专利名称：活化的nk细胞的经保存的组合物及其使用方法
技术领域：
本发明一般性地涉及显示出持久活化状态的经保存的天然杀伤细胞群、包含此类经活化的NK细胞的药物组合物，及它们的使用方法。
背景技术：
癌症的过继免疫疗法考虑的是通过用特定的肿瘤细胞进行疫苗接种和/或施用更为一般性的免疫刺激物而直接刺激宿主对肿瘤的免疫应答。然而，数种因素可妨碍充分的抗肿瘤免疫应答，这包括缺乏合适的肿瘤相关抗原，有缺陷的抗原加工，由肿瘤产生免疫抑制性因子等。过继免疫疗法通过直接向携带肿瘤的宿主施用有免疫活性的细胞或抗体而试图克服肿瘤介导的宿主免疫抑制。在过继性细胞疗法中，从携带肿瘤的宿主中分离免疫效应子细胞并且在再输注之前离体使其活化和/或扩增。例如，用重组的白介素_2(IL-2)离体活化了自体NK细胞以提高CD56+天然杀伤(NK)细胞的细胞毒性(Lanier et al. (1985) Journal of Immunology 134,794-801)并且产生经淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞，其能够在体外杀伤新鲜的自体和同种异基因性人肿瘤细胞(Rayner，et al. (1985)Cancer 55， 1327-1333)。施用LAK细胞(通常与全身性IL-2输注相组合)已经作为用于人类癌症的过继免疫疗法经过了反复地研究。然而，遗憾的是这些LAK细胞疗法在临床中仅遇到了有限的成功。首先必须从患者中获得自体细胞并且使其成功地离体扩增至足以用于治疗的细胞计数。此外，必须使 LAK细胞持续地暴露于IL-2，以维持其活化的状态并且因此，有效的临床方案通常要求全身性施用高剂量的IL-2与细胞疗法相联合。虽然在一些患者中获得了一些抗肿瘤效果， 由共施用IL-2引起的毒性是显著的问题(Vieweg et al. (1995)Cancer Investigation 13 :193-201),这包括发烧、发冷、全身乏力、关节痛、肌痛、和来自液潴的增重(Lotze，et al. (1985)J. Immunology 135 :2865-2875)。LAK细胞疗法的成功实施还被不能在实时个体化方案之外采用活化的LAK细胞所妨碍。特别地，需要特殊的设备和专门的实验室来分离、扩增和重输注每个患者的细胞。此外，LAK细胞的活性在去除IL-2后12小时内被显著损害，因此，一旦被活化，LAK细胞必须在丧失活化状态之前被迅速输注。重要地，LAK细胞的保存使得需要通过以IL-2进行再刺激而制备用于施用的LAK细胞，来重建活化的状态(Kawai et al. (1988)Transfusion 28: 531-5 ；Schiltz et al. (1998) J. Immunother. 20 :377-86)。因此，施用 LAK细胞用于癌症的免疫疗法具有有限的临床影响和认可，需要昂贵的、个体化的和劳动密集性的分离及扩增方法，以及实时施用来避免丧失活化。
因此，所需的是具有更可靠且持久的活性的经活化的免疫效应子细胞群，其可更好地促进细胞疗法与供体护理的协调。理想地，尽管保存，这些细胞仍可维持其活化状态而不持续暴露于活化剂和/或共施用不希望的和/或临床毒性试剂，从而使得更为一般性的临床应用可以是可能的。发明概述本发明提供经保存的、具有显著的抗肿瘤活性的活化的NK细胞群，尽管有之前的保存，其仍显示出令人惊讶地持久的活化状态，并且甚至在不存在活化剂时(例如，在结束与活化剂的接触后和/或不持续暴露于活化剂或以其再活化)亦如此。重要地且与LAK细胞不同地，本发明的经活化的NK细胞可在保存后直接被施用于患者而无需再活化并且也无需共施用活化剂本身，从而为医师提供了可持续的且即用的细胞治疗产品，其还避免了伴随着共施用活化剂的潜在毒性。此外，可跨越同种异基因性障碍而有效地采用本发明的细胞群，并且重要地，过继性转移后，本发明的细胞群能够将杀肿瘤能力转移至内源性宿主NK细胞，从而在体内产生 NK细胞活化级联。因此，本申请所提供的经活化的NK细胞群可被更一般性和更实际地用于主动和被动免疫疗法设置中，而无需个体化的治疗方案和/或实时施用方案。因此，一方面，本发明提供了经活化的NK细胞的药物组合物。所述组合物可适于直接施用于患者。所述组合物可基本上不含活化剂。经活化的NK细胞可以是之前经保存的。在使用中，经活化的NK细胞可在任意保存后继而被制备用于施用而不经再活化或与活化剂相接触。在实施方式中，所述组合物包含之前经保存的活化的NK细胞、适于直接施用并且不含活化剂。所述组合物可以是(并且通常是)用于施用而不共施用(无论同时、 分别还是顺次)活化剂。在其它方面，提供了⑴经活化的NK细胞群用于治疗性应用(例如用于治疗癌症)，和(ii)经活化的NK细胞群用于制备药物的用途，所述药物例如用于治疗癌症。所述细胞群可以是经保存的。所述细胞群可以不含活化剂。所述细胞群可包括药学上可接受的介质或载体。所述细胞群可以被重构为药物组合物，但是由保存状态移除后， 其按照希望准备好用于施用(例如准备好用于输注)。因此，本申请中对于本发明的药物组合物的描述同样适用于本发明的细胞群，例如可通过用CD15+LAK-抗性肿瘤细胞进行活化而获得NK细胞。优选地，与静止的NK细胞相比，所述NK细胞过表达⑶69和/或⑶25， 并且尽管不存在活化剂其仍显示出持久和延长的抗肿瘤活性。因此，在一个实施方式中，之前经活化的NK细胞是CD69+和/或CD25+。在其它实施方式中，预期用于本申请中的经活化的NK细胞在活化后也获得⑶15的表达并丧失⑶16的表达。因此，本发明的NK细胞更优选地也是⑶15+和⑶16 的。这些⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+NK细胞将通常包含至少约 50%的所述细胞群，更优选地至少约60、70或80%的所述细胞群，且最优选地至少约90、95 或98%的所述细胞群。在一个实施方式中，所公开的药物组合物包含对于患者为自体的、经活化的NK细胞。在另一个实施方式中，药物组合物包含对于患者是自体的和对于患者是同种异基因性的经活化的NK细胞。在另一个实施方式中，药物组合物包含对于患者是同种异基因性的经活化的NK细胞。在另一个实施方式中，药物组合物包含对于彼此是同种异基因性的经活化的NK细胞。可有利地与本发明联合使用的合适的保存技术包括细胞培养、冷藏和冷冻保存。在优选的实施方式中，经活化的NK细胞经冷冻保存(例如，在氮气中)至少约1天、例如至少1周、例如至少约4周、例如至少约3个月，例如约6个月，例如至少约一年，例如至少约五年等。在一个实施方式中，经活化的NK细胞在包含DMSO和HAS的培养基中以如下的细胞密度被保存在冷冻细胞袋中约IxlO6至切107细胞/mL，更优选地约IxlO7至hlO7细胞/mL。在一个实施方式中，通过融化而制备将经冷冻保存的NK细胞用于施用。在一个实施方式中，不存在活化剂而融化经活化的NK细胞，并在融化后将其立即施用。因此，本发明包括用于制造可输注制剂形式的即用药物的方法，所述制剂不含或基本上不含用于活化NK 细胞的试剂，所述方法包括下述或由下述组成融化不含或基本上不含活化剂的、冷冻保存的活化NK细胞，所述制剂用于治疗癌症而不共施用(无论同时、分别还是顺次)活化剂。此实施方式中的可输注制剂准备好立即使用而不用任何进一步的加工。在一个实施方式中，通过在保存前用⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞孵育而活化NK细胞。在一个实施方式中，所述⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞选自CTV-I，MV4-11，SEM，其亚系及它们的组合。在一个实施方式中，⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞包括CTV-I细胞。在另一个实施方式中，⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞包括MV4-11细胞。在另一个实施方式中，⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞包括SEM细胞。本申请还提供了用于制备和施用本发明的组合物的方法，所述方法包括1)获得自体和/或同种异基因性NK细胞，幻用包含CD15+LAK-抗性肿瘤细胞的活化剂激活所述NK 细胞，幻不存在活化剂而保存经活化的NK细胞，4)保存后制备经活化的NK细胞用于施用， 例如，冷冻保存之后在基本上不含活化剂的药学上可接受的载体中融化，以及幻不共施用 (同时或顺次地)活化剂本身而向有需要的患者施用经活化的NK细胞。在优选的实施方式中，至少约50 %，更优选至少约60，70或80 %，以及最优选至少约90，95或98 %的活化的NK细胞被表征为⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+。在一个实施方式中，所采用的保存技术是冷冻保存，进行或不进行重悬，而在融化后立即将经活化的NK细胞施用给患者。在一个实施方式中，经活化的NK细胞对于患者是自体。在另一个实施方式中，经活化的NK细胞包含对于患者为自体的NK细胞和对于患者为同种异基因性的NK细胞。在另一个实施方式中，经活化的NK细胞对于患者为同种异基因性的。在另一个实施方式中， 经活化的NK细胞对于彼此是同种异基因性的。还提供了用于刺激有需要的患者(例如携带肿瘤的患者)中内源性NK细胞活性(例如，内源性抗肿瘤活性)的方法，所述方法包括向所述患者施用之前经活化以过表达⑶69和/或⑶25 (相比于静止的NK细胞)且优选地降低⑶16的表达和获得⑶15的表达的外源NK细胞，其中所述NK细胞在不存在活化剂时显示出持久的活性。如本申请中所详述的，本发明的组合物的⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+活化NK细胞可被直接施用给有需要的患者而不反复或持续与活化剂相接触，并且此外也不向患者共施用活化剂，如用LAK细胞的情形。在一个实施方式中，通过用⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞(例如，CTV-I肿瘤细胞， MV4-11肿瘤细胞，SEM肿瘤细胞等)接触NK细胞而活化外源NK细胞。在优选的实施方式中，⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞为CTV-I细胞。在本申请中所公开的一种方法中，细胞群包含外源NK细胞，其对于患者是自体的。在另一种方法中，细胞群包含对于患者是自体的外源NK细胞以及对于患者为同种异基因性的外源NK细胞。在另一种方法中，细胞群包含外源NK细胞，其对于彼此是同种异基因性的。在另一种方法中，细胞群包含对于患者是同种异基因性的外源NK细胞和对于彼此是同种异基因性的NK细胞。在一个实施方式中，细胞群在活化后和向所述患者施用前被保存。在优选的实施方式中，细胞群是冷冻保存的。在示例性的实施方式中，所述方法还包括在施用步骤之前融化所述细胞群的步骤。重要地，如本申请中所表明的，本发明不要求保存之后和向患者施用之前再活化，并且也不要求共施用活化剂。附图简述
图1显示了⑶15+NK-抗性肿瘤细胞引发静止的NK细胞裂解NK-抗性肿瘤细胞。 图IA显示了由下述静止的NK细胞对NK-抗性RAJI细胞的裂解(％特异性裂解；y轴)， 所述静止的NK细胞是未经刺激的(NK ;x-轴)，以三种NK抗性阳性⑶15+白血病细胞 (CTV-1 (NK+CTV1 ；χ 轴)，MV-411 (NK+MV411 ；χ 轴)或 SEM(NK+SEM ；χ 轴))之一孵育的 NK 细胞，或者以两种 CD15_ve 肿瘤细胞(M0LT-16(NK+M0LT16 ；χ 轴)或 PF-382 (NK+PF-382))之一孵育的NK细胞。图IB显示了由静止的NK细胞(+NK ；χ轴)或以CTV-I细胞(+NK/CTV-1 ； χ轴)引发的NK细胞对NK抗性RAJI细胞(RAJI ；χ轴)、ΝΚ抗性骨髓瘤(RPMI8226 ；χ轴)、 浆细胞瘤(ARH77 ；χ轴)或上皮肿瘤细胞系(DU145 ；χ轴)的裂解(％特异性裂解；y轴)。图2显示了通过抗⑶15阻碍NK细胞引发。图2A显示出当单独地(NK ;x轴)或在不存在(NK/CTV-1 ；χ轴)或存在下述抗体时以CTV-I细胞过夜孵育来自健康志愿者供体(n = 4)的静止的人NK细胞后，表达⑶25(%⑶25+细胞-黑柱；y轴)或⑶69(%⑶69+ 细胞-白柱；y轴)的人NK细胞的百分比抗⑶Ila抗体(抗⑶lla;x轴)，抗CD18抗体 (抗⑶18 ；χ轴)，抗⑶15抗体(抗⑶15 ；χ轴)，抗⑶38抗体(抗⑶38 ；χ轴)，抗⑶48抗体(抗CD48 ；χ轴)或抗CD58抗体(抗CD58 ；χ轴)。棒(bar)代表对于每个样品三次重复的平均百分比士 SD。图2B显示了由经单独孵育20h(NK;x轴)或以下列孵育的来自正常志愿者供体(n-5)的NK细胞对NK抗性RAJI细胞的裂解(％裂解；y轴)未处理的CTV-I 细胞(NK/CTV-1 ；χ轴)，在饱和浓度下以饱和浓度的抗⑶15抗体(克隆MEM 158-Serotek UK Ltd)处理的CTV-I细胞(NK/CTV-1预处理的⑶15 ；χ轴)；以饱和浓度的抗⑶49f (克隆 4F10-Serotek UK Ltd)预处理的CTV-I细胞(NK/CTV-1预处理的CD49f ；χ轴)；或以饱和浓度的抗CD56 (克隆NCAM 16. 2-BDIS，UK)预处理的CTV-I细胞(NK/CTV-1预处理的CD56 ； χ轴)。棒代表对于每个样品三次重复的平均百分比士SD。图3显示了用FUT4转染NK抗性RAJI细胞使得细胞易受NK介导的裂解。图3中的棒代表静止的NK细胞对下列的平均百分比特异性裂解士SD(%特异性裂解；y轴)未修饰的RAJI细胞(RAJI ；χ轴)，CD15+RAJI细胞(RAJI T15 ；χ轴)；用抗CD15抗体预处理的 CD15+RAJI 细胞(RAJI T15+ 抗 CD15 ；χ 轴)；用抗 CD56 抗体预处理的 CD15+RAJI 细胞(RAJI T15+抗CD56)，K562细胞￠56 ；以及用抗CD15抗体预处理的K562细胞(K562+抗CD15)。 对于所有的实验(n = 3)，效应子靶的比率均为5:1。图4显示的是肿瘤介导的NK引发与丧失⑶16的表面表达相关。图4显示了不存在(NK ο/η ；χ轴)或存在CTV-I细胞(NK/CTV-1)时以2 1的刺激因子响应子比率过夜孵育后，分离自9名健康患者的、表达⑶16 ⑶16阳性；y轴)的NK细胞的百分比。每个方形或三角形代表NK细胞从其中分离的9名健康供体之一。不存在肿瘤刺激时，CD16+NK 细胞的比例保持稳定。相反，CTV-I介导的引发导致显著丧失⑶16表达(ρ <0.01)。
图5显示了用CTV-I刺激之后的细胞内磷酸化。图5A显示了具有磷酸化的 ⑶3 ζ (⑶3 zeta PE ；χ轴)的NK细胞数目(事件；y轴)，这是如用RAJI细胞(实心的直方图)或CTV-I细胞(非实心的直方图)刺激静止的NK细胞10分钟然后固定之后，通过流式细胞计数分析所测定的。图5B显示了如通过流式细胞计数分析(n = 3)所测定的、以 2 1的刺激因子响应子比率用CTV-I细胞刺激后，具有磷酸化的LAT(pLAT;D)或磷酸化的ZAP70(pZAP70 ；▲)的人NK细胞在各时间点(分钟；χ轴)的平均百分比士SD(%阳性；y轴)。图5C显示了在用CTV-I细胞刺激静止的NK细胞0分钟，5分钟，10分钟或20 分钟后，具有磷酸化的STAT5 (pSTAT5 ；χ轴)的NK细胞的数目(y轴)。图5C为3个实验的代表性图表。图6表明了 CTV-I或IL-2刺激之后NK的活化。图6A显示出在不存在任何经活化的试剂(NK ο/η ；χ轴)时、以1 2的比率存在CTV-I细胞(NK/CTV-1 ；χ轴)时、或存在IL-2 (100 . u. /mL) (LAK ；χ轴)时过夜孵育4 后，对于CD25的表达为阳性的NK细胞的百分比(％阳性；y轴)。对于表面表达的Cd69和细胞内IFN-Y标记平行的培养物。图6 和6G是直方图，其显示在不存在任何活化剂(图6B和6E)、存在CTV-I细胞(图6C和6F) 或存在IL-2(图6D和图6G)时过夜孵育后，表达细胞表面⑶69(图6B，6C和6D)或细胞内IFN-Y (图6E，6F和6G)的NK细胞数目(y轴)。每个直方图中的垂直棒代表特定同种型-匹配的阴性对照的最大荧光。图7显示出甚至在冷冻保存之后，经CTV-I引发的NK细胞仍保持其经引发的状态。图7A是在免疫磁性分选NK细胞之前，用CTV-I细胞裂解物刺激了 20个小时并用抗 ⑶56-FITC和抗⑶3-APC抗体孵育的外周血单核细胞的点图。图7B是在免疫磁性分选NK 细胞之后，用CTV-I细胞裂解物刺激了 20个小时、并用抗⑶56-FITC和抗⑶3-APC抗体孵育的外周血单核细胞的点图。在每个点图中，在标示为R2的区域中发现了 NK细胞，在标示为R3的区域中发现了 NKT细胞，在标示为R4的区域中发现了 CTV-I裂解物，以及在标示为 R5的区域中发现了 T细胞。图7C显示了用CTV-I裂解物新鲜引发的NK细胞(新鲜；χ轴) 和之前用CTV-I裂解物引发、被冷冻保存了 14天、并在用RAJI细胞孵育之前融化的NK细胞(融化后；χ轴)对RAJI细胞的裂解(％特异性裂解；y轴)。发明详述本发明涉及下列出乎意料的发现与LAK细胞相反，本申请所提供的活化的NK细胞群甚至在不存在活化剂时仍显示出持久的活性，并且重要地，尽管有延长时间段的中间的保存，其仍保留抗肿瘤活性。本申请中所描述的之前经活化的NK细胞的经保存的细胞群可跨越同种异基因性障碍而被有效地使用并且，同样是令人惊讶地，其能够在过继性转移到携带肿瘤的宿主中后将杀肿瘤能力转移至内源性宿主NK细胞，从而在体内产生NK活化级联。因此，可在主动和被动免疫疗法设置中均更为一般性和更为实际地采用本申请所提供的活化的NK细胞群，而无需个体化的治疗方案、实时施用方案和/或共施用否则不希望的和/或有毒的活化剂。根据本发明，包含以⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞活化的NK细胞的、之前经保存的细胞群显示出持久的和延长的活性，甚至在不存在活化剂而保存后、以及保存后没有用活化剂再活化或与活化剂相接触时亦是如此。因此，可采用例如细胞培养、冷藏、冷冻保存等保存方法而不显著丧失活性且经活化的细胞可在保存后被立即施用于患者，例如制备所述细胞用于施用不需要包括使细胞暴露于活化剂而使细胞为治疗性的，并且经活化的细胞无需联合活化剂本身而被共施用。本申请中所公开的是包含在保存后被制备用于施用的、经活化的NK细胞的药物组合物，以及相应的使用方法。如本申请中所使用的，“之前经活化的”是指在接触和/或暴露于(例如，以其孵育)活化剂(例如CD15+LAK-抗性肿瘤细胞，和优选地为CD15+LAK-抗性肿瘤细胞制备物)
> . 、r -如本申请中所使用的，“持久的”在NK细胞活化的情境中是指之前经活化的NK细胞在不持续或重复接触活化剂时，在延长的时间段中(例如至少约6-8小时、更优选地至少约10-12小时，仍然更优选地至少约12至14小时)维持裂解活性(例如抗肿瘤活性)的能力。天然杀伤(NK)细胞NK细胞是通过表达⑶56或⑶16和不存在T细胞受体(⑶幻而定义的外周血淋巴细胞的亚群。它们以MHC-不受限的方式不进行引发而识别和杀伤经转化的细胞系。NK细胞在同种异基因性或自体干细胞移植后许多月中代表外周血中主要的淋巴细胞，并且它们在这一时期中在对病原体的免疫性方面具有主要作用(Reittie et al (1989)Blood 73 :1351-1358 ；Lowdell et al (1998)Bone Marrow Transplant 21: 679-686)。NK细胞在移植、移植物-相对-宿主疾病、抗白血病活性和移植后感染中的作用被综述于 Lowdell Q003)Transfusion Medicine 13 :399-404 中。人NK细胞通过天然细胞毒性和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)介导肿瘤细胞和病毒感染的细胞的裂解。人NK被阳性和阴性细胞裂解信号控制。阴性(抑制性)信号是通过含有受体 ⑶94/NKG2A的C-凝集素结构域以及通过一些杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)转导的。通过抑制信号来调节NK裂解已知为“失去自我”假设，其中在靶细胞表面上表达的特定HLA-I类等位基因连接NK细胞上的抑制性受体。肿瘤细胞和一些经病毒感染的细胞(例如CMV)上 HLA分子的下调使这一抑制下降到靶标阈值之下，并且如果靶细胞也携带NK引发和激活分子，则靶细胞可变得易受NK细胞介导的裂解。抑制性受体分为两组，即Ig超家族的那些(称为杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)) 和凝集素家族的那些(NKG2)，其在细胞表面与CD94形成二聚体。IQR具有2-结构域或3-结构域细胞外结构并结合HLA-A，HLA-B或HLA-C。NKG2/CD94复合体连接HLA-E。抑制性KIR具有最多4个细胞内结构域，其含有ITIM并且被最好地表征的是 KIR2DLUKIR2DL2 和 KIR2DL3，其已知结合 HLA-C 分子。KIR2DL2 和 KIR2DL3 结合组 IHLA-C 等位基因而KIR2DL1结合组2等位基因。某些白血病/淋巴瘤细胞表达组1和组2HLA-C 等位基因并且已知对于NK介导的细胞裂解有抗性。关于阳性活化信号，ADCC被认为是通过⑶16介导的，并且已鉴别了许多促成天然细胞毒性的触发受体，这包括 CD2，CD38，CD69，NKRP-I，CD40，B7-2, NK-TR, NKp46, NKp30 和NKp44。此外，数种具有短的胞质内尾部的MR分子也是刺激性的。这些KIR(KIR2DS1， KIR2DS2和KIR2DS4)已知结合HLA-C ；它们的细胞外结构域与它们的相关抑制性MR是相同的。活化性KIR缺乏ITIM却与DAP12相缔合，从而引起NK细胞活化。控制抑制性MR 相对于活化性KIR的表达的机制仍然未知。
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本发明的NK细胞可以是自体的或同种异基因性NK细胞。“自体”NK细胞是源自患者(例如带有肿瘤的宿主)的细胞。“同种异基因性”NK 细胞源自另一个、非遗传上相同的个体。如果NK细胞源自同卵双胞胎，则它们可被称为是 “同基因的”。供体NK细胞可以是HLA-IQR匹配的或不匹配的。当前的发明者显示了 NK细胞与靶肿瘤细胞之间的匹配程度是不重要的。活化剂本申请中所公开的是之前经活化的NK细胞的经保存的细胞群，其显示出持久的活性，即其在保存后或在不存在活化剂时保持活化的状态。因此，本领域技术人员将认可， 如本申请中所使用的，活化剂指任何下列试剂其激活NK细胞(例如，增加NK细胞的裂解活性)以过表达⑶69和/或⑶25 (与静止的NK细胞相比)，且更优选地还获得⑶15表达并丧失CD16表达。如本申请中所表明的，根据本发明活化的NK细胞在终止与活化剂的接触后(例如，在不存在活化剂的保存过程中)维持其活化状态。在本部分以及整个文件中，术语“活化”与术语“刺激”同义地使用。本发明还提供用于确定试剂是否是本申请中所公开的活化剂的方法，所述方法具有下列步骤(i)使所述试剂与NK细胞接触以活化所述NK细胞；(ii)保存经活化的NK细胞；(iii)使来自步骤(ii)的经活化的NK细胞与对由非活化的NK细胞的裂解有抗性的靶细胞接触；(iv)确定靶细胞是否被来自步骤(ii)的NK细胞所裂解；其中经活化的NK细胞在保存中或保存后的任何时间未与所述活化剂相接触或未暴露于所述活化剂(例如，在保存中和/或保存后保持基本上不含活化剂)。任选地，可以分析来自上面的步骤(i)或步骤(iv)的活化的NK细胞以确定CD69、 ⑶25、⑶16和⑶15的表达，其中合适的活化剂将产生这样的NK细胞其在活化后过表达 ⑶69和⑶25 (与静止的NK细胞相比)、丧失⑶16的表达并获得⑶15的表达。因此，技术人员可容易地判定以确立给定的试剂是否具有作为如本申请中所描述的活化剂的能力。如实施例中所描述的，某些肿瘤细胞(例如CD15+LAK-抗性肿瘤细胞)具有下述能力刺激NK细胞以增加其裂解肿瘤细胞的能力。已显示经刺激的NK细胞能够裂解“NK 抗性”肿瘤细胞(即对用未经刺激的NK细胞进行的裂解有抗性的肿瘤细胞)。此外，此类经刺激的NK细胞在不存在CD15+LAK-抗性肿瘤细胞时于保存后维持其活化的状态，并且因此，其无需在保存后通过随后与CD15+LAK-抗性肿瘤细胞接触而再活化。因此，在一个实施方式中，如本申请中所公开的活化剂为CD15+LAK-抗性肿瘤细胞。如本申请中所使用的，“⑶15”是指⑶2的配体，其在结构上与⑶15相关并且对于引发静止的NK细胞是关键的。如本申请中所使用的，“⑶15”也可指GeneID :2526的产物，其官方名称是FUT4，并且其也已知为ELFT，FCT3A, FUTIV和FUC-TIV。GeneID :2526的产物将岩藻糖转移至N-乙酰乳糖胺多糖以生成岩藻糖化的糖结构。其还催化非唾液酸化抗原Lewisx (CD15)的合成。因此，为“⑶15+”的细胞表达⑶2的配体。
肿瘤细胞系通常被LAK细胞杀伤。然而，LAK抗性肿瘤细胞显著地避免LAK细胞的裂解。LAK抗性肿瘤细胞的非限制性实例包括CTV-I细胞、MH13M细胞、OKM-M细胞、 MV4-11细胞、SEM细胞等。能够活化NK细胞从而使得所述NK细胞甚至在不存在活化肿瘤细胞时在保存之后仍保持其活化状态的CD15+LAK-抗性肿瘤细胞包括CTV-I细胞、MV4-11细胞、SEM细胞、其亚系或其组合。因此，在一个实施方式中，所述活化剂为CTV-I细胞。此细胞系是商业上可得的，例如来自德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)。在一个实施方式中，活化细胞是从CTV-I亚系获得的。在另一个实施方式中，所述活化剂为MV4-11细胞。此细胞系也是商业上可得的，例如来自美国典型培养物保藏中心(ATCC号CRL-9591) (Lange，et al. (1987) Blood 70 :192-199 ；Santoli，et al. (1987) J. Immunol. 139 :3348-3354) 在另一个实施方式中，活化剂为SEM细胞。这一细胞系也是商业上可得的，例如来自DSMZ (DSMZ No. ACC456) (Grei 1, et al. (1994)Br. J. Haemotol. 86 :275-83 ；Reichel, et al. (1998)Oncogene 17: 3035-44 ；Drexler，et al. (2004)Leukemia 18 :227-232)。还预期的是其它的肿瘤细胞也将具有活化NK细胞从而使得所述NK细胞在不存在 CD 15+LAK-抗性肿瘤细胞时在保存之后仍保持其活化状态的能力。本发明还提供用于确定肿瘤细胞制备物是否是如本申请中所公开的活化剂的方法，所述方法包括下列步骤(i)使所述肿瘤细胞制备物与NK细胞接触；(ii)储存所述NK细胞；(iii)使来自步骤(ii)的NK细胞与对由非活化的NK细胞的裂解有抗性的靶细胞接触；(iv)确定靶细胞是否被来自步骤(ii)的NK细胞所裂解；其中经活化的NK细胞在保存后的任何时间未与所述肿瘤细胞制备物相接触或未暴露于所述肿瘤细胞制备物(例如，在保存中和保存后保持基本上不含活化剂)。因此，技术人员有可能确立给定的肿瘤细胞制备物是否具有作为活化剂的能力并且就此活性筛选已知的肿瘤细胞。在一个实施方式中，所述活化肿瘤细胞制备物可以是肿瘤细胞系，例如可以由下列组成或包含下列完整的肿瘤细胞群，例如CTV-I细胞、SEM细胞、MV-411细胞或其组合， 优选地使其不可成活(例如通过固定或辐射)。在一个实施方式中，肿瘤细胞制备物可由肿瘤细胞裂解制备物组成或包含肿瘤细胞裂解制备物。例如，细胞裂解制备物可通过标准的固定技术(例如使用多聚甲醛)制成。 固定具有下述优势制备物被稳定化、具有长得多的“存架期”并且更易于储存。合适的细胞裂解制备物也可通过冷冻-融化的重复循环，与DNA酶处理相结合而制作。此类制备物可被认为具有增加的安全性，因为其降低了与朊病毒等相关的污染可能性。可在使用之前，通过标准的技术辐射⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞。裂解制备物与包含完整肿瘤细胞的制备物相比具有优势，因为其避免了将潜在的恶性肿瘤细胞转移至患者的风险。在一个实施方式中，活化肿瘤细胞制备物由CTV-I裂解物组成或包含CTV-I裂解物。CD15+LAK-抗性肿瘤细胞可以是或可包含源自肿瘤细胞的实体(例如蛋白质)。 ⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞可以，例如包含重组蛋白。所述蛋白可源自CTV-I细胞、MV4-11细胞、SEM细胞、其亚系、或它们的组合。可通过例如共培养(其中使用完整的肿瘤细胞)而使⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞与NK细胞制备物在一起。“活化时间”将取决于细胞制备物的性质和接触条件，但可通常为 12-24小时，也可为20小时。当前的发明人显示了用⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞(例如CTV-I细胞、MV4-11细胞、 SEM细胞、其组合、其亚系等)预孵育NK细胞引起NK细胞上⑶69的快速上调。他们还显示了(使用经标记的CD69)通过活化的NK细胞可裂解的肿瘤细胞表达CD69配体(CD69L)，但是这一表达不存在于未被裂解的细胞(例如B细胞)上。重组CD69的存在抑制活化的NK 细胞裂解肿瘤细胞的能力，可能是因为其阻碍了在肿瘤细胞上与CD69L的相互作用。与CTV-I接触后，除⑶69之外，IL-2受体⑶25也在NK细胞上被上调。相反，⑶25 与通过IL-2的NK活化相联合而被下调。因此，在一个实施方式中预期用于本申请中的活化剂也产生⑶69+和/或⑶25+的活化的NK细胞群。在其它实施方式中，与CTV-I接触引起CD15转移至活化的NK细胞(例如，获得 ⑶15的NK细胞)，以及活化后NK细胞上⑶16表达的减少。因此，在其它的实施方式中，预期用于本申请的活化剂也产生也为CD15+和/或CD16 的活化的NK细胞群。保存如本申请中所使用的，术语“保存”和“保存的”通常指使细胞组合物以可成活的形式持续保存，从而所述细胞组合物在所述保存后可被制备用于向受试者(例如人患者)施用。如本申请中所公开的，活化的NK细胞群通常在不存在活化剂时被保存并显示出持久的活性，即无需用活化剂再刺激来提供治疗益处。虽然对于使活化的NK细胞显示出持久的活性而言不是必需的，并且是较不优选的，活化的NK细胞群也可在活化剂的存在下被保存。如本申请中所描述的，活化的NK细胞群可根据任何熟知的方法被保存，见例如美国专利号7，270，946 ；7，150，991 ；6，921，633 ；Kanias and Acker (2006)Cell Preservation Technology 4 :253-277等，其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入。在一个实施方式中，本申请中所描述的活化的NK细胞群是通过选自下列的方法被保存的细胞培养、冷藏和冷冻保存。在优选的实施方式中，本申请中所描述的NK细胞群是通过冷冻保存被保存的。在保存过程中、并且最优选地在保存之后，活化的NK细胞群优选基本上不含活化剂。可使用熟知的方法来获得基本上不含活化剂的活化的NK细胞群。例如，可通过密度梯度分离和清洗、或通过免疫磁性选择CD56+NK细胞及随后的清洗、或上述的组合，而从活化剂中分离活化的NK细胞。获得基本上不含活化剂的活化的NK细胞群后，活化的NK细胞可通过细胞培养、冷藏或冷冻保存而被保存。在一个实施方式中，活化的NK细胞是通过细胞培养而被保存的。 通常，通过细胞培养的保存包括将之前经活化的NK细胞悬浮于适于维持活化的NK细胞的存活的培养基中，以及在生理学上相关的环境(例如，371和约7%0)2)中孵育悬浮物。本领域技术人员将认可，许多不同的公知培养基适于维持活化的NK细胞的存活。在一个实施方式中，在化学上确定的培养基中培养活化的NK细胞群。如本申请中所使用的，“化学上确定的”是指已知化学组成(定量及定性地)而无有意添加的未经表征的补充物的培养基，虽然此种培养基在其组分中可含有痕量的污染物。化学上确定的培养基必须缺少动物血清、饲养细胞(例如基质细胞)和基于细胞的细胞外基质，其源自例如成纤维细胞等。通过细胞培养而保存后，活化的NK细胞可被制备用于施用而不使所述细胞暴露于活化剂。通常，通过冷藏保存包括使活化的NK细胞悬浮在适于维持细胞存活的培养基 (例如，化学上确定的培养基)中，以及在约4°C孵育悬浮物。通过冷藏而保存后，活化的NK 细胞可被制备用于施用而不使所述细胞暴露于活化剂。各种用于冷冻保存细胞的介质和方案(包括玻璃化)是本领域中已知的。见例如，Strong DM et al. (1982) J. Clin. Immunol. 2 :214-221。通常细胞可被浓缩、悬浮在包含冷冻保护剂和/或稳定剂的冷冻介质中、分配到适当的冷冻容器中、以使对冷冻的细胞的损伤最小化和使恢复最大化的速率冷却、以及在液氮或汽相的液氮中在例如-70°C或更低 (例如，-80°C或更低，例如_135°C或更低)中冷冻保存。在获得基本上不含活化剂的活化的NK细胞后，可将NK细胞重悬于冷冻保护剂或冷冻介质中。通常以与其所被培养的密度不同的细胞密度冷冻保存所述细胞。在一个实施方式中，以约5X106细胞/mL冷冻介质至约2X107细胞/mL冷冻介质的细胞密度冷冻保存之前经活化的NK细胞。在优选的实施方式中，以IOXlO6细胞/mL冷冻介质冷冻保存之前经活化的NK细胞。冷冻介质通常包含培养基、冷冻保护剂、血清和任选地包含稳定剂。细胞可被保存在任何本领域中已知的冷冻保护剂中。例如，所述冷冻保护剂可以是二甲亚砜(DMSO)或甘油。在一些实施方式中，所述冷冻介质包含约5-10 %的DMS0、10-90 %的血清白蛋白和 50-90%的培养基。在一些实施方式中，冷冻保存介质将包含约7. 5%的DMSOj^ 42. 5%的血清白蛋白和约50%的培养基。细胞还可被保存在任何本领域已知的稳定剂中。例如，所述稳定剂可以是甲基纤维素或血清。其它可用于保存细胞的添加剂包括(通过例举而非限制的方式)二糖例如海藻糖(Scheinkonig, C. et al.，Bone Marrow Transplant. 34(6) 531-6 (2004))，或血浆容量扩增剂，例如羟乙基淀粉(即羟基乙基淀粉)。在一些实施方式中，可使用等张缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液。示例性的冷冻保存组合物具有含4% HSA、 7. 5%二甲亚砜(DMSO)和2%羟乙基淀粉的细胞培养基。用于冷冻保存的其它组合物和方法是本领域熟知的和在本领域中被描述过的(见例如，Broxmeyer，H. E. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci USA 100(2) :645-650 (2003)) 在冷冻之前，可将活化的NK细胞分配到数个单独的容器中以创建细胞库。细胞可被保存在例如玻璃或塑料的小瓶、管或袋子等中。当需要将细胞用于将来使用时，可从细胞库中选择一部分经冷冻保存的细胞(来自一个或多个容器)，并将其制备用于施用。这可有利地以主动和全身性的方式对多个供体进行，以创建用于随后使用的活化的NK细胞库。在优选的实施方式中，如本申请中所描述的，供体细胞在冷冻保存之前被活化，然后可用于根据本申请所提供的教导来治疗供体、供体家庭的成员和/或其它不相关的第三方。在一个实施方式中，保存后制备活化的NK细胞用于施用不包括使细胞暴露于活化剂。通常公知的是，不同细胞类型的冷冻保存可能受到冷却速度的影响。例如，过快的冷却速度可引起致命的细胞内冰晶的形成。相反，过慢的冷却速度可对细胞造成渗透冲击损伤。研究已显示，对于大多数生物学细胞，存在可被认为对于所述细胞类型是最佳的特定冷却速度。用于确定活化的NK细胞的最佳冷却速度的方法是本领域技术人员熟知的。见例如，Fujiwara et al. (1986) J. Immunol. Methods 90:265—73。
在一个实施方式中，本申请的活化的NK细胞群是以约-1°C /分钟至约_3°C /分钟，优选-l°c / 分钟的速度冷冻的。见例如，Locke et al. (1984)Psychosomatic Med. 46 441-453。在另一个实施方式中，如本申请所描述的活化的NK细胞群在不同的相中以不同的速度被冷却，例如在液相中的速度是-1°C /分钟至_2°C，在相变化过程中的速度是约-5°C而在固相中的速度是_2°C /分钟至_3°C。见例如，Fujiwara S. et al. (1986) J. Immunol. Methods 90:265-273。在另一个实施方式中，可以_1°C /分钟的速度将细胞冷却至_4°C，然后以-25°C /分钟的速度至-40°C，然后以15°C /分钟的速度加温到-12°C， 然后以-1°C /分钟的速度冷却到-40°C，并且然后以-10°C /分钟冷却到-70°C。见例
Schmidt-Wolf et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:185-189。在优选的实施方式中，以-1°C /分钟的速度将细胞从4°C冷却到-30°C，并且随后以_2°C /分钟的速度冷却到-100°C。可使用本领域中熟知的设备(例如，可编程的控速冷冻系统)来实现以特定的冷却速度冷冻之前经活化的NK细胞。例如，冷却细胞用于冷冻保存的商业设备可通过向设备中注射液氮汽而实现受控的温度改变。随着设备内的温度增加或降低，可注射另外的液氮以保持所希望的冷却速度。备选地，可在机械冷冻机中冷冻活化的NK细胞。可如本申请中所描述的或根据普通技术人员已知的任何方案来冷冻活化的NK细胞，例如-135°C、液氮汽寸。在一个实施方式中，活化的NK细胞群可被冷冻保存在冷冻细胞袋(例如，可以1-2X107细胞/mL的细胞密度冷冻活化的NK细胞群)中、在介质(例如，包含比例为 45 (X-vivo) 10 (DMSO) 45 (HSA)的 X-vivolO (VWR，West Chester，PA)、二甲亚砜(DMSO) 和人血清白蛋白(HSA)的介质)中，以及经真空包裹于-135°C或低于-135°C的氮气中在受监控的氮冷藏箱中。与LAK细胞相反(其通常在不存在IL-2时在保存约12小时后丧失其活化的状态)，本发明的活化的NK细胞的保存令人惊讶地不影响细胞的活化状态，即使是在不存在活化剂时进行所述保存亦是如此。在一个实施方式中，保存可发生超过12个小时，更一般性地超过12至18个小时，并且优选地超过M至36个小时。在一个实施方式中，本申请中所描述的活化的NK细胞群可被冷冻保存(例如在氮气中)至少约1天，例如至少约1周， 例如至少约4周，例如至少约3个月，例如至少约6个月，例如至少约1年，例如至少约5年寸。保存之后，细胞群可被制备用于向患者施用。可根据熟知的方法实现冷冻细胞的融化。一般的融化程序包括将冷冻的细胞快速转移至37°C的水浴以及提供轻柔的搅拌直至活化的NK细胞完全融化。融化之后，可通过如下而将融化的NK细胞制备用于向患者中施用在室温下加入(优选以逐滴的方式)药学上可接受的载体，例如以稀释冷冻介质的浓度和/或清洗之前经活化的NK细胞。如本申请中所表明的，本发明的细胞群在此种保存后没有持续地和/或随后暴露于活化剂而维持其活化状态。如此，在一个实施方式中，细胞在不存在活化剂时被制备用于施用。保存后用于施用的细胞的制备取决于保存方法。例如， 可通过细胞培养和/或冷藏而在保存后制备细胞用于施用，所述制备可通过下列的一步或多步清洗细胞、使细胞重悬于药学上可接受的载体中和/或使细胞包含在合适的递送设备(例如，注射器)中。在一个实施方式中，通过融化而在冷冻保存后制备细胞用于施用，例如通过在37°C水浴中轻柔的搅拌以及然后使细胞包含在合适的递送设备(例如注射器) 中。这些融化的细胞群令人惊讶地可基于需要几乎立即被用于临床中，例如在没有再活化或其它大量和/或费时的操作的情况下。因此，虽然不是必须的，可通过在室温下加入(优选以逐滴的方式)药学上可接受的载体以例如稀释不含冷冻介质的细胞的浓度和/或清洗不含冷冻介质的细胞，而进一步制备冷冻保存后用于施用而制备的细胞。在一个实施方式中，所述药学上可接受的载体基本上不含活化剂。组合物因此，本申请中所公开的是包含活化的NK细胞和基本上不含活化剂的药学上可接受的载体或介质的药物组合物。活化的NK细胞显示出持久的和延长的活性，并且甚至在保存之后保持其活化状态。活化的NK细胞可以是之前经保存的活化的NK细胞。在优选的实施方式中，与静止的NK细胞相比，本申请的活化的NK细胞过表达⑶69和/或⑶25以及更优选地，作为活化的结果，其丧失⑶16的表达并获得⑶15的表达。还包括在本发明中的是不含或基本上不含用于活化NK细胞的试剂的即用性可输注制剂，所述制剂用于不共施用(无论是同时、分别还是顺次)活化剂而治疗癌症。本发明的实施方式在于用于制造不含或基本上不含用于活化NK细胞的试剂的即用可输注制剂的方法，所述方法包括下述或由下述组成融化经冷冻保存的、不含或基本上不含活化剂的活化的NK细胞，所述制剂用于不共施用(无论是同时、分别还是顺次)活化剂而进行的治疗性应用。此实施方式中的可输注制剂准备好用于立即应用而没有任何进一步的加工。所述可输注制剂可被用于治疗癌症。如本申请中所描述的，本发明的经活化的⑶69+⑶25+CD16 ⑶15+NK细胞(与LAK 细胞相反)可在保存后立即被制备用于施用，即不需要再活化且不需要同时或顺次地共施用活化剂。因此，在一个实施方式中，药物组合物包含基本上不含活化剂的、药学上可接受的载体或介质中的被制备用于施用的活化的NK细胞。在一个实施方式中，活化的NK细胞可包含关于接受者为自体的和/或同种异基因性的NK细胞，或基本上由其组成。换言之，自体NK细胞可从接受者的外周血获得。同种异基因性NK细胞可以是部分或完全HLA不匹配的，并且可以从来自供体个体或多个供体的外周血获得。可通过标准技术(例如常规的成分输血)来收集外周血单核细胞。为了使得移植物相对宿主疾病和免疫介导的发育不全的可能性最小化，可耗尽同种异基因性细胞的T细胞。例如，可使用与单克隆小鼠抗人CD3抗体相缀合的微珠和细胞选择设备(例如Miltenyi Biotec CliniMACS. RTM.细胞选择设备)来耗尽细胞制备物的CD3+T-细胞。然而，单独通过此类“阴性选择”过程而产生的NK细胞不具有高纯度并且可被T 和B细胞污染。虽然在自体设置中不是必需的，去除此类细胞在本申请中所涉及的同种异基因性设置中是有利的。为了减少污染，有可能通过直接的免疫磁性分离(例如基于CD56 的表达)来获得NK细胞制备物。为了进一步减少T细胞污染，可耗尽产物中的CD3+细胞 (例如使用CD3 FITC和抗FITC珠子)。在用活化剂活化之前，NK细胞制备物可包含至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的⑶56+细胞。在另一个实施方式中，在通过活化剂活化之前，NK细胞制备物可包含少于15%、少于10%、少于5%或少于3%的⑶3+细胞。本领域技术人员将认可，在自体设置中，T细胞含量是无关的，并且由此，可使用非选择的NK细胞。本发明的⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+活化的NK细胞令人惊讶地在不存在活化剂时、 甚至在保存后仍保持其活化状态，并且因此不需要在医疗应用之前或之中再活化和/或随后与活化剂相接触。因此，本申请所公开的药物组合物包含基本上不含活化剂的、在药学上可接受的载体中的此类之前经活化的NK细胞。本发明的NK细胞即使通过例如细胞培养、 冷冻保存、冷藏等保存，仍显示出延长的活性(即在不存在活化剂时，在保存后保持其活化的状态)。在一个实施方式中，本申请中所公开的药物组合物包含融化的细胞群，其含有在不存在活化剂时在保存后保持其活化状态的活化的NK细胞，和药学上可接受的载体，其中融化的细胞群包含用于治疗癌症的药学上有效量的活化的NK细胞。实现治疗效果所需的细胞的量可根据用于特定目的的常规程序依经验确定。通常，对于施用细胞用于治疗目的，以药学上有效的剂量给予所述细胞。“药学上有效量”或 “药学上有效的剂量”是足以产生所希望的生理学效果的量或能够实现所希望的结果的量， 特别是用于治疗病症或疾病状况、包括降低或消除病症或疾病的一种或多种症状或表现的量。作为阐示，不仅当潜在的病况被清除或缓解时，也当患者报告与疾病相关的症状的严重性或持续时期减少时，向患有癌症的患者施用所述细胞提供了治疗性益处。治疗性益处也包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，无论是否实现了改善。药学上有效的剂量(如上文所定义的)也将适用于与所述细胞相组合使用的治疗性化合物，如下文中所进一步描述的。药物组合物通常将包含药学上可接受的载体和药学上有效量的本发明的 ⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+NK细胞。药物组合物通常可被配制为溶液、悬浮物、气雾剂和其它本领域已知的制剂。如本申请中所使用的，“药学上可接受的载体”包括本领域普通技术人员已知的用于配制药物组合物的任何标准的药学上可接受的载体。因此，可在药学上可接受的稀释剂中将活化的NK细胞配制为制剂，所述稀释剂为例如盐水，磷酸盐缓冲液(PBS)，含水乙醇， 或葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、丙二醇、油(例如，植物油，动物油，合成的油等)、微晶纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶、聚山梨糖醇80等的溶液， 或在合适的赋形剂中被配制为固体制剂。药物组合物将通常还酌情包含一种或多种缓冲剂(例如，中性的缓冲盐水或磷酸盐缓冲液)，糖类(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐)，甘露醇，蛋白质，多肽或氨基酸 (例如甘氨酸)，抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁羟甲苯、丁羟茴醚等)，抑菌剂， 螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)，使得制剂与接受者的血液等张、低渗或微弱高渗的溶质， 悬浮剂，增稠剂，防腐剂，调味剂，甜味剂，和着色化合物。虽然所述组合物中可采用本领域普通技术人员已知的任何合适的载体，载体的类型通常将根据施用模式而变化。治疗组合物可为了任何合适的施用方式而配制，所述施用方式包括例如口服施用、经鼻施用、粘膜施用、直肠施用、阴道施用、表面施用、静脉内施用、 腹膜内施用、皮内施用、皮下施用和肌内施用。对于肠胃外施用，所述组合物可被制备而用于作为含有药学载体的生理学上可接受的稀释剂中的、可注射剂量的物质溶液或悬浮液施用，所述药学载体可以是无菌的液体，例如无菌无致热原水，油，盐水，甘油，聚乙二醇或乙醇。此外，组合物中可存在辅助性物质， 例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、PH缓冲物质等。药物组合物的其它组分是石油、动物、 植物或合成来源的，例如花生油、豆油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯的非水性溶液。本申请中所描述的药物组合物可以单位剂量或多剂量容器呈递，例如密封的输注袋、安瓿瓶或小瓶。此类容器通常被密封以保存制剂的无菌性和稳定性直至使用。通常，如上文所示，制剂可作为油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳剂而被保存。备选地，药物组合物可被保存在冷冻干燥的条件下，仅要求在即将使用之前加入无菌液体载体。在优选的实施方式中，所提供的药物组合物包含冷冻保存在合适的冷冻保存介质中的活化的NK细胞，然后可将其融化并按照需要制备用于向患者施用。施用于宿主的量将根据被施用的是什么、施用目的(例如预防或治疗)、宿主的状态、施用的方式、施用的数目、施用之间的间隔等而变化。这些可由本领域技术人员根据经验确定并且可针对治疗性应答的程度而进行调整。在确定适当的剂量时要考虑的因素包括但不限于受试者的尺寸和重量、受试者的年龄和性别、症状的严重性、疾病的阶段、递送试剂的方法、试剂的半衰期和试剂的效力。要考虑的疾病阶段包括疾病是急性的还是慢性的、复发或缓解时期以及疾病的进行性。对于治疗有效量确定施用的剂量和次数在本领域普通人员的技能范围内。例如， 可由细胞培养或其它体外测定来估算起初的有效剂量。然后可在动物模型中配制剂量以产生循环浓度或组织浓度，包括如由细胞培养测定所确定的IC5tlt5此外，一般通过细胞培养测定和/或使用实验动物来确定毒性和治疗效力，通常是通过测定LD5tl(至50%测试群体的致死剂量)和ED5tl(在50%的测试群体中的治疗有效性)。在标准的参考作品中(例如 Goodman & Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed. (Hardman，J. G. et al.，eds.)McGraw-Hill，New York, N. Y. (2001)) 找到了指引。对于本发明的目的，根据被治疗的病况和药物组合物的形式而选择施用方法。可以各种方式进行治疗性化合物的施用，所述方式包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、以及可能地直接注射到特定的器官(例如脾或骨髓)，虽然优选的是全身性施用。药物组合物的施用可通过单一途径或同时通过数个途径。所述组合物可每天一次、每天几次或数次或甚至每天多次被施用，这特别取决于被治疗的适应症和主治医师的判断。在优选的实施方式中，所述细胞在保存后立即被施用。在用组合物进行治疗之前，患者可接受一些预处理，例如，使肿瘤缩小体积 (de-bulk)和/或免疫抑制患者。这可例如通过化学疗法实现。有可能在诊断时从患者中获得原发性肿瘤细胞并且冷冻保存这些作为可存活的单细胞悬浮物。因此，有可能针对患者的胚细胞(blasts)体外测试根据本发明的组合物。 这可在着手实施治疗方案之前进行，以估量方法的适合性。也可调查体外研究的结果与对治疗的相应临床应答的关联。本发明的药物组合物可被用于医药中，例如，用于治疗或预防疾病(例如癌症)的药物中。在用所述组合物进行治疗之前，患者可接受一些预处理，例如通过化学疗法来例如使癌症缩小体积(de-bulk)和/或免疫抑制患者。
此外，在不存在活化剂时，被制备而用于施用的活化的NK细胞可用于制备药物， 所述药物用于治疗此类疾病。疾病本发明还基于下述出乎意料的发现由本申请中所公开的活化剂(例如 CD15+LAK-抗性肿瘤细胞)所活化的外源NK细胞可赋予内源性NK细胞类似的细胞裂解活性。因此，本申请还描述了刺激有需要的患者中内源性NK细胞活性的方法，所述方法包括向所述患者施用之前经活化的NK细胞群，所述NK细胞群即使保存仍显示出持久和延长的抗肿瘤活性，并且有利地，无需用共施用活化剂本身来进行再活化，所述活化剂升高潜在的毒性和/或免疫原性问题。在优选的实施方式中，活化的NK细胞为CD69+和/或CD25+，且更优选地还是⑶15+和⑶16低的。在一个实施方式中，内源性NK细胞活性是抗肿瘤活性。在另一个实施方式中，细胞裂解活性被赋予携带肿瘤的宿主中的内源性NK细胞。在另一系列的实施方式中，细胞裂解活性在肿瘤细胞(包括肿瘤细胞片段)的存在下被赋予内源性NK细胞。此类肿瘤细胞 (包括肿瘤细胞片段)可源自原发性肿瘤、转移、或来自离体来源。本领域普通技术人员将认可，可使用如本申请中所描述的经保存的群体以及刺激内源性NK细胞活性的方法来治疗或预防疾病或医学病况，特别是癌症。有大约200种不同的癌症类型。癌症类型的列表是公知的并可获得的(例如，见癌症在线资源协会的网址或癌症研究UK的网址)。一些更为常见的癌症包括白血病(急性和慢性的)、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤)、肠 (结肠直肠癌)、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、食管癌、霍奇金氏淋巴瘤、肾癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、 多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、皮肤癌(黑色素瘤和非黑色素瘤)、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和子宫内膜癌。特别地，本申请中所公开的组合物可被用于治疗NK细胞可接触到的任何癌症。在一个实施方式中，所述癌症可以是血液恶性肿瘤，例如白血病(AML)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；淋巴瘤。骨髓瘤是不可治愈且致命的恶性肿瘤。有文件记载了在体外抵抗骨髓瘤浆细胞的NK活性，并且已显示抗自体骨髓瘤细胞的增强的NK活性与对用萨力多胺衍生物进行的治疗的应答相关。骨髓瘤患者通常足够年轻和健康以进行自体血液干细胞移植并且可单独地、或在自体血液干细胞移植之后容易地进行侵入性更小的程序(例如由本发明所提供的程序)。移植后淋巴增殖疾病(PTLD)是固体器官移植后严重的且相对常见的并发症，T 细胞免疫疗法目前在实验中有良好的成功但是极其昂贵且技术上是困难的，因而其应用有限。使用根据本发明的疗法活化的NK细胞的疗法在此组患者中将是简单和安全的。此外，所述组合物可被用于治疗固体肿瘤，例如乳腺癌。所述程序特别适于治疗“NK抗性”肿瘤。正常的、非⑶15+LAK-抗性肿瘤细胞刺激的NK细胞可自发地裂解一些人肿瘤，但是许多其它的肿瘤是NK抗性的。因此，如本申请中所使用的，“NK抗性”是指对于正常的、非CD15+LAK-抗性肿瘤细胞刺激的NK细胞的裂解有抗性的肿瘤细胞。如上文中所解释的，通过在靶细胞表面上表达特定的MHC I类分子(特别是
18HLA-C)而控制对NK介导的裂解的抑制。关于NK细胞识别，有两组不同的HLA-C等位基因。 一些肿瘤表达两种类型的HLA-C等位基因，这被认为使得它们对于NK介导的裂解有抗性。 因此，“NK抗性”细胞可表达两组I类等位基因。一些源自白血病/淋巴瘤的细胞系(例如 Raji和Daudi)表达两类HLA-C等位基因，使得它们是体内NK抗性肿瘤细胞的有用模型。被施以如本申请中所公开的药物组合物的患者也可用其它的治疗剂来进行治疗。 优选的治疗剂包括增强NK活性的试剂。此类增强剂是本领域中熟知的。此类增强剂的非限制性实例包括萨力多胺及其免疫调节(IMid)类似物(例如，来那度胺，雷利米得，CC-5013， CC-4047，ACTIMID ；见例如，Wu et al. (2008) Cl in. Cancer Res. 14 :4650-7)，细胞因子(例如，IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，CCL5)等。所述的其它治疗剂可与如本申请中所公开的经活化以显示持久活性的NK细胞同时或顺次施用。现在将通过下面的非限制性实施例来进一步描述本发明，所述实施例进一步阐释了本发明而不意在(也不应被解释为)限制本发明的范围。
实施例实施例1 白血病细胞上的Lewis X(⑶15)表达介导持续的天然杀伤细胞引发和肿瘤裂解NK细胞的CTV-1，SEM和MV-411引发引起持续且持久的活化状态，其中活化的NK 细胞甚至在保存后仍保持裂解NK抗性肿瘤的能力。此类在保存后被制备而用于施用的活化的NK细胞提供容易的临床应用，因为此类制备不要求暴露于活化剂或用活化剂进行再活化。实施例1.1材料和方法实施例1. 1. 1 细胞系和细胞培养试剂所有的细胞系均获自DSMZ，Braunsctiweig，德国或者来自LGC，伦敦，UK并按照保藏库所推荐的进行培养。CTV-I系原本被报道是骨髓来源的，但是最近被显示是表达CD15 的、具有骨髓特征的急性幼成淋巴细胞性白血病(ALL)。SEM系是具有W4 ;11)移位的另一个CD15+ALL系。MV-411是双表型的CD15+W4 ；11)急性髓单核细胞性白血病。M0LT-16和PF-382都是CD15-ve ALL系。RAJI系是源自非霍奇金氏淋巴瘤的 B细胞系并且是原型NK抗性系。K562细胞是原型NK-敏感性的并且源自成红血细胞样 (erythroblastoid)白血病。DU145细胞源自前列腺肿瘤上皮细胞，其作为粘附细胞被培养并通过在汇聚时进行胰蛋白酶消化而被收获。RPMI82^细胞源自具有骨髓瘤的患者。ARH77 细胞源自患有浆细胞白血病的患者的外周血。将所有的细胞培养物都维持在由补充了 10% FCS、青霉素(lOOi.u.)和链霉素 (lOOi.u.)的 RPMI 1640 组成的完全培养基(CM)中(都由 Invitrogen, Paisley, Scotland 供应)。所有的细胞都保持在连续悬浮培养物中并在使用刺激剂或靶细胞之前在指数生长期收获。实施例1.1. 2:抗体抗CD15抗体(克隆MEM 158)、抗CD49f抗体(克隆4F10)和抗CD56抗体(克隆 NCAM 16.2)是从 krotec UK Ltd (Oxford, UK)获得的。
实施例1. 1. 3 免疫表型为了分析细胞表面抗原表达，在室温下用缀合了荧光染料的单克隆抗体、以制造商推荐的浓度孵育100 μ 1 HBSS中的IO5细胞15min。清洗之后，通过流式细胞计数 (FACSCalibur with CellQuest software,Becton Dickinson，UK)分析细胞。在从每个样品中获取至少10，000个细胞之前，使用向前和侧面的光散射特征来门控(gate)可存活的淋巴细胞群。所有缀合了荧光染料的mAbs都购自BDIS(Cowley，UK)或Beckman Coulter (High Wycombe, UK)。实施例1. 1. 4 人NK细胞的分离和肿瘤特异性活化所有的样品都是有知情同意而获得的而用于对白血病的先天免疫的研究。从正常的健康志愿者供体获得新鲜的肝素化的外周血样品。外周血单核细胞(PBMCs)是通过不连续密度梯度分离(Lymphopr印，Nycomed, UK)从静脉血分离的并以IXlO6细胞/mL的浓度悬浮在CM中。在37°C和5% CO2的气氛下，以2 1的刺激剂应答剂比例用经辐射的 (30Gy)刺激剂细胞孵育PBMC至多20小时。通过用CD56 Multisort试剂盒(Miltenyi Biotec，德国)进行直接免疫磁性分离，伴有或不伴有随后用CD3 FITC和抗FITC珠进行的耗竭，而从PBMC或PBMC:刺激剂细胞共培养物纯化⑶56+或^56+^3—细胞。所有所选择的细胞均被证实为> 98%⑶56+并且，当进行了⑶3耗竭时，被证实为< 3%⑶3+且重悬于CM中。用抗⑶56微珠进行的免疫选择以及随后的清洗从最终产品中去除了所有可检测的刺激剂细胞。实施例1. 1. 5 =NK细胞的IL-2活化以IxlO6细胞/mL的密度将新鲜分离的NK细胞悬浮于含有IOOi. u. IL-2 (Invitrogen, Paisley, UK)的 CM 中，并在 37°C下和 5% CO2 的气氛中孵育 48 小时。实施例1. 1. 6 通过流式细胞计数分析细胞内蛋白磷酸化用缀合了荧光染料的抗⑶3和抗⑶56预标记经纯化的NK细胞，以允许当随后与经辐射的刺激剂细胞相混合时，鉴别所述NK细胞。在37°C下，将刺激剂响应剂细胞混合物孵育所规定的时间段并通过加入Cytofix缓冲剂(BDIS，Oxford，且孵育10分钟而停止NK细胞活化。通过用冰冷的Perm缓冲液III (BDIS，Oxford,UK)进行渗透30分钟，随后在染色缓冲液(BDIS，Oxford，UK)中清洗并重悬于相同的缓冲液中。然后在室温下用对经磷酸化的目的蛋白有特异性的抗体孵育样品30min，清洗两次并通过流式细胞计数进行分析(FACS Aria, BDIS, Oxford, UK)。使用“簇分析”来确定表达每种抗原的细胞的百分比， 并且作为单变量“阳性”群体的中值通道log荧光而计算相对荧光强度。实施例1. 1. 7 细胞毒性测定细胞毒性测定中的靶细胞包括NK抗性RAJI细胞系和NK-敏感性K562细胞系 (从LGC细胞库获得)。从悬浮培养物中回收靶细胞并在HBSS中清洗，然后以^lO6Ail的浓度重悬于1. Oml的PHK-沈标记稀释液中。将4 μ 1的ΡΚΗ46等份加入1. Oml标记稀释液中，然后在室温下将其加至细胞悬浮液2分钟。通过加入1. Oml胎牛血清Imin而终止标记反应。最后在CM中将经标记的细胞清洗两次并以106/ml重悬于CM中。将100 μ 1 RPMI 1640(10% FCS)中的五万个PKH-沈标记的靶细胞加入400 μ 1效应子细胞中(Ε T比率为1 1或5 1，如图标中所示，因为这些是不依靠离体繁殖而可在临床治疗设置中获得的比率)并以200Χ g沉淀1分钟。页利用4-hr细胞毒性测定，于37°C、在一式三份的样品中测量细胞毒性。在孵育阶段之后，将细胞重悬于PBS中的To-Pro-3碘化物溶液中(1 μ M) (Invitrogen，Paisely Scotland)并通过流式细胞计数进行分析。在对红色荧光进行电子门控之后，以IOM通道分辨率获得了至少IXlO4个靶细胞，并且确定了来自一式三份的样品的To-Pro碘化物阳性细胞的平均比例。由不存在效应子细胞而孵育的细胞确定了背景靶细胞死亡。细胞介导的细胞毒性被报道为由三个样品平均而得到的相对于背景细胞死亡的杀伤百分比(特异性裂解)平均值(％测试中的细胞裂解自发裂解)。在这些实验中观察到了少于5%的靶细胞自发裂解。在一些实验中，颠倒了标记策略，其中用PKH16标记效应子细胞，并且将细胞裂解分析限于PKH-ve部分。这种颠倒证实了起初的发现不是由于细胞标记的假相。实施例1. 1. 8 产生CD15-转导的RAJI细胞使用正向引物5' ATG GGG GCA CCG TGG GGC TCG CCG AC3' (SEQ ID NO 1)和 5' AGT GGC GAG CTT GGT CGA CCG GTT 3' (SEQ ID NO :2)，从淋巴细胞 cDNA(Dr. Steve Hart的礼物)中将编码人α 1，3_岩藻糖基转移酶IV(FUT4)的cDNA(其促成⑶15的表达(Nakayama, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :16100-106))平末端 PCR 克隆到 pLenti6/ V5 (Invitrogen, Paisley, UK)中并通过测序进行了验证以给出pLenti6/CD15。使用磷酸钙、以3. 5 1.75 5 的比例用 pCMVDR8. 91 (Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15 :871-75)pVSV-G(Chan, et al. (2006)Mol. Therapy 11:120-31)和 pLenti6/CD15进行转导后，由四31~细胞产生了 VSV-G假型病毒。转染后M小时用不含血清的培养基替代补充了血清的培养基，并且48小时后通过钙沉淀收获和浓缩病毒。将病毒上清液浓缩为粒状沉淀并重悬于Iml的缓冲液(IOOmM EDTA, 50mM NaCl, 0. 2% BSA, pH 6. 5) 中。以^clO5Pfu培养IO6RAJI细胞6小时，然后将其汇集、清洗并以5X105/ml在烧瓶中重悬于新鲜的RPMI+10% FCS中。转染后4 通过流式细胞计数评估⑶15表达。实施例1. 1. 9 统计学分析就归一性(高斯分布)以及通过F-检验就相当的方差(使用GraphPad Prism v4.0)来评估比较统计学分析的数据。通过Mudent t_检验就其平均值的显著差异测试具有相等方差的分布。通过Snedecor的经修饰的t-检验来测试具有显著不同的方差的那些，所述Snedecor的经修饰的t_检验补偿不等的方差。没有数据组是非高斯的。实施例1.2:结果对人NK介导的肿瘤细胞的裂解的调控涉及NK和肿瘤细胞上的繁多细胞表面受体，这提供了抑制性和活化的信号。当靶细胞上由配体提供的活化信号的组合克服任何抑制性信号时，发生裂解。抑制性分子的主要配体似乎是HLAI类抗原，并且已显示肿瘤对NK 介导的裂解的敏感性与这些分子的表达程度相关(CiCCOne，et al. (1992) J. Exp. Med. 176 963-71)。相反，B淋巴瘤细胞系RAJI对于NK介导的裂解的非敏感性被归因于其表达NK抑制性分子的所有已知类别的配体。尽管如此，RAJI细胞易受由IL-2或IL-15活化的NK细胞的裂解，这表示如果可以克服抑制性信号，则NK活性的触发配体以足够的水平存在。Bryceson和同事^)06)使用了鼠类肥大细胞瘤细胞系P815来在反向细胞毒性测定中测试NK活化配体，其中使用静止的、新鲜分离的人NK细胞，而非NK系或克隆(Blood 107 :159-66)。这些数据证实了缺乏通过HLA的NK抑制不足以触发裂解(Warren et al. (1996) J. Immunol. 156 =2866-73) ；P815细胞不表达HLA，但是对于人NK裂解有抗性。 此外，除了 CD16，其它已知的NK触发配体要求至少一个共连接事件来触发细胞因子分泌和 /或裂解。小组没有研究所需的两种信号需要被同时递送还是可以顺次提供。之前的工作显示出也对由IL-2活化的NK细胞的裂解有抗性的NK抗性细胞系能够引发静止的NK细胞来裂解 RAJI 细胞(North, et al. (2007) J. Immunol. 178 :85-94)。NK细胞是人对抗肿瘤生成的防御的及其重要的部分并且似乎在健康个体内进行着的肿瘤监控中起关键作用(Imai，et al. (2000)Lancet 365:1795-99)。它们在种系发生方面是高度保守的，这在于表达穿孔素、颗粒酶以及甚至⑶16、⑶56、⑶57和⑶158b的细胞毒性细胞已在无脊椎动物的血腔中被报导(Lin, et al. (2001) J. Exp. Zoology 290 741-50 ；de Eguileor,et al (2002) Curr. Pharmaceutical Design 8:99-110)；所述生物体不表达作为抑制性分子(例如CD158b)的配体的HLA分子。这表示NK细胞的最根本的控制机制可能不是通过自身MHC的抑制，而可能是通过要求类似于高等脊椎动物中T细胞的共刺激和触发的顺次或同时的活化信号。来自Bryceson等人Q006)和North等人Q007) 的数据支持这一假设，且此处所呈现的结果首次表明了配体的表达在裂解的起始中对于肿瘤细胞上NK共刺激的关键重要性。通过静止的NK细胞对NK敏感性K562成红血细胞样白血病细胞进行NK介导的裂解需要与⑶15缔合的⑶2L，但是其本身不足以引发NK细胞活性，因为表达⑶15的静止的正常人单核细胞不能刺激NK活性。因此，必须在共刺激的存在下向静止的NK细胞递送一些形式的肿瘤限制的信号，以引发其裂解呈递适当的触发配体的肿瘤细胞。之前已提出了许多用于提供肿瘤限制的信号的候选分子，包括热激蛋白、凝集素和复合糖类，但是关键的配体仍然难以捉摸。在对于这些配体的进一步剖析中，CTV-I细胞似乎是有价值的工具，因为清楚的是仅仅是缺乏抑制性受体的配体和存在合适的粘附分子对于肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性是不充分的。移除引发肿瘤细胞系之后，在NK细胞中维持被引发的状态是独特的发现，这与要求持续的细胞因子暴露以产生和维持淋巴因子活化的NK细胞形成鲜明的对比。在此表明了，可通过用相关的NK抗性肿瘤细胞进行短期的共孵育来引发NK细胞，然后可移除所述肿瘤细胞而不影响被引发的状态。这些经引发的NK细胞在冷冻保存和融化之后保持裂解NK 抗性肿瘤的能力，这允许容易地转换至临床应用，因为可远程制备细胞并在投放前确保质量。实施例1. 2. 1 ⑶15+白血病细胞引发NK抗性肿瘤细胞的裂解以NK抗性CD15+肿瘤细胞(CTV_1、MV_411、SEM)共孵育的静止的NK细胞裂解RAJI 细胞(图1A)并且能够裂解不同种系的各种NK抗性肿瘤细胞，这包括RPMI8226，ARH77和 DU145(图1B)。相反，静止的NK细胞或以CD15_ve细胞(M0LT-16、PF-382)孵育的NK细胞不能够裂解RAJI细胞(图1A)。此外，静止的NK细胞不能够裂解ARH77和DU145细胞 (图IB)。CTV-I活化的NK细胞也能够裂解同种异基因性原发肿瘤细胞，所述原发性肿瘤细胞分离自从患有乳腺癌的患者切除的组织和来自患有卵巢癌的患者的腹水(数据未显示； North et al. (2007)J. Immunol. 178 :85-94)。实施例1. 2. 2 抗CD15阻碍NK引发
假设的是静止的NK细胞需要两种信号来起始裂解，并且这些信号可顺次被递送， 因为NK:RAJI共培养物中不存在引发肿瘤细胞。用58种不同的单克隆抗体就潜在的NK活化配体筛选了 CTV-I细胞(数据未显示)并且鉴别出了 5种候选分子⑶58，⑶48，⑶38， ⑶15和⑶Ila/⑶18复合物。其中仅⑶15在CTV-I共孵育后显著地(ρ < 0. 01)抑制NK细胞的活化(图2Α)，如通过⑶25和⑶69的表达所测量的。在对NK细胞上的引发信号受体的搜索中，将CD2鉴别为了潜在的候选者，虽然阻碍引发细胞上其共同的配体⑶58没有显著地抑制裂解。然而，超过十年之前，Warren和同事(1996)描述了 Lewisx的⑶15表位之内的部分，其是⑶2的配体并且存在于原型NK靶细胞Κ562上(J. Immunol. 156 =2866-73)。此外，他们发现NK介导的裂解需要其在K562上的表达；不存在HLA I类的表达不足以触发裂解。CD2是静止的NK细胞上已知的共刺激性引发分子。NK-引发细胞系CTV-I表达高水平的⑶15，并且用CTV-I共孵育NK细胞导致 ⑶15被转移到NK细胞上(数据未显示)，这类似于已被报导的MICA的转移(McCarm，et al. (2007) J. Immunol. 178 :3418- )，这表示其为NK:CTV-1免疫突触的重要组成。在细胞毒性测定中测试了抗CD15阻碍NK引发的能力。在通过与CTV-I接触的引发之后，原型 NK抗性RAJI细胞对于NK介导的裂解是敏感的。在存在或不存在阻碍性抗体的情况下，用 CTV-I共孵育静止的人NK细胞20小时，并在4小时的杀伤测定中进行针对RAJI细胞靶标的测试。使用了两种抗 CD15mAb，克隆 LeuMl (BDIS，Oxford, UK)和克隆 MEM158 (Serotec， Oxford, UK)，前者被报导结合CD15内排除CD2-L位点的位点(Warren, et al. (1996) J. Immunol. 156 =2866-73)。抗CD15克隆MEM 158显著降低NK活性(图2b)，的确，降低至低于阳性抑制性对照抗 CD49f(Lowdell，et al. (1994)Exp. Hematol. 23 1530-34)的水平。 极其有趣地注意到，裂解原型NK敏感性细胞系K562也需要CD15-NK相互作用。K562细胞表达高水平的⑶15，并且用MEM158阻碍此抗原基本上抑制了通过静止的NK细胞的裂解(图 3)，这进一步支持了其在NK细胞引发中的中心作用，并证实了单独的“失去自我”不足以诱导通过静止的人NK细胞的裂解。实施例1.2.3 将⑶15转导到NK抗性细胞中提供了引发信号通过用FUT4的cDNA转导RAJI细胞实现了对CD15的作用的证实。将FUT4转导到RAJI细胞中在48小时内引起了 CD15的表达，并使得细胞易受静止的NK细胞的裂解(图 3)。这通过在细胞毒性测定过程中加入饱和浓度的抗⑶15而被有效地阻碍(图幻。加入抗⑶2mAbs既未阻碍也未增强效果，表示这些mAbs未结合适当的表位(数据未显示)。实施例1. 2. 4 通过⑶15相关配体的⑶2连接通过LAT-STAT信号传导级联而诱导、干扰素的合成通过抗体阻碍实验以及表明⑶3 ζ的磷酸化提供了支持⑶15参与⑶2的连接这一假设的证据。与T细胞上的⑶2相反，NK细胞上的⑶2不是组成型地与⑶3 ζ缔合。 在 NK 细胞中，胞质 CD3 ζ 结合 CD16(Moingeon，et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 89 1492-96)，这大概解释了 CD16活化和触发静止的人NK细胞的独特能力(Bryceson，et al. (2006)，见上)。将静止的NK与CTV-I相缀合引起细胞外CD16的快速脱落(图4 ;North， et al. (2007)，见上)并且假设的是这可促进胞质⑶16/⑶3 ζ复合物与⑶2的细胞内结构域相缔合的相互作用(Moingeon, et al. (1992)，见上)。如图5A中所显示的，将CTV-I细胞与静止的NK细胞共孵育诱导了 CD3 ζ的快速磷酸化。已显示CD2连接引起LAT的磷酸化(Inoue，et al. (2000)Eur. J. Immunol. 32 :2188-98)，并且对 LAT 和 ZAP-70 的细胞内磷酸化的流式细胞计数分析显示了在不存在ZAP-70磷酸化时LAT的快速磷酸化(图5B)，这证实了在CTV-I细胞上、在⑶15内通过⑶2L连接⑶2。LAT的磷酸化被认为是通过ZAP70 的磷酸化，但是在CTV-I共培养之后或用可得的抗CD2抗体交联之后，并不能显示一贯的 pZAP70(数据未显示)。相反，T细胞上CD3的交联引起快速和持续的pZAP70(数据未显示)。这表示NK细胞中⑶2介导的LAT磷酸化可能不依赖于pZAP70。⑶2信号传导的已知结果之一是STAT5的磷酸化，其可引起NK细胞中干扰素、的合成(Gonsky，et al. (2004) J. Immunol. 173 :6241-47)。的确，使静止的 NK 细胞与 CTV-I 细胞裂解物共孵育，在5分钟内可检测到pSTAT5并且持续至少20分钟(图5C)，并且这与在4h之内CD25(图6A)和CD69(图6C)的上调、及干扰素Y的增加的合成(图6F)相联合。用SEM或MV4-11细胞活化NK细胞也引起通过活化的NK细胞快速上调细胞表面表达的⑶25和⑶69 (数据未显示)。由静止的NK细胞对NK-敏感性成红血细胞样白血病K562 进行NK-介导的裂解需要CD15-缔合的CD2L，但其本身不足以引发NK细胞活性，因为表达 CD15的静止的正常人单核细胞不能够刺激NK活性。因此，必须在共刺激的存在下向静止的 NK细胞递送一些形式的肿瘤限制的信号以引发它们裂解呈递适当的触发配体的肿瘤细胞。 之前已提出了许多候选分子，这包括热激蛋白、凝集素和复合物糖类。在对于这些配体的进一步剖析中，CTV-I细胞似乎是有价值的工具，因为清楚的是仅仅是缺乏抑制性受体的配体对于肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性是不充分的。实施例1. 2. 5 ⑶2-介导的和IL-2介导的静止的NK细胞的活化通过不同的路径操控且具有不同的生理学结果与由CD2连接活化的CD3 ζ -LAT-Stat路径相反，已知IL-2通过MKK1/1/ERK活化 NK细胞(Yu, et al. (2000) J. Immunol. 164 :6244-51)，并且CD69的上调和干扰素合成花费至少48小时(分别为图6D和图6G)。与通过CTV-I的⑶2连接所诱导的相比，在IL-2刺激之后⑶25表达的上调也显著更慢，并且活化NK细胞的比例一贯性地更低(图6A)。实施例1. 2. 6 在去除引发信号之后，CD2介导的NK细胞引发是稳定的在去除IL-2之后，IL-2活化的NK细胞快速回复到非活化的状态和/或在保存后丧失活性，特别是在不存在IL-2时。以2 1的额定CTV-I NK细胞比率，用CTV-I细胞的裂解物刺激来自10个正常供体的淋巴细胞20小时。然后通过用抗⑶56微珠(Miltenyi Biotec, Oxford, UK)进行的免疫磁性选择直接分离NK细胞。已显示，经引发的NK细胞制备物不含CTV-I污染(图7A和7B)。与在氮气中冷冻保存了 14天的匹配的细胞相比，由新鲜分离的、肿瘤引发的NK细胞介导的RAJI细胞裂解的程度没有显著不同(图7C)。实施例2 由肿瘤细胞系引发的人NK细胞群可在保存后立即被制备用于施用并且被安全地移植到患有AML的单倍体相同患者并引起可表明的GvL和长期NK嵌合开始了在患有AML的患者中的临床试验，所述患者在完全缓解(CR)或具有少于 25%的胚细胞的部分缓解(PR)中，但不是使用同胞或备选供体的常规移植的候选对象。实施例2.1:材料和方法实施例2. 1. 1 分离和活化人NK细胞通过以2 1的额定刺激剂靶标比率用CTV-I肿瘤细胞的裂解物过夜共孵育CD56+NK细胞(CliniMACS，使用抗CD56微珠)，由来自单倍体相同家族供体的非流通外周血的单一成分输血产生了显示出持久活化状态的NK细胞。然后通过密度梯度分离和清洗从裂解物中纯化所述NK细胞。产品投放标准包括无菌性、规定剂量的5%之内的CD56+/ ⑶3-NK细胞剂量和< 104/kg的总⑶3+/⑶56—T细胞剂量。实施例2. 1. 2 冷冻介质的制备制备了活化的NK细胞的单一剂量等份，将其冷冻保存并储存在脐带血储存装置中直至使用。将单一剂量等份(例如，剂量1 =IXlO6⑶56+NK细胞/kg)冷冻保存在DMS0/HSA 混合物中。通过将600mL转移包的尖刺和两个空气入口插入人白蛋白血清(HSA)4.5%溶 it (ZENALB 4. 5 ；Bio Products Laboratory, Hertfordshire, UK)的)的^ ! 中胃备DMS0/HSA混合物。在允许150mL的HSA 4. 5%进入所述600mL转移包中之后，将转移包的线夹住、热封三次并在中间的密封处断开。将调速型偶合器适配器装置(coupler Ieur adaptor set)的尖刺与含有HSA 4. 5%的转移包的口及三路活塞相连之后，通过置于预冷的冰包上而冷却含有HSA 4. 5%的转移包。使用无菌技术，使用与50mL注射器相连的16G 针头来吸出37. 5mL DMSO0去除所述16G针头后，将所述50mL注射器连至三路活塞，所述三路活塞与含有HSA 4. 5%的转移包相连。将37. 5mL DMSO转移至含有HSA 4. 5%的转移包， 以获得含有终浓度为20%的DMS0/HSA的冷冻介质。在冷冻保存程序中，20% DMS0/HSA冷冻介质在预冷的冰包上保持冷却。实施例2. 1. 3 活化的NK细胞的冷冻保存将如实施例2. 1. 2中所制备的冷冻介质加入所需剂量的NK细胞中，以使细胞体积为17mL，并将NK剂量/冷冻介质混合物转移到一个或多个冷冻细胞袋中(目录号 200-074-401 ；Miltenyi Biotec，Surrey，UK)。将冷冻细胞歧管组 4S-4M60 (Origen，Austin TX)的尖刺插入DMS0/HSA制备物袋中，而将冷冻细胞歧管组的调速适配器与含有NK细胞的冷冻细胞袋相连。将等量的DMS0/HSA冷冻介质加入NK冷冻细胞袋中并轻柔地混合，从冷冻细胞袋中去除空气。使用与5mL注射器相连的19G针头来吸出4. 3mL的细胞悬浮液以用于细胞计数、细胞存活和无菌研究。将冷冻细胞袋双重装袋并置于Planer Kryo-560-16 控速冷冻器(Cryo Solutions;荷兰)中，用于根据冷冻程序冷却。大约65分钟的冷冻程序将细胞在4°C保持5分钟，然后以-1°C /分钟的速度将细胞冷却至-30°C，此后以-2°C / 分钟的速度冷却至_100°C。在完成冷冻程序之后，将冷冻保存的NK细胞置于液氮存储杜瓦瓶中-135°C的气象液氮中。实施例2. 1. 5 患者特征在此描述的是以第一剂量水平(IxlO6NK细胞/kg)处理的六名患者的特征。患者1是56岁大的女性，其呈现出AML。用化学疗法和吉妥珠单抗奥唑米星将所述患者置于完全缓解(CR)中。发生了第一次复发并用化学疗法将患者置于CR2 中，在不成功地搜索同种异基因性供体后，使用就骨髓移植调节的白消安IV/环磷酰胺使所述患者接受了自体移植。患者随后复发并被介绍到这一临床实验中。使用高剂量阿糖孢苷(cytaribine)进行的救助疗法将患者置于CR3中。患者1接受了来自她女儿的IO6个活化的NK细胞/kg。患者2是72岁大的男性，其呈现出AML。在用低剂量阿糖孢苷和4个疗程的5_氮胞啶进行化学治疗之后，患者处于冊，在骨髓抽出物中具有19%的胚细胞。未给予巩固或救助疗法并且他不是骨髓治疗的候选者。此患者接受了 IO6个活化的NK细胞/kg。
患者3是52岁大的男性，其被诊断患有AML(t9 :11)。用化学疗法将其置于CRl 中，但是在一年之内复发了。用伊达比星卡钼和依托泊苷进行的救助疗法将其置于形态学而非细胞遗传学的CR中。在白消安IV/环磷酰胺调节之后，他接受了 HLA-相同的同胞骨髓治疗，但是在八个月之后再次复发了。他接受了伊达比星卡钼和依托泊苷的救助疗法并被置于CR3中，然后他接受了来自不同的同胞的IO6个活化的NK/kg。在输注活化的NK细胞之前，每名患者都经调节。如下对患者进行调节用氟达拉滨05mg/m2/天)进行3天，加上第4天的一份(2Gy)总身体辐射(TBI)。在NK细胞输注的当天(第0天)，制备经冷冻保存的NK细胞用于在患者的床边施用。简要地，用液氮相的运送器，在约_135°C至-190°C的温度下运输经冷冻保存的NK细胞。在设置为37°C的无菌盐水的水浴中伴随轻柔搅动而融化双重袋装的NK细胞。在显示了袋子的完整性之后，移除外部的冷冻细胞袋以通过将注射位点偶合器连接至内袋中的口和16G针头而允许NK细胞转移到注射器中。移除小等份的细胞并将其置于冰上用于输注之后的细胞计数。在融化的 10分钟内且不经再刺激，通过缓慢推动而由IV施用剩余的NK细胞。就安全性紧密地监测患者并通过频繁的实验室和临床评价来进行评估。使用骨髓抽出物(BMA)来评估疾病状态，并且周期性地进行专门的研究来评价嵌合性和NK细胞功能。在NK细胞输注之后6个月时对于各个患者完成了临床研究。实施例2. 2:结果没观察到输注的毒性。所有的患者都经受了一定程度的骨髓抑制，其要求患者内的支持性护理，发育不全的范围为3周直至100天。患者1在+16个月时保持在CR中，其具有稳定的血液计数并已回归到完全活跃的职业和个人生活中了。患者2实现了并保持在 CR中直至+11个月，其复发并用第二次的活化的NK输注进行了治疗。患者3经历了延长的和严重的全血细胞减少症，这需要CD34-选择的干细胞拯救，其实现了并保持在CR中直至+11. 5个月。目前，患者3正在进行再诱导化学疗法，从而用第二剂活化的NK细胞进行治疗。没有供体T细胞嵌合性时，在所有的患者中都见到了极度延长的NK嵌合性(直至+6 个月)。唯一接受了第二次NK细胞剂量的患者实现了供体NK移植而没有其它的免疫抑制。表 权利要求
1.用于直接向有需要的患者施用的药物组合物，其包含在基本上不含活化剂的、药学上可接受的介质中的之前经保存的活化的NK细胞。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中与静止的NK细胞相比，所述活化的NK细胞过表达 CD69 和 CD25。
3.根据权利要求2的药物组合物，其中所述活化的NK细胞为CD15+和CD16 。
4.根据任意前述权利要求的药物组合物，其中所述保存是冷冻保存。
5.根据任意前述权利要求的药物组合物，其中所述药物组合物包含对于患者为自体的 NK细胞。
6.根据权利要求4的药物组合物，其中所述药物组合物还包含对于患者为同种异基因性的NK细胞。
7.根据任意前述权利要求的药物组合物，其中所述药物组合物包含对于患者为同种异基因性的外源NK细胞。
8.根据权利要求7的药物组合物，其中所述药物组合物包含对于彼此为同种异基因性的外源NK细胞。
9.根据任意前述权利要求的药物组合物，其中所述活化剂为CD15+LAK-抗性肿瘤细胞。
10.根据权利要求9的药物组合物，其中所述肿瘤细胞选自CTV-I细胞、MV4-11细胞、 SEM细胞，其组合，以及其亚系。
11.根据任意前述权利要求的药物组合物，其中所述NK细胞在保存后且在不存在任何活化剂时显示出持久的活性。
12.根据任意前述权利要求的药物组合物，其中所述活化的NK细胞被保存超过12小时。
13.权利要求12的药物组合物，其中所述活化的NK细胞被保存超过M小时。
14.任意前述权利要求的药物组合物，其用于不共施用(无论同时、分别还是顺次)活化剂而施用。
15.用于刺激有需要的患者中内源性NK细胞活性的方法，所述方法包括1)获得包含自体和/或同种异基因性NK细胞的外源细胞群，2)用包含CD15+LAK-抗性肿瘤细胞的活化剂活化所述NK细胞，3)在基本上不含活化剂的药学上可接受的介质中制备活化的NK细胞用于施用，和4)向所述患者施用活化的NK细胞而不同时或顺次施用活化剂。
16.权利要求15的方法，其中所述患者是携带肿瘤的患者，并且所述内源性NK细胞活性是抗肿瘤活性。
17.权利要求15的方法，其中所述活化的NK细胞是在活化之后和向所述患者施用之前保存的。
18.权利要求17的方法，其中所述活化的NK细胞在保存之中和/或之后保持基本上不含活化剂。
19.根据权利要求18的方法，其中所述保存是冷冻保存。
20.根据权利要求15-19中任一项的方法，其中所述活化的NK细胞被进一步表征为 CD69+CD25+CD16 CD15+ 的 NK 细胞。
21.活化的NK细胞群，其基本上不含活化剂并用于治疗性应用而不共施用(无论同时、分别还是顺次)活化剂。
22.权利要求21的细胞群，其是经保存的，例如经冷冻保存的。
23.权利要求21或权利要求22的细胞群，其中所述细胞具有权利要求2中或权利要求2与权利要求3的组合中所述的特征；和/或所述细胞群包含如权利要求5-8之一或其组合中所定义的NK细胞；和/或经保存的活化的NK细胞可通过使用权利要求9或权利要求10的活化剂而获得。
24.权利要求21-23中任一项的细胞群，用于治疗癌症。
25.用于制造可输注制剂形式的即用药物的方法，其中所述制剂基本上不含用于活化 NK细胞的试剂，所述方法包括融化基本上不含活化剂的、冷冻保存的活化的NK细胞，所述制剂用于不共施用(无论同时、分别还是顺次)活化剂而治疗癌症。
全文摘要
本申请公开了在不存在活化剂时显示出持久且延长的活性的活化的NK细胞，并且所述细胞在保存后保持其活化的状态。向患者施用所述NK细胞的方法不需要共施用活化剂，并且因此，包含所述NK细胞的药物组合物可保持基本上不含活化剂，例如CD15+LAK_抗性肿瘤细胞。
文档编号C12N5/0783GK102575230SQ201080035955
公开日2012年7月11日 申请日期2010年7月9日 优先权日2009年7月10日
发明者马克·洛戴尔 申请人:马克·洛戴尔