专利名称：温度循环装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种温度循环装置，其用以实施在分子生物学研究领域等中使用的生物样品反应、尤其是核酸扩增。
背景技术：
在分子生物学研究中，对样品分析等利用各种化学反应，例如酶反应。在供于反应的样品量有限时，优选能够以微量样品实施反应。核酸扩增反应为反复合成具有与模板核酸互补和/或相同的序列的核酸的方法， 已开发出PCR法、LCR法、NASBA法、ICAN法、SDA法、LAMP法之类的原理不同的多种方法。 它们分别具有不同的特征，根据目的等加以区分使用，但是在大多数情况下利用PCR法。PCR法是通过将含有模板核酸、一对寡核苷酸引物、耐热性DNA聚合酶的反应液供于依次发生“双链核酸的变性”、“寡核苷酸引物向模板核酸的退火”、“与模板核酸互补的核酸的合成”这样的温度循环而加以实施的。为了该目的，开发了使反应液的温度经时地且自动地改变的反应装置(热循环仪)。通常，PCR用微量(10 200 μ L左右)反应液进行实施。在使用容量大的反应容器时，若在反应容器部位间存在温差，则在低温部位，例如在未与反应液接触的反应容器上部壁面产生水蒸气的凝结，而成为扩增效率降低、样品间扩增效率波动的原因。为了解决该问题，实现更准确的温度循环，开发了具有以经加热的构件覆盖容纳样品的反应容器的上面的机构的装置(日本特开平6-233670号公报)、利用循环空气加热/冷却前述反应容器整体的装置(日本特表2000-511435号公报)。专利文献专利文献1 日本特开平6-233670号公报专利文献2 日本特表2000-511435号公报
发明内容
后者的装置不仅需要在反应容器周围设置用于空气循环的空间、用于空气的温度控制和循环的机构的复杂构成，而且需要使用热传导优异的反应容器(例如玻璃制容器)。 与此相对，前者的装置为以加热块和罩为主要构成要素的简单构成，能够使用在生物化学领域中通用的微管、微量滴定板。但是，由于加热块与罩之间产生空隙，因此反应容器的该部位的温度降低，而会发生水蒸气等的凝结。另外，根据设置反应容器的场所，例如设置于加热块中央部的情况和设置于加热块端部的情况下产生温差。因此，在进行PCR、酶反应时， 产生因设置反应容器的位置而导致出现反应不均这样的问题。进而，在对扩增中伴随着目标核酸扩增而产生的信号进行检测的核酸检测方法(实时-PCR)中，因用罩覆盖反应容器上面而导致该信号的检测出现问题。本发明人等发现通过将用于温育反应液的加热块制成由上层加热块与下层加热块构成的双层结构，将上层加热块的温度调节成比下层加热块的温度高，从而能够阻碍来自反应液的水蒸气等的凝结而再现性良好地实施PCR。S卩，本发明涉及一种温度循环装置，其特征在于，用于温育反应液，(1)具备用于将容纳反应液的反应容器进行保持并加热的加热块，加热块由下层加热块和上层加热块这两层构成；进而，(2)具备温度控制机构，该温度控制机构分别独立地控制下层加热块的温度与上层加热块的温度，在温育反应液时将上层加热块的温度维持成比下层加热块的温度高。本发明提供具备由上层加热块和下层加热块这两层构成的加热块的温度循环装置。前述加热块为形成有能够将容纳被温育的反应液的容器(反应容器)进行保持的凹处(槽)的结构物。前述槽只要制成与所用反应容器相应的形状即可，例如，以能够保持微管和/或微量滴定板(96孔、386孔等)、毛细管的方式进行设计。作为该反应容器，使用保持在1个槽中的每个反应容器的容量为10 2000 μ L的容器。另外，为了防止反应容器内的水分等蒸发而向反应容器外逸出，优选在反应容器带有帽、封口的基础上，将其容纳在本发明的装置中。加热块优选为热传导率优异的材质的加热块，通常使用热传导率良好的金属制 (例如铝、铜合金等)加热块。本发明中可使用使上层加热块和下层加热块为相同材质的构成、为不同材质的构成中的任何构成。加热块形成如下结构反应容器以贯通上层加热块而与下层加热块接触的方式得以保持。因而，通常上层加热块的厚度设计为0. 5 Icm的范围，优选设计为0. 6 0. 8cm的范围。下层加热块的厚度只要为在与上层加热块组合时能够容纳反应容器的范围，就没有特别的限定。优选地，由上层加热块与下层加热块这2层构成的加热块优选为能够基本到达反应容器的上端(例如为反应容器总高度的70%以上、优选为80%以上、更优选为85% 以上)地将其容纳于槽内的结构。前述加热块具备温度控制机构，其能够分别独立地控制上层加热块和下层加热块这2层的温度。该温度控制机构包括用于改变和维持下层加热块的温度的第一温度机构、 用于改变和维持上层加热块的温度的第二温度机构、及独立地控制这些温度机构而使两层的温度经时地改变的控制机构。另外，控制机构包括记忆与应执行的温度曲线相关的信息且指示其执行的计算机、及为了温度控制而取得加热块中两层的实际温度数据的传感器。 艮口，前述计算机基于输入的温度曲线信息与加热块中两层的实际温度数据，按照前述曲线控制加热块中两层的温度。应予说明，作为本发明的实施方式之一，可举出不装载计算机地通过介由适当的接口将第一温度机构、第二温度机构及传感器与外部计算机连接而能够对加热块的两层实施独立温度控制的装置。作为前述传感器，例如可使用利用电阻温度变化的电阻温度检测器。传感器分别设置在上层加热块和下层加热块上，而使独立地测量两层的温度成为可能。进而，可以在两层配置多个传感器。在第一温度机构和第二温度机构中可使用公知的加热器、冷却器，但是优选使用珀耳帖元件。另外，为了促进加热块冷却时的放热，还可以在装置中设置散热器、冷却用风扇。为了不阻碍上层加热块的温度控制，第一温度机构优选以在下层加热块的下面或者达到与下面齐平的方式设于加热块内部。另外，为了不阻碍下层加热块的温度控制，第二温度机构优选设置于上层加热块的上面或者以成为与上面齐平的方式设于加热块内部。在具备该2层结构的加热块和温度控制机构的温度循环装置中，实际上，保持反应容器下部的下层加热块进行反应液的温育。温度控制机构用规定的温度曲线信息而利用下层加热块温育反应液。此时，温度控制机构控制上层加热块的温度，维持在高于下层加热块的温度。即，上层加热块在利用下层加热块温育反应液期间以比温育温度高的温度加热反应容器的上部。如上所述，在反应液的温育时将上层加热块的温度维持成比下层加热块的温度高的温度循环装置中，只要上层加热块不阻碍利用下层加热块按照温度曲线进行反应液温育，就可以使两层接触而构成加热块。但是，一般而言，由于两层均由热传导率高的材质构成，因此若使两层接触，则存在上层加热块的热快速地传递至下层加热块，而无法按照温度曲线控制下层加热块的温度的可能。因此，温度循环装置优选具备用于防止上层加热块和下层加热块间的热传导的热传导防止机构。由此，确保在反应液的温育时，防止或者缓和从上层加热块向下层加热块的热传导，按照温度曲线控制下层加热块的温度，适当地温育反应液。作为热传导防止机构，具体而言，具有在上层加热块的下面和/或下层加热块的上面施加用于阻碍热传导的涂层(例如硅、特氟隆(Teflon，注册商标))的构成。另外，为了阻碍热传导，可以制成在上层加热块和下层加热块这2层之间配置绝热材料(例如硅、聚氨酯(耐热性))的构成。另外，以阻碍两层间的热传导为目的，可以制成在上层加热块和下层加热块这2层之间保持空间这样的构成。但是，在通过设置绝热材料或者空间而使两层间的间隔(绝热材料厚度或者空间高度)过大的情况下，有可能在温育反应液时，被保持的反应容器两层间的部位的温度变得低于反应液的温度，达到反应液成分凝结的温度。因此，两层的间隔必须为使反应液温育时反应容器两层间的部位的温度维持在比不发生来自反应液的凝结的温度(露点温度) 高、或者比反应液的温度高的温度的范围内。由此，两层间的间隔可为能够确保利用下层加热块按照温度曲线进行温育并且能够确保防止反应容器两层间的部位处的反应液凝结的最低限度所需间隔，例如优选为反应容器总高度的15 %以下。应子说明，在温育反应液期间，上层加热块的温度以在能够确保利用下层加热块按照温度曲线进行温育的范围内维持成比下层加热块的温度高的方式进行设定即可。而且，未必需要根据下层加热块的温度曲线逐次改变温度。上层加热块的温度设定为比下层加热块的温度高;TC以上，优选为高5°C以上。例如可例示如下装置下层加热块的温度为 40 100°C的范围时，上层加热块维持在60 120°C，优选在105 120°C，而在下层加热块的温度为40°C以下时，上层加热块的温度维持在45 60°C。通常，上层加热块的温度上限为115 120°C。在使用具备上述构成的加热块的装置的反应液温育中，即使在温育温度达到高温 (例如70°C以上)时，也可维持反应容器上部的温度高于反应容器中的反应液的温度，因此反应液中的水分或其他成分不会在反应容器上部凝结。因而，防止反应液中的成分浓度变得超出起因于所需反应的浓度，再现性良好地发生反应。在本发明的装置中，用经温度控制的上层加热块覆盖下层加热块，因此可减轻因周围温度所致的下层加热块温度下降，使下层加热块整体的温度均勻，抑制起因于加热块位置不同(例如中心部分与周围部分间的位置的不同)的温度不均。因而，能够防止因加热块上的反应位置不同所致的反应效率波动。本发明的装置中未必需要以往的温度循环装置中所具备的、具有用于覆盖反应容器上面而进行加热的温度机构的罩。但是，可以具备用于防止反应容器帽脱落、反应容器封口剥离的罩。进而，以强化或者补充上层加热块在本发明中发挥的功能为目的，该罩可以具备用于将其温度维持在与上层加热块的温度相同程度的温度机构及其控制机构。另外，可以利用罩将保持于槽内的反应容器挤压于下方而提高反应容器下部与下层加热块的密合性，以使得下层加热块的热易于传递至反应容器。在为具备光学地检测来自反应液的信号 (例如荧光)的检测装置(例如荧光分光光度计)的装置的情况下，例如使用透光性罩、设置有用于使信号通过的开口部的罩即可。通常，本发明的装置可制成将上述各构成要素容纳于外壳内的装置。该装置具备前述加热块、温度控制机构，除此以外，可任意地具有用于与计算机或者外部计算机连接的接口、用于输入应执行的温度曲线的输入机构(例如键盘)、显示温度曲线及其执行状况的显示装置(例如液晶显示器)。进而，可以装载用于监视反应液发出的荧光等信号的光学装置(玻璃纤维、CCD照相机、透镜、滤光器等)。本发明的装置可防止在反应液温育时在容纳反应液的反应容器的上部、尤其是帽、封口内面侧的结露，因此不会因结露而阻碍来自反应液的信号的检测，易于检测信号。 艮口，本发明的装置在具备光学地经时检测反应容器中的反应进行、尤其是从反应容器上方进行检测的检测机构的情况下是有用的。在使用本发明的装置时，反应液中的水分、其他成分在反应容器内不发生凝结。另夕卜，还防止因设置反应容器的位置不同所致的温度不均，因此，能够再现性良好地实施PCR、 其他酶反应。
图1表示本发明装置的一种实施方式的斜视图。图2为表示本发明装置的上层加热块的构成的图，图2A为平面图，图2B为正面图。图3为表示本发明装置的下层加热块的构成的正面图。图4为表示在本发明装置中上层加热块与下层加热块的构成的图。图5为表示在本发明装置中将反应容器容纳且保持于由上层加热块和下层加热块构成的加热块中的状态的截面图。图6为表示在本发明装置中利用上层加热块与下层加热块保持反应容器时在两层间设置空间时的构成的图。图7为表示在本发明装置中利用上层加热块与下层加热块保持反应容器的状态的图，图7A表示使两层接触时的构成，图7B表示在两层间设置绝热材料时的构成。图8为表示在本发明装置中利用上层加热块与下层加热块保持反应容器的其他构成的图。图9为表示在反应性确认实验中使用的各装置的构成的图。图10为表示在反应性确认实验中使用的96孔板的反应位置的图。
图11为利用在反应性确认实验中所用各装置的PCR反应后的电泳照片。
具体实施例方式以下参照附图对本发明所述的温度循环装置的详细构成进行说明。应予说明，本发明并不仅限于以下实施例的范围。如图1所示，本申请发明所述的温度循环装置具备用于加热反应容器4的加热块 1。为了将反应容器4进行容纳、保持，在加热块1中形成多个槽10。本实施例中的加热块 1为8行X 12列的96孔用加热块。该加热块1由上层加热块2与下层加热块3这2层构成。如图2所示，上层加热块2形成有构成加热块1的槽10的一部分的贯通孔20。如图2B所示，贯通孔20上下贯通上层加热块2，形成与反应容器4的上部外周侧面的形状对应的形状，反应容器4可插入。该上层加热块2具备用于改变和维持上层加热块2的温度的加热器21、及用于观测上层加热块2的温度的温度传感器22。加热器21和温度传感器22设置于适于对上层加热块2进行温度控制的位置。在本实施例中，加热器21分别设置于上层加热块2的上面宽度方向的两端。而且，温度传感器22设置于上层加热块2的上面长度方向的一端。应予说明，加热器21和/或温度传感器22可以不配置于上层加热块2的上面，而设置于上层加热块2的侧面。另外，可以在上层加热块2中形成用于容纳加热器21和/或温度传感器22 的容纳凹部(未图示)，将这些21、22容纳于容纳凹部中而设置于上层加热块2内部。加热器21和温度传感器22与控制部分9连接。由此，能够将上层加热块2的温度控制成所需温度，使其经时地改变。进而，为了在下层加热块3上进行安装和定位，在上层加热块2的四角形成贯通上下的定位孔23。如图3所示，下层加热块3形成有构成加热块1的槽10的一部分的凹部30。将凹部30形成与反应容器4的下部形状对应的形状。下层加热块3具备用于改变和维持下层加热块3的温度的珀耳帖元件31、及用于观测下层加热块3的温度的温度传感器32。将珀耳帖元件31配置于下层加热块3的下面， 将温度传感器32埋入配置于下层加热块3的中心部分。与上层加热块2的加热器21和温度传感器22相同，下层加热块3的珀耳帖元件 31和温度传感器32与控制部分9连接。由此，能够控制下层加热块3的温度，使其经时地改变。本发明的温度循环装置利用上述构成分别独立地控制上层加热块2的温度与下层加热块3的温度。进而，下层加热块3具备用于定位上层加热块2的定位轴33。轴33设置于下层加热块3上面的四角。在将上层加热块2安装于下层加热块3时，在各轴33的下端配置有用于在两层之间设置空间的隔板6。如图4所示，以使各定位轴33嵌入各定位孔23的方式将上层加热块2配置在下层加热块3的上方，从而将上层加热块2安装到下层加热块3上。由此，进行与下层加热块 3相对的上层加热块2的定位。S卩，如图5所示，在形成于下层加热块3的各凹部30的正上方配置有对应的上层加热块2的贯通孔20，以使它们成为同一垂直线状的方式定位，利用贯通孔20和凹部30构成用于保持反应容器4的槽10。此时，由于隔板6介于上层加热块 2与下层加热块3之间，所以在两层2、3间设置有空间7。这样，如图1所示，利用上层加热块2与下层加热块3构成加热块1，容纳反应液5的反应容器4被容纳于槽10中。图6表示容纳反应液5且带有帽40的反应容器4被容纳且保持在如上所述构成的加热块1的槽10中的状态。若将反应容器4容纳于槽10中，则反应容器4的下部被嵌入于下层加热块3的凹部30而与其密合。而且，反应容器4的上部外周侧面与上层加热块 2的贯通孔20密合。反应容器4的帽40未插入贯通孔20，而是位于上层加热块2的上方。反应容器4内的反应液5位于温育反应液5的下层加热块3内。此时，反应液5 的液面50优选位于与下层加热块3的上面相同的位置，或者如图6所示位于低于下层加热块3的上面的位置。两层2、3间的空间7的高度只要能够阻碍两层2、3间的热传导，确保下层加热块3 按照温度曲线进行温度控制，而且确保温育时防止反应容器4的两层2、3间的部位处的凝结即可。另外，如图7A所示，在上层加热块2的下面和/或下层加热块3的上面为了阻碍热传导而施加特氟隆等的涂层时，可以在两层2、3间不设置空间7而使两层2、3接触。另夕卜，在上层加热块2不阻碍利用下层加热块3按照温度曲线进行反应液5的温育时，可以不施加涂层地使上层加热块2与下层加热块3接触而构成加热块1。另外，如图7B所示，为了在两层2、3间阻碍热传导，可以设置绝热材料8。另外，如图8A、8B、8C所示，可以为基本到达其外周侧面的上端地将反应容器4容纳于加热块1中的构成。如上所述，温度循环装置在利用加热块1保持反应容器4的状态下进行反应容器 4内的反应液5的温育。具体而言，温度循环装置按照输入控制部分的温度曲线控制下层加热块3的温度，利用下层加热块3加热反应容器4的下部整体，进行反应液5的温育。而且，温度循环装置通过在下层加热块3温育反应液5期间，控制上层加热块2的温度，维持在高于下层加热块3的温度，从而加热反应容器4的上部外周侧面，防止在反应容器4内来自反应液5的凝结。例如，在用本装置通过PCR扩增核酸时，将下层加热块3的温度在热变性阶段设定为95°C下30秒、在退火阶段设定为55°C下30秒、在延伸反应的阶段设定为72°C下1分钟。 此时，将上层加热块2的温度设定为高于下层加热块3的温度上限值(即95°C )的一定温度，例如以维持于105°C的方式进行设定。另外，可以在上层加热块2设置珀耳帖元件而代替加热器21，根据下层加热块3的温度变化，使上层加热块2的温度逐次变化。例如，在下层加热块3的温度设定与上述相同时，将上层加热块2的温度在热变性阶段设为105°C下30秒、在退火阶段设为65°C下30秒、 在延伸反应阶段设为82°C下1分钟。这样，可以为虽然根据下层加热块3的温度变化而使上层加热块2的温度逐次地变化，但是一直维持在比下层加热块3温度高的温度的构成。[反应性确认实验]为了确认本发明的装置的反应性，使用的是将上层加热块2设置于图91 IV所示位置的构成的装置。应予说明，在图9中，I表示本发明的上述实施例中的如图6所示的装置，II表示使上层加热块2位于反应容器最上部且在上层加热块2与下层加热块3之间设置高度为反应容器4总高度的30%的空间7的装置，III表示上层加热块2未保持反应容器4地配置于反应容器4的帽40上的装置，IV表示未使用上层加热块2的装置。各装置扩增效率的确认通过以下记载的以λ DNA(TAKARA BIO公司制)为模板的扩增链长为81Λρ的PCR扩增反应而进行。使用TaKaRa Taq Hot Start Version(TAKARA BIO 公司制)，以操作说明书中记载的常规PCR反应液量的1/2量(总反应液量25 μ L)进行反应。作为模板，使用2.5ng/ μ L ADNA 0. 5yL，使用IOpmol/μ L浓度的引物F(序列号1)和IOpmol/μ L浓度的引物 R(序列号2)各0.5 μ L。将上述制备的反应液5各25 μ L分注于0.2mL的反应管(0. 2mL 8-strip tube, Individuals Flat caps, TAKARA BIO 公司制)中。然后，将分注有反应液 5的反应管4放置于各装置中，按照温度设定进行反应，所述温度设定为将下层加热块3的温度设定为94°C并加热1分钟，然后将在94°C下30秒-在65°C下10分钟的循环重复30 次。上层加热块2的温度在107°C下进行。应予说明，图10表示反应中所用96孔板的示意图。图中，以斜线所示的地方表示反应位置。在反应结束后，分别抽出图10所述的第1列、第6列和第12列的第A行 第H行的反应液，将各反应液3μ L应用于琼脂糖凝胶(AgarOSeL03 “TAKARA”、TAKARA BIO公司制)/ΤΑΕ缓冲液中。使用λ -Hind III消化产物(TAKARA BIO公司制)作为标记物，利用Mupid-2plus (ADVANCE公司制)进行电泳。其结果如图11所示。即，图11为表示根据各装置在96孔板内的位置的PCR反应性的电泳照片。图中，例如第1列的第A行的装置I IV的反应后的结果为记载为A-I的地方的下侧装置编号处的电泳照片。另外，M表示标记物的电泳照片。由图11可知，在装置II中的第1列的第D H行与第6列的第G行和第H行、在装置III中的第12列的第F H行、在装置IV中的全部行列中，仅确认略微扩增或完全未扩增。认为这些结果的原因为无法防止反应容器4内的凝结或者在下层加热块3中产生温度不均。与此相对，本发明的装置I在96孔板内的全部位置均得到良好的扩增结果。认为这是由于上层加热块2防止来自反应容器内的反应液的凝结，另外抑制下层加热块3的温度不均的缘故。即，在本发明的装置I中，上层加热块2防止将反应液5的浓度变成超出起因于所需反应的浓度，防止因反应液的浓度变化所致的核酸扩增效率降低。进而，上层加热块2防止因加热块1上的反应位置不同所致的温度不均，防止因反应位置不同所致的核酸扩增效率降低。如上所述，可知在本发明的温度循环装置中，能够在96孔板内进行具有稳定再现性的PCR。本发明的温度循环装置除了核酸的扩增以外，还可适用于反转录反应等酶反应。产业上的可利用性根据本发明，提供了一种温度循环装置，其能够不使反应液中的水分、其他成分在反应容器内发生凝结，另外还能够防止因设置反应容器位置所致的温度不均。本发明的装置非常适于用以实施在分子生物学研究领域等中使用的生物样品反应，尤其是核酸扩增。符号说明1、加热块2、上层加热块20、贯通孔21、加热器
22、温度传感器23、定位孔3、下层加热块30、凹部31、珀耳帖元件32、温度传感器33、定位轴4、反应容器40、帽5、反应液50、液面6、隔板7、空间8、绝热材料9、控制部分另外的序列表文本序列号1 用于扩增YDNA的引物F。序列号2 用于扩增Y DNA的引物R。
权利要求
1.一种温度循环装置，其特征在于，用于温育反应液，(1)具备用于将容纳所述反应液的反应容器进行保持并加热的加热块，所述加热块由下层加热块与上层加热块这两层构成；进而，(2)具备温度控制机构，该温度控制机构分别独立地控制所述下层加热块的温度与所述上层加热块的温度，在温育所述反应液时将所述上层加热块的温度维持成比所述下层加热块的温度高。
2.根据权利要求1所述的温度循环装置，其特征在于，所述反应液含有核酸，所述下层加热块温育所述反应液，所述上层加热块防止所述核酸的扩增效率的降低。
3.根据权利要求1或2所述的温度循环装置，其特征在于，具备热传导防止机构，该热传导防止机构用于阻碍所述下层加热块与所述上层加热块之间的热传导。
4.根据权利要求3所述的温度循环装置，其特征在于，所述热传导防止机构为设置于所述下层加热块与所述上层加热块之间的空间。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的温度循环装置，其特征在于，所述温度控制机构具备用于改变和维持所述下层加热块的温度的第一温度机构、及用于改变和维持所述上层加热块的温度的第二温度机构；所述第一温度机构设置于所述下层加热块的下侧，所述第二温度机构设置于所述下层加热块的上侧。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的温度循环装置，其特征在于，所述温度控制机构将所述上层加热块的温度维持成比所述下层加热块的温度高3°C以上。
全文摘要
本发明提供一种温度循环装置，其用以实施在分子生物学研究领域等中使用的生物样品反应，尤其是核酸扩增。其用于温育反应液5，(1)具备用于将容纳反应液5的反应容器4进行保持并加热的加热块1，加热块1由下层加热块3与上层加热块2这两层构成；进而，(2)具备温度控制机构，该温度控制机构分别独立地控制下层加热块3的温度与上层加热块2的温度，在温育反应液5时将上层加热块2的温度维持成比下层加热块3的温度高。由此，反应液5中的水分、其他成分在反应容器4内不发生凝结，进而，不产生因反应容器4的设置位置所致的温度不均，因此，能够再现性良好地实施PCR、其他酶反应。
文档编号C12M1/00GK102471746SQ201080036270
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月18日 优先权日2009年8月20日
发明者伊豆博幸, 向井博之, 武田理, 荒井健树 申请人:宝生物工程有限公司