或嵌合体，优选为DNA。DNA包含cDNA、基因组DNA、和化学合成 DNA。由本发明者们所分离出的编码来源于解纤维顶孢霉的新的葡糖苷酶(以下称为 "acBGLB")的cDNA的碱基序列示于序列号1，基因组DNA的碱基序列示于序列号2。另外， 由这些DNA所编码的acBGLB的氨基酸序列示于序列号3。本发明的多核苷酸的优选方式是编码由序列号3所记载的氨基酸序列构成的 acBGLB的多核苷酸，可列举例如，包含序列号1或2所记载的碱基序列的编码区的多核苷酸。本发明还包含编码与acBGLB功能上同等的蛋白质的多核苷酸。作为这样的多核苷酸，可列举例如，acBGLB的突变体、衍生物、等位基因、变异体和同源物。这里“功能上同等”是指作为对象的蛋白质具有葡糖苷酶活性。优选与acBGLB相比具有70%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、最优选为95%以上的β-葡糖苷酶活性。作为对象的蛋白质和acBGLB的β -葡糖苷酶活性，可以在用文献(Methods in ENZYMOLOGY, vol. 160, Biomass Part A Cellulose and Hemicellulose, Willis A. Wood 编 pl09_110)记载的方法测定时，作为1分钟由对硝基苯基-葡糖苷生成1 μ moL的对硝基苯酚的活性进行评价。编码与acBGLB功能上同等的蛋白质的多核苷酸的一种方式，是编码由在序列号3 所记载的氨基酸序列中置换、缺失、和/或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸。被改变的氨基酸残基的数优选为1 40个、更优选为1 20个、进一步优选为 1 8个、最优选为1 4个。作为氨基酸的改变，优选为保守置换。“保守置换”是指以实质上不改变多肽的活性的方式将1个或多个氨基酸残基用其他化学上类似的氨基酸残基置换。可列举例如，将某个疏水性氨基酸残基用其他疏水性氨基酸残基置换的情况、将某个极性氨基酸残基用具有相同电荷的其他极性氨基酸残基置换的情况等。可以进行这样的置换的功能上类似的氨基酸对于各个氨基酸是本领域技术人员公知的。如果列举具体例，则作为非极性(疏水性)氨基酸，可列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷的(碱性)氨基酸，可列举精氨酸、组氨酸、 赖氨酸等。另外，作为具有负电荷的(酸性)氨基酸，可列举天冬氨酸、谷氨酸等。本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸，在绿色木霉中表达的情况下，特别优选为编码包含序列号5所记载的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸(例如，包含序列号4所记载的碱基序列的编码区的多核苷酸)。序列号4所记载的碱基序列与编码 acBGLB的多核苷酸的碱基序列(序列号1)相比，13. 2%以上的碱基被改变。而且，在其编码的氨基酸序列中，对于20种氨基酸中的16种氨基酸，进行了编码的碱基序列的改变，在确定与各氨基酸对应的密码子时，考虑了宿主中的密码子的使用频率分布。由此，成功地在能够在绿色木霉中表达的同时，使表达产物发挥高的葡糖苷酶活性。一旦得到了这样的忧化序列，只要是本领域技术人员，就能够以该序列为基础，进一步改变碱基序列，获得与包含序列号4所记载的碱基序列的编码区的多核苷酸同样地能够在木霉属中表达的多核苷酸。因此，本发明提供由在序列号4所记载的碱基序列中置换、缺失、插入和/或添加了 1个或多个(优选为30个碱基以内、进一步优选为20个碱基以内、进一步优选为10个碱基以内、进一步优选为5个碱基以内)碱基的碱基序列构成，且编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质，并且能够在绿色木霉中表达的多核苷酸。这样的多核苷酸的优选方式，是能够使在绿色木霉中表达的情况下的转化体中的葡糖苷酶活性，与绿色木霉的亲株(尿嘧啶生物合成基因未缺失的原绿色木霉菌株)中的葡糖苷酶活性(参照实施例5)相比， 提高至5倍以上(优选为7倍以上)的多核苷酸。本发明中的、编码与acBGLB功能上同等的蛋白质的多核苷酸的其他方式，是编码由与序列号3所记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有 β-葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸。这里“同一性(identity) ”是指在作为本领域技术人员公知的同源性检索程序的 FASTA3 [Science，227，1435-1441 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)、http://www. ddbj. nig. ac. jp/E-mail/homology-j. html] 中使用默认(初始设定)的参数计算出的数值。作为所述同一性，优选为95%以上的同一性、进一步优选为98%以上的同一性、特别优选为99%以上的同一性。本发明中的、编码与acBGLB功能上同等的蛋白质的多核苷酸的其他方式，是与由序列号1或2所记载的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有β -葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸。这里“严格条件”是指将杂交后的膜的洗涤操作在高温度低盐浓度溶液中进行，例如，在2XSSC浓度(1XSSC :15mmol/L柠檬酸3钠、150mmol/L氯化钠)、0. 5% SDS溶液中、60°C、20分钟的洗涤条件。
本发明还提供从编码acBGLB或与acBGLB功能上同等的蛋白质的多核苷酸中除去了编码信号序列的碱基序列的多核苷酸。acBGLB的信号序列，是在序列号3所记载的氨基酸序列中-18位 -1位的氨基酸序列。本发明的蛋白质在不影响β-葡糖苷酶活性的范围内，可以在与成熟蛋白质部分对应的各氨基酸序列的N末端和/或C末端赋予任意的多肽序列。作为这样的多肽序列， 可列举例如，信号序列、检测用标记(例如，FLAG标签)、纯化用多肽[例如，谷胱甘肽S-转移酶(GST)]。本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸的制备对于本领域技术人员来说可以利用常规方法来进行。在本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的基因组DNA的制备中，例如，首先，从解纤维顶孢霉等目标微生物中通过惯用方法提取基因组DNA。将该基因组DNA用适当的限制性酶消化后，与适当的载体连接，从而制作解纤维顶孢霉的基因组DNA文库。作为载体，可以使用例如，质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、BAC载体等各种载体。接着，可以基于本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸的碱基序列(例如，序列号2)制成适当的探针，从基因组DNA文库中通过杂交来分离所需的基因组DNA。另外，还可以基于本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸的碱基序列(例如，序列号2)制成引物，以解纤维顶孢霉的基因组DNA为模板进行PCR， 将扩增出的DNA片段与适当的载体连接，从而分离所需的基因组DNA。另外，在本发明的编码具有β -葡糖苷酶活性的蛋白质的cDNA的制备中，例如，首先，基于从解纤维顶孢霉等目标微生物中提取出的mRNA合成cDNA。将该cDNA用适当的限制性酶消化后，与适当的载体连接，从而制作解纤维顶孢霉的cDNA文库。接着，可以基于本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸的碱基序列(例如，序列号1)制成适当的探针，从cDNA文库中通过杂交分离出所需的cDNA。另外，可以基于本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸的碱基序列(例如，序列号1)制成引物，以解纤维顶孢霉的cDNA为模板进行 PCR,将扩增出的DNA片段与适当的载体连接，从而分离所需的cDNA。另外，本发明的编码具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸也可以人工化学合成。在本发明中，提供以能够在宿主微生物内复制、且能够表达由该多核苷酸序列编码的蛋白质的状态包含本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸的表达载体。本发明的表达载体可以以自我复制载体、即作为染色体外的独立体存在、其复制不依赖于染色体的复制的例如质粒为基础来构建。另外，本发明的表达载体在被导入宿主微生物时，还可以插入到该宿主微生物的基因组中，与其所插入的染色体一起复制。本发明的表达载体的构建的步骤和方法可以使用基因工程学领域惯用的步骤和方法。本发明的表达载体为了能够实际导入宿主微生物并表达具有葡糖苷酶活性的蛋白质，优选除了上述本发明的编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的多核苷酸序列之夕卜，还包含控制其表达的多核苷酸序列和/或用于筛选微生物的基因标记等。作为控制表达的多核苷酸序列，可列举例如，启动子、终止子、或编码信号肽的多核苷酸序列。启动子只要在宿主微生物中显示转录活性即可，不特别限定，可以来源于宿主微生物的同种微生物， 也可以来源于异种微生物。另外，信号肽只要是在宿主微生物中有助于蛋白质的分泌即可， 不特别限定，可以来源于宿主微生物的同种微生物，也可以来源于异种微生物。另外，基因标记可以根据转化体的筛选方法适宜选择，例如，可以利用编码耐药性的基因和/或互补营养缺陷型的基因。而且，本发明提供经该表达载体转化的微生物。作为本发明中使用的宿主微生物， 不特别限定，可列举例如，丝状菌、酵母、大肠杆菌、放线菌等。作为酵母细胞，可列举例如， 属于酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、或毕赤酵母属(Pichia)的酵母细胞，优选的酵母细胞的一例是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 0另外，作为丝状菌， 可列举例如，属于腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)、 镰刀菌属(Fusarium)、或顶孢霉属(Acremonium)的丝状菌，优选的丝状菌的例子是特异腐质霉(Humicola insolens)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)、或绿色木霉(Trichoderma viride)、尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum)、或角军纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)。本发明的表达载体的这些微生物的转化可以按照本领域惯用的方法来进行。可以将这样制备的转化体在适当的培养基中培养，从其培养物(例如，培养细胞、 培养上清)中回收本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质(或后述的本发明的纤维素酶制备物)。转化体的培养及其条件可以与所使用的微生物的培养及其条件本质上同等。另夕卜，在培养转化体之后回收目标蛋白质的方法可以使用本领域惯用的方法。例如，可以使用转化体的培养结束后，将培养物通过离心分离等除去而得的上清液作为粗酶。进而，可以将该上清液通过超滤法等浓缩，加入防腐剂等制成浓缩酶。进而，浓缩后可以通过喷雾干燥法等制成粉末酶。本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质(或本发明的纤维素酶制备物) 可以将这些浓缩酶或粉末酶根据需要部分纯化或高度纯化而获得。作为纯化方法，可以单独或适宜组合使用常规方法，例如利用硫酸铵等的盐析法、利用醇等的有机溶剂沉淀法、膜分离法、或使用离子交换体、疏水色谱用载体、或凝胶过滤用载体等的色谱分离法。本发明还提供这样的本发明的具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质(或本发明的纤维素酶制备物)的制造方法。纤维素酶制备物本发明提供包含上述本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质的纤维素酶制备物。本发明的纤维素酶制备物除了本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质以外，还可以包含其他蛋白质。作为其他蛋白质，例如，可以包含除本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质以外的葡糖苷酶、半纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、氨肽酶、淀粉酶、 糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、 α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、加卤酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白质分解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转胺酶或木聚糖酶。本发明的纤维素酶制备物所含的、除本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质以外的蛋白质可以来源于表达本发明的具有β -葡糖苷酶活性的蛋白质的转化体，也可以另外添加。本发明的纤维素酶制备物可以与一般含有的载体或介质例如赋形剂(例如，乳糖、氯化钠、山梨糖醇等)、表面活性剂、防腐剂等混合来制造。另外，本发明的纤维素酶制备物可以以适当的形状、例如粉末或液体状来制备。n有 β-mm^mm^^m^mmMM^mm^本发明提供包括用本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质或本发明的纤维素酶制备物处理纤维素材料的步骤的分解或转换纤维素材料的方法。进而，本发明提供包括在处理纤维素材料之后回收纤维素材料分解物的步骤的被分解或转换了的纤维素材料的制造方法。纤维素材料典型地为生物质，作为其例子，可列举稻秸、甘蔗渣、玉米秸、椰子果实等果实的榨渣、废木材、和对它们进行适当的前处理后的材料，但不限于这些。在纤维素材料的处理中使用的、具有葡糖苷酶活性的蛋白质或纤维素酶制备物可以是除去了细胞的形态、或者未除去的粗制发酵液的形态，也可以是半纯化或纯化后的制备物的形态。本发明的转化体在使用生物质的发酵工艺中，可以作为生产本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质的源使用。转化体中还可以导入各种纤维素酶基因、和/或编码在生物质的加工中有效的其他酶的基因。本发明的方法可以用于例如由生物质化学地或作为发酵给料制造糖(例如，单糖类、二糖类、多糖类)。这样获得的糖是用于制造例如乙醇、塑料、其他生成物或中间体的原料。本发明还提供包含本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质或本发明的纤维素酶制备物的洗剂组合物。本发明的洗剂组合物还可以含有表面活性剂(可以是阴离子性、 非离子性、阳离子性、两性或双性离子性或它们的混合物)。另外，所述洗剂组合物还可以含有本领域已知的其他洗剂成分，例如，增洁剂、漂白剂、漂白活性剂、防腐剂、金属离子螯合齐U、污垢解离聚合物、香料、其他酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)、酶稳定剂、制剂化辅助剂、 荧光增白剂、和/或发泡促进剂等。本发明还提供包括使本发明的具有β -葡糖苷酶活性的蛋白质、本发明的纤维素酶制备物、或该洗剂组合物与含纤维素的纤维接触的工序的含纤维素的纤维的处理方法。 作为能够通过本发明的处理方法来改善的、含纤维素的纤维的性质，可列举例如，(1)通过减量来改善纤维的肌肤触感和外观；( 赋予着色的含纤维素的纤维以颜色的局部变化， 即，向着色含纤维素的纤维、代表性地为牛仔布赋予石洗样的外观和手感；C3)使着色含纤维素的纤维的颜色清新化、(4)柔软化(降低开始发硬的速度、减少发硬)、(5)除去毛刺 (降低开始起毛的速度、减少起毛)。本发明还提供废纸的脱墨方法，其特征在于，在将废纸用脱墨药品处理进行脱墨的工序中，使用本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质或本发明的纤维素酶制备物。本发明还提供包括用本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质或本发明的纤维素酶制备物处理纸浆的工序的、滤水性被改善了的纸浆的制造方法。根据本发明，可以在不伴随强度显著降低的条件下改善纸浆的滤水性。作为处理对象的纸浆的例子，可列举废纸浆、再循环厚纸浆、牛皮纸浆、亚硫酸纸浆或加工热处理和其他高收率纸浆，但不限于这些。本发明还提供包括用本发明的具有葡糖苷酶活性的蛋白质或本发明的纤维素酶制备物处理动物饲料的工序的、消化能力被改善了的动物饲料的制造方法。根据本发明的方法，例如，可以改善动物体内对饲料中的葡聚糖的消化能力。H有β -苷S^舌件的蛋白Jli的表达她抑泡IT的丝状If本发明提供本发明的具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质的表达被抑制了的丝状菌。 丝状菌优选为属于顶孢霉属(Acremonium)的丝状菌，最优选为解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)。丝状菌中的本发明的具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质(内源性蛋白质) 的表达的抑制可以利用例如RNA干涉法、反义RNA *DNA法、同源重组等通用技术来进行。制成用于这些技术的多核苷酸分子(例如，siRNA、反义RNA、反义DNA、包含与用于同源重组的
11目标DNA相同的序列的多核苷酸等)、制成包含这些多核苷酸的载体、和向宿主导入载体的方法是本领域技术人员公知的。在利用这样制作的丝状菌进行在植物等中广泛分布的纤维素的分解的情况下，在其分解过程中不生成作为最终分解物的葡萄糖，而是选择性地制造两分子葡萄糖以β _1，4键结合而成的纤维二糖。纤维二糖由于在有甜味的同时在人体内不被分解，因而作为健康食品和/或糖尿病患者用食品的甜味料、化妆品原料、或药品原料是有用的。如果利用本发明的丝状菌，则可以廉价地提供这样的制品原料。实施例通过实施例更具体地说明本发明，但本发明在不超过其要旨的范围内不限于以下实施例。[实施例1]解纤维顶孢霉的β-葡糖苷酶的纯化由解纤维顶孢霉制备喷雾干燥后的纤维素酶的粉末酶，溶解在含0.5Μ的 (NH4)2SO4 WTris-HCl缓冲液(0. 05Μ、ρΗ值7. 0)中，通过高速冷却离心分离除去杂质。将所得的上清作为酶纯化的起始材料，用以下所示的方法纯化。(a)疏水性色谱法(其1)在含0. 5M的(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液(0. 05M、ρΗ值7. 0)中使上清所含的蛋白质吸附于HiTrap Butyl FF(GE Healthcar社制)，接着在含(NH4)2S04 0· 5M OM的 Tris-HCl缓冲液(0. 05M、pH值7. 0)中进行所吸附的蛋白质的梯度溶出，分离出显示β -葡糖苷酶活性的级分。(b)疏水性色谱法(其2)使上述(a)所得的级分中的蛋白质再次吸附于HiTrap Butyl FF(GE Healthcare 社制)，接着用与(a)同样的方法进行所吸附的蛋白质的梯度溶出，分离出显示葡糖苷酶活性的级分。(c)强碱性阴离子交换色谱法在Tris-HCl缓冲液(0. 05Μ、ρΗ值7. 0)中，使上述(b)所得的级分中的蛋白质吸附于 MonoQ (GE Healthcare 社制)，在含 NaCl OM IM 的 Tris-HCl 缓冲液(0. 05M、ρΗ 值 7.0)中进行所吸附的蛋白质的梯度溶出，分离出显示葡糖苷酶活性的级分。[实施例2]纯化的β-葡糖苷酶的部分氨基酸序列确定对于实施例1的用强碱性阴离子交换色谱法分离出的具有β -葡糖苷酶活性的级分，使用12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 二社制)通过电泳进行分离，鉴定出解纤维顶孢霉的葡糖苷酶B(acBGLB)。切下acBGLB的条带，然后还原羧甲基化，接着用赖氨酰肽链内切酶(Lysyl Endopeptidase)处理。将该分解产物使用 12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 -社制)通过电泳进行分离，点样在PVDF膜(S V 社制)上。切下所得的肽片段的条带，使用蛋白质测序仪Model 492( Π八K 才* ；^〒Λ <社制)确定肽片段的N末端氨基酸序列。确定的acBGLB的部分氨基酸序列(“BGLB-LE-1 ”、“BGLB-LE-2”)分别示于序列号6和7。[实施例3]acBGLB基因的克隆(1)基因组DNA的分离将解纤维顶孢霉ACCP-5-1菌株用(s)培养基O %肉汤、0. 5 %酵母提取物和 2%葡萄糖)在32°C培养2天，通过离心分离回收菌体。按照堀内等的方法(H. Horiuchiet.al.，J. Bacteriol.，170，272-278，(1988))从所得的菌体中分离基因组 DNA。(^acBGLB基因片段的获得基于acBGLB的部分氨基酸序列制作以下引物。BGLB-F CCNTTYGTNGGNAAYACNGCNGCNCC (序列号 8)BGLB-R CATDATRTANCCNGGRAANCC (序列号 9)使用BGLB-F和BGLB-R作为引物，以基因组DNA为模板进行PCR。PCR使用LA taq 聚合酶(夕力，才社制)进行。PCR将“94°C下30秒、53°C下30秒、72°C下2分钟，，进行35个循环。将扩增出的650bp的DNA片段使用TOPO TA克隆试剂盒(4 > e卜π 7 - > 社制)按照附带的方案插入到PCR2. 1-T0P0质粒载体中，得到质粒“TOPO-pBGLB-partial ”。克隆到质粒“TOPO-pBGLB-partial ”中的插入DNA片段的测序，使用BigDye Terminator v3. 1 Cycle Sequebcing Kit ( 7 7° 7 F K 4 才 * 7 于 Λ 文社制)和 ABI PRISM遗传分析仪(7 ” 4 κ /W ν ^ r Λ ^；'社制)按照附带的方案来确定。将所得的碱基序列翻译成氨基酸序列，对该氨基酸序列进行同源性检索，结果是，与来源于土曲霉 (Aspergillus terreus)的β -葡糖苷酶(ΧΡ_001216552)显示72%的同源性，与来源于马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的 β -葡糖苷酶(ΧΡ_002149046. 1)显示 88%的同源性，因此判断本DNA片段是β-葡糖苷酶(Glycoside Hydrolase family 3)基因的一部分。(3)通过反向PCR法获得acBGLB基因全长反向PCR法按照iTriglia等的方法(TTriglia et. al. ,Nucleic Acids Research, 16,8186, (1988))进行。将解纤维顶孢霉的基因组DNA用kal消化一夜，使用Mighty Mi(夕力，“才社制)由消化片段制作环状DNA。以本环状DNA为模板，使用基于acBGLB 基因片段的碱基序列信息制作的下述引物进行PCR，获得acBGLB基因的5’上游区域以及 3’下游区域。BGLB-inv-F TAGGCGTTCGTTATGCGAAC(序列号 10)BGLB-inv-R :AAACGAGATTCCAGATGGCG (序列号 11)通过实施例3-( 所述的方法分析上述5’上游区域以及3’下游区域，确定BGLB 基因的全长碱基序列。基于通过反向PCR法获得的碱基序列制作以下引物，以基因组DNA为模板进行 PCR，扩增BGLB基因。pBGLB-F CTGGACCTATATTCCCCGAT (序列号 12)pBGLB-R TGGTTTGTCCATACTGCGTC (序列号 13)用Τ0Ρ0 TA克隆试剂盒(4 > '卜α夕工 > 社制)将扩增所得的DNA插入到pCR2. 1-T0P0质粒载体中，得到质粒“pBGLB”。用所得的质粒“pBGLB”转化大肠杆菌 (Escherichia coli)T0P10 菌株(4 > 卜口夕工 >社制)，从而得到 “Escherichia coli T0P10 菌株 /pBGLB，，。(4) acBGLB cDNA的制作和acBGLB基因组DNA的内含子分析将解纤维顶孢霉ACCP-5-1菌株用纤维素酶诱导培养基在32°C培养2天，通过离心分离回收菌体。将所得的菌体用液氮冻结，然后使用研钵和研杵磨碎。用IS0GEN( 二 ” ^ >^一>社)按照附带的方案从该磨碎的菌体中分离总RNA。进而，使用mRNA纯化试剂盒(7 7 > * 7社)按照附带的方案从总RNA中纯化mRNA。使用 Time&iver cDNA Synthesis Kit ( 7 7 A * 7 社)按照附带的方案由这样获得的mRNA合成cDNA。由acBGLB基因序列制成包含起始密码子和终止密码子的下述引物，以cDNA为模板进行PCR。 BGLB-N :ATGTATTCCGCATTTCTTTTGCTGC (序列号 14)BGLB-C CTATTGTAGGCATTGAGAATACCAT (序列号 15)通过实施例3-⑵所述的方法来分析扩增出的cDNA的碱基序列(序列号1)，与 PBGLB基因组DNA的碱基序列比较，从而确定基因组DNA中的内含子的位置。(5) acBGLB的氨基酸序列的推定通过上述方法分离出的acBGLB基因组DNA的外显子和内含子由序列号2所记载的碱基序列的218 观47位所示的^30bp构成。另外，acBGLB基因组DNA包含序列号2 所记载的碱基序列的734 792位、1665 1717位和2523 沈01位所示的3个内含子。 由开放阅读框(ORF)预测的acBGLB的氨基酸序列如序列号3所示。该由ORF预测的氨基酸序列的一部分与在实施例2中确定的acBGLB的内部序列一致。由该事实可明确，分离出的基因组DNA编码acBGLB。此外，通过信号序列预测软件SignalP 3. 0推定acBGLB的-18 至-1氨基酸残基为信号序列。[实施例4]acBGLB基因在绿色木霉中的表达(1)适合在绿色木霉中表达的acBGLB基因密码子的改变为了使acBGLB基因在绿色木霉中作为有活性的蛋白质高表达，进行acBGLB基因的改变。由尝试法的结果发现了伴随从acBGLB基因中13. 2%以上的碱基改变的、由序列号 4所记载的碱基序列构成的DNA。该改变acBGLB基因是对于20种氨基酸中的16种氨基酸进行编码碱基序列的改变，同时考虑绿色木霉中的密码子的使用频率分布而设计出的。该改变acBGLB基因由株式会社7 — >〒〒< > 人工合成。人工合成时，设计成在起始密码子的上游的序列包含和一Bi、在终止密码子的下游包含gl和那样。获得了在 PUC19的插入了密码子改变acBGLB基因的质粒“pBGLBkai”。(2)密码子改变BGLB表达质粒BGLBkai-pCBl的构建将质粒“pBGLBkai”用Sn^BI和gl切害I]，得到约2. 7kbp的基因片段 “BGLBkai-N”。另一方面，为了从pCBl_Eg3X(国际公开98/11239号小册子)中删除潮霉素 B抗性盒，用限制性酶XMI切割，然后使用TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix(宝酒造社制)再制成环状，将所得的质粒作为“pCBl-Eg3X-hphleSS”。将“pCBl-Eg3X-hphleSS”用 StuI 和切害I]，回收约 7kbp 的片段。使用 TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix (宝酒造社制)将其与约2. 7kbp的基因片段“BGLBkai-N”连接，制成质粒“BGLBkai-pCBl”。酶等的反应条件按照试剂盒所附带的说明书的条件。质粒“BGLBkai-pCBl”构建成在宿主绿色木霉内使用自身的起始密码子表达改变acBGLB那样。(3)质粒“BGLBkai-pCBl”的绿色木霉的转化体的制作按照国际公开第2005/056787号小册子所记载的方法用实施例4-(2)中所得的质粒“BGLBkai-pCBl”转化绿色木霉。以作为尿嘧啶生物合成基因(·4)缺失菌株的绿色木霉Strain2株为宿主，使用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的pyr4基因作为选择标记， 通过共转化法进行转化。将绿色木霉strait株在50mL的菌体形成培养基(1%酵母提取物、麦芽提取物、2%多价蛋白胨、2. 5%葡萄糖、0. 磷酸氢二钾、0. 05%硫酸镁7水合物、0. 0001%尿苷(pH值7. 0))中在28°C培养24小时，以3000转/分钟离心分离10分钟， 收集菌体。将所得的菌体用0. 5mol/L蔗糖洗涤，悬浮于用棉花过滤后的原生质体化酶溶液(lmg/mL β -葡糖醛酸糖苷酶、0. 3mg/mL几丁质酶、0. 3mg/mL酵母裂解酶、0. 5mol/L蔗糖)中。在30°C振荡60分钟，使菌丝原生质体化。过滤该悬浮液，然后以2500转/分钟离心分离10分钟回收原生质体，用SUTC缓冲液(0. 5mol/L蔗糖、10mmol/L氯化钙、10mmol/L Tris-盐酸(pH值7. 5))洗涤。将该原生质体悬浮于100 μ L的SUTC缓冲液中，向其中加入添加有10 μ g分量的质粒“BGLBkai-pCBl ”的DNA溶液10 μ L和添加有pyr4基因的DNA溶液10 μ L，在冰中静置 5 分钟。接着加入400μ L 的PEG 溶液(60% PEG4000、l(toimol/L 氯化钙、l(toimol/L Tris-盐酸(pH值7. 5))，在冰中静置20分钟，然后加入IOmL的SUTC缓冲液，以2500转/分钟离心分离10分钟。将收集的原生质体悬浮于ImL的SUTC缓冲液中，与软琼脂各200 μ L在含 0. 5mol/L蔗糖的基本培养基上一起叠层，在培养5天，然后将生长的菌落再次移植至基本培养基，将这里所形成的菌落作为转化体。(4) “BGLBkai-pCBl”的转化体的培养和鉴定筛选导入质粒“BGLBkai-pCBl”而在基本培养基上生长的菌株，依据国际公开第 98/11239号小册子进行培养。将所得的培养上清液使用12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 二社制)进行电泳分离，筛选能良好地检测出与实施例2中鉴定的acBGLB相同的泳动距离的条带的培养上清。(5)重组改变acBGLB的部分氨基酸序列的鉴定为了确认在实施例4- )中大量表达的蛋白质是改变acBGLB，确定了部分氨基酸序列。首先，对于培养上清中的蛋白质使用12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 ^社制)通过电泳进行分离，按照实施例2的方法将分离的acBGLB的条带用赖氨酰肽链内切酶处理。将该分解产物使用12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 二社制)通过电泳进行分离，点样在PVDF膜 ($ 'J f 7社制)上。切下所得的肽片段的条带，使用蛋白质测序仪Model 492( 7 λ K ν ^ r Λ <社制)确定肽片段的N末端氨基酸序列。其结果与acBGLB的部分氨
基酸序列(序列号6) —致。[实施例5]绿色木霉转化体中的酶活性的测定使用实施例4-(4)所得的“BGLBkai-pCBl”转化体的培养上清测定β -葡糖苷酶活性。测定法依据文献(Methods in ENZYM0L0GY,vol. 160,Biomass Part A Cellulose and Hemicellulose, Willis A. Wood编pl09_110)所述的方法。此外，β -葡糖苷酶活性定义为1分钟内由对硝基苯基-葡糖苷生成1 μ moL的对硝基苯酚的活性，作为每ImL培养上清的活性(U/mL)表示。其结果如表1所示。正如由表1可明确的那样，转化体显示亲株 (尿嘧啶生物合成基因未缺失的原绿色木霉菌株)的约7. 5倍的活性。表 权利要求
1.编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的、下述(i) (vi)的任一项所记载的多核苷酸，(i)编码包含序列号3所记载的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸， ( )包含序列号1或2所记载的碱基序列的编码区的多核苷酸，(iii)编码由在序列号3所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸，(iv)编码包含与序列号3所记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，(ν)与由序列号1或2所记载的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸，(vi)从(i) (ν)所述的多核苷酸中除去了编码信号序列的碱基序列的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，来源于丝状菌。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，丝状菌是解纤维顶孢霉。
4.编码具有葡糖苷酶活性的蛋白质的、下述(i)或(ii)所述的多核苷酸， (i)编码包含序列号5所记载的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，( )包含序列号4所记载的碱基序列的编码区的多核苷酸。
5.多核苷酸，是由在序列号4所记载的碱基序列中置换、缺失、插入和/或添加了1个或多个碱基的碱基序列构成的多核苷酸，该多核苷酸编码具有β -葡糖苷酶活性的蛋白质，并且能在绿色木霉中表达。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，能够使该多核苷酸在绿色木霉中表达的情况下的转化体中的葡糖苷酶活性，与绿色木霉的亲株中的葡糖苷酶活性相比，提高至5倍以上。
7.从权利要求4 6的任一项所述的多核苷酸中除去了编码信号序列的碱基序列的多核苷酸。
8.表达载体，包含权利要求1 7的任一项所述的多核苷酸。
9.宿主细胞，经权利要求8所述的表达载体转化。
10.由权利要求1 7的任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
11.根据权利要求10所述的蛋白质，是重组蛋白质。
12.权利要求11所述的蛋白质的制造方法，包括培养权利要求9所述的宿主细胞，由该宿主细胞和/或其培养物中采集所表达的蛋白质的工序。
13.纤维素酶制备物，包含权利要求11所述的蛋白质。
14.分解或转换纤维素材料的方法，包括用权利要求10所述的蛋白质或权利要求13所述的纤维素酶制备物处理纤维素材料的工序。
15.被分解或转换了的纤维素材料的制造方法，包括用权利要求10所述的蛋白质或权利要求13所述的纤维素酶制备物处理纤维素材料、回收纤维素材料分解物的工序。
16.根据权利要求15所述的方法，纤维素材料分解物是糖。
17.洗剂组合物，包含权利要求10所述的蛋白质或权利要求13所述的纤维素酶制备物。
18.含纤维素的纤维的处理方法，包括使权利要求10所述的蛋白质、权利要求13所述的纤维素酶制备物、或权利要求17所述的洗剂组合物与含纤维素的纤维接触的工序。
19.废纸的脱墨方法，其特征在于，在将废纸用脱墨药品处理进行脱墨的工序中，使用权利要求10所述的蛋白质或权利要求13所述的纤维素酶制备物。
20.滤水性被改善了的纸浆的制造方法，包括用权利要求10所述的蛋白质或权利要求 13所述的纤维素酶制备物处理纸浆的工序。
21.消化能力被改善了的动物样品的制造方法，包括用权利要求10所述的蛋白质或权利要求13所述的纤维素酶制备物处理动物饲料的工序。
22.由权利要求2所述的多核苷酸所编码的蛋白质的表达被抑制了的丝状菌。
全文摘要
通过组合疏水性色谱法和强碱性阴离子交换色谱法，从而成功地从解纤维顶孢霉中鉴定出疏水性高的新的β-葡糖苷酶。进而，通过分离与鉴定出的β-葡糖苷酶对应的基因，对于其碱基序列进行一些改变，从而成功地使该基因在绿色木霉中高表达，并且使表达产物发挥高的β-葡糖苷酶活性。
文档编号C12N15/09GK102482665SQ201080036879
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月17日 优先权日2009年8月20日
发明者横山健吾, 横山史和, 间塚序子 申请人:明治制果药业株式会社