专利名称：一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用。
背景技术：
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种革兰氏阴性菌,能够感染多种水产动物,包括鱼类、虾类、贝类等。鳗弧菌感染可导致弧菌病，该病是世界流行性疾病，可发生在任何季节，多年来给世界产业养殖造成了严重的经济损失。基因组序列分析表明，鳗弧菌基因组含有多个鞭毛蛋白基因，分别编码鞭毛蛋白FlaA，FlaB，FlaC，FlaDjPFlaE。研究表明，突变FlaA7FlaD和FlaE基因可降低细菌的侵染能力，而突变FlaB和FlaC对于细菌侵染没有显著影响，由此推测FlaA，FlaD和FlaE可能参与细菌毒力。目前鳗弧菌鞭毛研究主要集中于致病性，鞭毛蛋白作为疫苗的可能性研究尚未开展起来。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗，以鳗弧菌为模板，F1/R1为引物所得PCR扩增产物与载体PET259连接，连接转化后质粒经裂解与佐剂混合，即得到利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗；所述引物为Fl :5’ -CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’ ；R1 :5’ -CCCGGGACCCAATAGACTAAGAGCT-3，。所述模板为鳗弧菌C312 ;鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 6250，保藏日期2012年6月21日，分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum),保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。以鳗弧菌为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pET259连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α筛选质粒，而后加入裂解液纯化离心后上清液稀释后与佐剂等体积混合，即得到利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗。利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗的应用，:所述疫苗作为抵御鳗弧菌侵染的疫苗药物。本发明具有如下优点本发明的重组鳗弧菌鞭毛蛋白作为亚单位疫苗具有高效的免疫保护效应。
图1为本发明实施例提供的纯化的鞭毛蛋白电泳图(泳道2)。泳道1，分子量标准。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
实施例1
鳗弧菌鞭毛蛋白表达载体的构建方法
质粒pEFBl的构建以鳗弧菌为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增鳗弧菌鞭毛蛋白FlaB基因(该基因序列已被报道。具体参见Naka H，Dias GM, Thompson CC, Dubay C，Thompson FL, Crosa JH. Complete genome sequence of the marine fish pathogen Vibrio anguillarum harboring the pJMl virulence plasmid and genomic comparison with other virulent strains of V. anguillarum and V.ordali1.1nfect Immun2011 ;79:2889 - 900)。PCR 条件为94。C60s 预变性模板 DNA,然后 94。C40s，50。C60s，72。C60s, 5 个循环；然后 94。C40s，62。C60s, 72° C60s, 25 个循环后再在72° C延伸反应IOmin。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。
将载体pET259 (pET259 构建过程参见 Zheng, ff . J.，Hu, Y. H.，Sun, L.，2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot (Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish.1mmunol. 28，829 - 836)用 Swa I 酶切后回收 5. 4kb 片段，将其与上述纯化的PCR片段用T4DNA连接酶于室温连接2 — 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒 pEFBl。
所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水；所述引物为 Fl :5’ -CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’ 和 Rl :5’ -CCCG GGACCCAATAGACTAAGAGCT-3，。
所述作为模板的鳗弧菌可为现阶段诸多种类的鳗弧菌；特别为鳗弧菌C312，该鳗弧菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为=CGMCC No. 6250,保藏日期 21012. 6. 21,分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。
实施例2
鞭毛蛋白的诱导表达和纯化将上述的质粒pEFBl用常规方法转化大肠杆菌 BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑取一个转化子，将其命名为BL21/pEFBl。将BL21/pEFBl 于含有卡那霉素(30ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取Iml过夜后的培养液，加入 IOOml新鲜的含有卡那霉素(30ug/ml)的LB液体培养基中，于37° C下转速200rpm摇动培养至OD6tltl为0. 6，加入终浓度为0. 3mM的IPTG，30°C继续以转速160rpm摇动培养5_6h， 而后以5000g，4° C离心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1_2 小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4° C离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用His Trap HP Columns (购于美国GE Healthcare公司)回收纯化,纯化的蛋白经 SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25 — 30min,随后15v/cm电压下电泳2-2. 5h)，测定其分子量大小(参见图1)。将纯化的蛋白经质谱分析，证实其为具有FlaB序列的鞭毛蛋白。所述裂解液为终浓度的IOmM NaH2PO4, IOmM Tris和8M尿素，pH8. O。
实施例3
鞭毛蛋白作为疫苗的应用
步骤I)佐剂及疫苗混合液的制备。
佐剂制备将5% (质量比)NaOH和5% (质量比)Al2 (SO4) 3以2 :5体积比混合，将混合物以10，OOOg离5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至O. 2mg/ml。
疫苗混合液制备将上述实施例纯化的疫苗蛋白在I3BS中稀释至300ug/ml ;将稀释后的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。佐剂对照液制备将PBS与佐剂等体积混合。所述 PBS 组成成分按重量百分比计0. 8% NaCl, O. 02% KCl, O. 358% Na2HPO4. 12H20, O. 024% NaH2PO4，余量为水。
步骤2)疫苗的免疫应用。将60条牙鲆(每条重约12. 7g)随机分为2组，每组30 条。将这2组分别命名为A和B组。将A组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤I)的疫苗混合液，将B组的每条鱼分别腹腔注射IOOu I上述步骤I)的佐剂对照液。
步骤3)鳗弧菌悬液的制备。在LB培养基中培养鳗弧菌C312至OD6tltl为O. 8，然后离心(5000g，4° CMOmi η。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5xl06cfu/ml。
步骤4)疫苗免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3) 的鳗弧菌悬液腹腔注射步骤2)的2组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，6条；B组 ，27 条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)
RPS=100x(l —免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
根据此公式算出疫苗的免疫保护效率为78%。因此，所得疫苗能够高效地保护牙鲆抵御鳗弧菌侵染。
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1.一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗，其特征在于以鳗弧菌为模板，F1/R1为引物所得PCR扩增产物与载体pET259连接，连接转化后质粒经裂解与佐剂混合，即得到利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗；所述引物为 Fl :5’ -CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’；R1 :5’ -CCCGGGACCCAATAGACTAAGAGCT-3，。
2.按权利要求1所述的利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗，其特征在于所述模板为鳗弧菌C312 ;鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 6250，保藏日期2012年6月21日，分类命名为鳗弧菌(Vibrioanguillarum)。
3.按权利要求1或2所述的利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗，其特征在于以鳗弧菌为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pET259连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α筛选质粒，而后加入裂解液纯化离心后上清液稀释后与佐剂等体积混合，即得到利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗。
4.一种权利要求1所述的利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗的应用，其特征在于所述疫苗作为抵御鳗弧菌侵染的疫苗药物。
全文摘要
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用。以鳗弧菌为模板，F1/R1为引物所得PCR扩增产物与载体pET259连接，连接转化后质粒经裂解与佐剂混合，即得到利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗；所述引物为F15’-CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’；R15’-CCCGGGACCCAATAGACTAAGAGCT-3’。本发明的疫苗对鳗弧菌的免疫保护效率达78%。
文档编号A61P31/04GK102988968SQ201210371870
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者孙黎, 贾盼盼 申请人:中国科学院海洋研究所