专利名称：基因序列分析的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸分析和基因的碱基序列分析的方法，具体涉及基因序列分析、基因多型分析、基因变异分析和基因表达分析的方法。
背景技术：
在DNA的碱基序列的确定中，使用凝胶电泳和荧光检测的方法被广泛应用。在该方法中，首先制备许多想要进行序列分析的DNA片段的拷贝。以DNA的5'末端作为起点制备各种长度的荧光标记片段。此外，预先加入根据这些DNA片段的3'末端的碱基种类而波长不同的荧光标记。通过凝胶电泳识别1个碱基差异的长度差，检测每个片段组产生的发光。由发光波长颜色而获知测定中的DNA片段组的DNA末端碱基种类。由于DNA从短的片段组开始依次通过荧光检测部，所以可以通过测量荧光颜色而自短的DNA开始依次获知末端碱基种类。由此进行序列确定。这样的荧光式DNA序列测定仪正在广泛地普及，另外，在人类基因组的分析中也非常活跃。在该方法中，公开了使用许多根内径50 μ m左右的玻璃细管，进一步利用末端检测等方法，增加每台的分析处理数的技术。另一方面，利用以焦磷酸测序法为代表的分步的化学反应的序列确定法(例如专利文献1和非专利文献幻，由于处理的简便性而受到关注。
图13(1)是表示其工序的例子。 概要如下。使引物杂交至作为靶物质的DNA链，顺次将四种互补链合成核酸底物(dATP、 dCTP、dTTP、dGTP) —种一种地加入到反应液中，进行互补链合成反应。图13(1)中，连接于引物的3'末端的核酸底物是与靶物质上的碱基C131互补的dGTP。由此，在其他的核酸底物(dATP、dCTP、dTTP)中不发生延长。加入到反应溶液中、没用于延长的核酸底物，经以腺苷三磷酸双磷酸酶为代表的核酸底物分解酶而被分解。如图13(1)的dGTP注入时那样，如果发生互补链合成反应则DNA互补链延长，生成作为副产物的焦磷酸(PPi)。此时的反应式示于图130)。焦磷酸通过共存的酶的作用而转化为ATP，在荧光素和荧光素酶的共存下反应，产生发光(生物发光)。如果图示每次各底物注入的发光，以图14作为例子。通常，使用该发光曲线，通过分析每次加入的核酸底物时产生的发光，获知加入的互补链合成底物是否被并入DNA链， 并且获知互补链的序列信息并因此获知成为靶物质的DNA链的序列信息。已知作为1种互补链合成核酸底物，dATP与作为生物发光底物的ATP具有类似的结构，因此作为荧光素酶的底物而起作用。这成为背景发光信号，使得检测灵敏度降低。 作为对策，Nyren等人公开了利用dATP的类似物、具体为dATP α S来代替dATP (专利文献 1)。上述Nyren等人的方法减少了焦磷酸测序法中的背景发光，为提高分析时的发光检测性能做出了贡献。但是，使用含有dATP α S的核苷酸α -硫代三磷酸类似物的方法也有缺点。缺点之一是磷酸基部分的Rp异构体引起的酶活性抑制。Nyren等人对此进行了详细地公开(专利文献3和非专利文献2)，Rp异构体可能抑制聚合酶活性，并且Rp异构体不能被腺苷三磷酸双磷酸酶分解。作为对策，Nyren等人公开了首先仅对Sp异构体进行精制而利用的技术。另外，剩余的Sp异构体被腺苷三磷酸双磷酸酶分解为核苷酸α-硫代一磷酸类似物，此后，当其中的一部分通过酶被再合成为核苷酸α -硫代三磷酸类似物时， Sp/Rp异构体的合成确定是各50%，因此针对Rp异构体合成累积的问题，通过碱性磷酸酶分解Rp异构体并除去。Nyren等人公开了可以通过该方法避免由于Rp异构体引起的聚合酶延长抑制。进一步地，Eriksson等人公开了作为用于代替dATP的核酸底物，使用7-脱氮-2-脱氧腺苷三磷酸(C7dATP)的方法(非专利文献幻。C7dATP是将腺嘌呤基的7位氮替换为碳后的物质。因此，三磷酸结构与dATP相同，容易被腺苷三磷酸双磷酸酶分解。艮口， 与作为现有技术的核苷酸α -硫代三磷酸类似物不同，不存在被考虑为酶抑制的主要因素的光学异构体。由此，Eriksson等人公开了可以没有酶抑制的核酸序列分析。另一方面，虽然在由焦磷酸生成ATP的反应中使用APS，但这也成为荧光素酶反应的底物，产生背景发光。因此，为了高灵敏度地实施碱基序列确定，期望不使用APS的方法。 作为使之成为可能的方法，公开了使用酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的逆反应，利用AMP和 PPi合成ATP的反应的碱基序列确定法(专利文献4)。由于没有使用在现有技术中被指出作为背景发光成分的APS，该方法可以显著地减少背景发光，实现高灵敏度的检测。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开小册子第98/13523号专利文献2 国际公开小册子第98/28440号专利文献3 日本特表2004-5080M号专利文献4 日本特开2007-97471号非专利文献专利文献1 =Anal. Chem. 72 15，3423-3430，2000专利文献2 :Anal. Biochem. 301，82-90，2002专利文献 3 :Nucleosides，Nucleotides & Nucleic Acids, 23 10，1583—1594， 2004。
发明内容
发明要解决的技术问题如上所述，在现有的焦磷酸测序法中，实质上必须使用含有dATP α S的核苷酸 α -硫代三磷酸类似物。但是，使用含有dATPa S的核苷酸α _硫代三磷酸类似物的缺点也逐渐变得明了。如上所述，其中之一是核苷酸α -硫代三磷酸类似物的Rp异构体抑制聚合酶活性，Nyren等人提出了对策。其中，仅精制Sp异构体而利用dATPa S(以下，Sp-dATP a S)。另一方面，来自于本发明人等的研究表明在使用Sp-dATP a S的核酸延长反应中，核酸底物向DNA的3'末端并入的效率差，本来应该并入的核酸底物没有并入，在互补链合成中，产生了一部分DNA互补链分子没有延长(延长未完)这样的问题。这一部分DNA 分子的未延长的发生，特别是在分析对象中含有T的连续碱基即Poly (T)区域的情况下，导致读取碱基长度的缩短等分析准确度的降低。由此可知，必须降低未延长率。
此外，关于使用C7dATP的技术，本发明人等的研究确认由于C7dATP和ATP的相似性高，C7dATP作为荧光素酶的底物而起作用。因此可以确定，将C7dATP应用于焦磷酸测序法中时，使碱基延长反应的检测灵敏度大大降低。因此，本发明的技术问题是提供一种核酸底物，其具有与dATP相当的核酸底物特性，对于荧光素酶的底物性低，对于互补链合成等酶反应没有不良影响，特别适用于焦磷酸测序法。用于解决技术问题的手段本发明人等不使用dATP的类似物(含有dATP α S的核苷酸α -硫代三磷酸类似物)，而新合成将dATP的腺嘌呤替换为其它的嘌呤异构体后的物质来使用。即，在保留有利于形成氢键的6位氨基结合的结构的条件下，新合成替换为其它的嘌呤异构体的物质， 选定不容易成为荧光素酶的底物，可以用于序列分析的物质。结果发现作为对应于模板核酸试样的碱基T (胸腺嘧啶)的互补核酸底物，通过使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的 7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸，可以解决上述技术问题。即，本发明包含以下技术方案。(1) 一种核酸分析方法，其包含如下工序将核酸试样作为模板，加入对应于碱基 AGTC的互补核酸底物进行互补链合成的工序；由在该互补链合成中生成的焦磷酸借助酶而生成ATP的工序；以及检测由荧光素酶反应产生的化学发光来判断互补链合成的有无的工序；作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。(2)根据(1)记载的核酸分析方法，其中，作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用经由亚乙烯基(ethenyl) (C-C双键)、亚乙基(ethylene) (C-C单键)或亚乙炔基(ethynyl) (C-C三键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。(3)根据( 记载的核酸分析方法，其中，作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用经由亚乙烯基(C-C双键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。(4)根据(1) (3)中任意一项记载的核酸分析方法，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基团的取代基。(5)根据(4)记载的核酸分析方法，其中，芳香族基团是碱性芳香族基团。(6) 一种对应于碱基T的互补核酸底物试剂，其含有嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。(7)根据(6)记载的试剂，其中，含有经由亚乙烯基(C-C双键)、亚乙基(C-C单键)或亚乙炔基(C-C三键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸
三磷酸。(8)根据(7)记载的试剂，其中，含有经由亚乙烯基(C-C双键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。(9)根据(6) ⑶中任意一项记载的试剂，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基团的取代基。(10)根据(9)记载的试剂，其中，芳香族基团是碱性芳香族基团。(11)选自以下式子表示的化合物的化合物
权利要求
1.一种核酸分析方法，其包含如下工序将核酸试样作为模板，加入对应于碱基AGTC的互补核酸底物进行互补链合成的工序，由在该互补链合成中生成的焦磷酸通过酶而生成ATP的工序，以及检测由荧光素酶反应产生的化学发光来判断互补链合成的有无的工序；作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
2.根据权利要求1记载的核酸分析方法，其中，作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用经由亚乙烯基(C-C双键)、亚乙基(C-C单键)或亚乙炔基(C-C三键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
3.根据权利要求2记载的核酸分析方法，其中，作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用经由亚乙烯基(C-C双键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
4.根据权利要求1 3中任意一项记载的核酸分析方法，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基团的取代基。
5.根据权利要求4记载的核酸分析方法，其中，芳香族基团是碱性芳香族基团。
6.一种对应于碱基T的互补核酸底物试剂，其含有嘌呤基的7位被取代基修饰后的 7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
7.根据权利要求6记载的试剂，其中，含有经由亚乙烯基(C-C双键)、亚乙基(C-C单键)或亚乙炔基(C-C三键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
8.根据权利要求7记载的试剂，其中，含有经由亚乙烯基(C-C双键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
9.根据权利要求6 8中任意一项记载的试剂，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基团的取代基。
10.根据权利要求9记载的试剂，其中，芳香族基团是碱性芳香族基团。
11.选自以下式子所示化合物的化合物
12.以下式子表示的化合物
13.用于焦磷酸测序法中的权利要求6 10中任意一项记载的试剂。
全文摘要
本发明提供了一种核酸底物，其具有与dATP相当的核酸底物特性，对于荧光素酶的底物性低，对于互补链合成等酶反应没有不良影响，特别适用于焦磷酸测序法。作为与碱基T互补核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸代替核苷酸α-硫代三磷酸的类似物。
文档编号C12Q1/68GK102471364SQ201080035929
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月10日 优先权日2009年8月14日
发明者桑原正靖, 梶山智晴, 神原秀记 申请人:国立大学法人群马大学, 株式会社日立制作所