茎部加速的等温核酸扩增技术的制作方法

专利名称：茎部加速的等温核酸扩增技术的制作方法
茎部加速的等温核酸扩增技术本专利申请主张申请日为2009年6月15日的英国专利申请GB0910302. 9的优先权，该英国专利申请的全部内容通过引用结合于此。
技术领域：
本发明涉及ー种核酸扩增技木，尤其涉及ー种方法，该方法改善了测试样本的快速和特异扩增及检測。
背景技木在许多研究和诊断领域中，核酸扩增技术(NAAT)都是ー种非常宝贵和强大的エ具。核酸扩增技术能够以较高的灵敏度和特异性对样本中的核酸进行检测和量化，并且能够对样本中的核酸进行量化分析。核酸扩增可用来确定样本中是否存在特定的模板核酸，这可以通过执行特定的核酸扩增技术之后是否存在扩增产物来判断。相反，如果不存在任何扩增产物，则表明样本中不存在模板核酸。这些技术在诊断领域中至关重要，比如用来确定样本中是否存在病原体。现有技术中具有许多用于核酸扩增的热循环和等温技木。热循环技木，比如聚合酶链式反应(PCR)通过温度循环来促进不断重复的DNA合成循环，从而导致合成了数量与模板核酸的原始数量成一定比例的大量新的DNA。已经形成了许多并不依赖热循环来促进扩增反应的等温技木。已经形成了用于不涉及RNA-合成步骤的扩增反应的等温技木，这些等温技术使用具有链置换活性的DNA聚合酶。类似地，对于涉及RNA合成步骤的扩增反应而言，已经形成了等温技术，这些等温技术可以使用逆转录酶、核糖核酸酶H和/或依赖DNA 的 RNA 聚合酶(參见比如 Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-Areview. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids,第 27 卷，2008 年 3 月第 3 期，第224-243 页)。通常将通过所采用的扩增技术生成的多核酸称为扩增子。所产生的扩增子的特性针对所进行的核酸扩增技术具有较大差异。例如，核酸扩增技术比如聚合酶链式反应可能产生尺寸和序列实质上相同的扩增子。而另ー些核酸扩增技术可能产生尺寸差异较大的扩增子，其中，这些扩增子由不同数量的重复序列组成，因此扩增子是不同长度的串联体的集合。这些串联体中的重复序列反映了多核酸的序列，该多核酸是所执行的实验的对象。鉴于核酸扩增技术在许多领域中比如诊断领域中具有相当的重要性，因此，业界仍然有提供速度、灵敏度及特异性得到改善的核酸扩增技术的需求。本发明提供一种简单及成本效益划算的方法来改善速度、灵敏度及特异性。此外，本发明具有有益效果通过本发明方法实现的速度増加能够抵消序列依赖性问题所导致的扩展速度的减小，这些序列依赖性问题导致针对特定核酸扩增技术的引物设计变得次优化。这种速度増加可进ー步降低基于特定核酸扩增技术的实验成本，因为可以不必使用其他成本较高的増加扩增速度的方法。
具体实施方式本发明提供ー种改进的多核酸扩增方法因此，在一个实施例中，本发明提供ー种合成多核酸的方法，该方法包括如下步骤a)提供包括至少第一和第二交互引物结合区的目标模板；b)提供包括第一和第二片段的第一引物，其中所述第一片段实质上与所述模板上的第一交互引物结合区互补，并且所述第二片段包括序列，该序列实质上与第一引物中的另ー个区域或第一引物的第一片段所生成的扩增子中的ー个区域互补，从而使得第二片段能够形成环状物；c)提供包括第一片段及可选的第二片段的第二引物，其中所述第一片段实质上与模板上的第二引物结合区互补，并且所述可选的第二片段包括序列，该序列实质上与第二引物中的另ー个区域或第二引物的第一片段所生成的扩增子中的ー个区域互补，从而使得第二区域能够形成环状物；d)提供至少ー个引物，其能够与第一和第二交互引物结合区之间的区域结合；e)提供合成所述多核酸所必须的试剂和条件；f)执行多核酸的合成。本发明的潜在原理是已经惊奇地发现提供一个或多个“茎部引物”，即，与正向交互引物结合区和反向交互引物结合区之间的区域结合的引物，能够显著增强一定的核酸扩增技术的速度和灵敏度。“正向交互引物结合位点”及“反向交互引物结合位点”指的是模板DNA和/或扩增子上正向和反向交互引物结合于其上的区域。文中使用的术语“交互引物”指的是两个或更多引物，这些引物用于划定在扩增过程中指数级扩增的原始模板多核苷酸区域的边界(參考图Ia和lb)。在一些实施例中，额外的引物可以结合到正向交互引物和/或反向交互引物的区域5’中。在使用这些额外弓丨物的情况下，正向交互弓丨物结合位点和/或反向交互引物结合位点可以包围这些额外引物的结合区及交互引物自身的结合区。比如在ー些实施例中，该方法可以使用结合到位于正向和/或反向交互引物结合区的区域5’上的ー个或多个额外引物。比如，国际专利申请W00028082揭露了这种方法，该专利申请揭露了 “置换弓丨物”或“外部引物”的使用。国际专利申请W00028082描述了用于形成环状物的引物(LFP)的使用。可以将形成环状物的引物理解为包括第一和第二片段。其中，第一片段实质上与模板上的引物结合区互补，并且第二片段包括序列，该序列实质上与第一引物的第一片段生成的扩增子中的区域互补，从而使得第二片段能够形成环状物。并且提到除了使用形成环状物的引物之夕卜，核酸扩增技术还使用了两个“外部引物”。这些引物的特征在于“第一外部引物”将3’结合到模板中的“F2”位点(即，第一外部引物与“F3”位点结合，參考图14b)，而“第二外部引物”将3’结合到第二个形成环状物的引物的结合区“ R2c”位点(即，第二外部引物结合到“R3c”位点，參考图14b)。因此，这些引物并没有在扩增子的茎部区域内结合，其位于形成环状物的引物的引物结合位点的5’上。正向和反向交互引物结合区之间的区域表示用于确保形成扩增子的一部分但通常自身并没有提供任何引物结合位点的区域。在文中将该区域称为扩增子的“茎部引物”。在文中，将结合到颈部区域的引物称为“颈部引物”(參考图lc、图2a_2e)。可以将茎部引物定义为结合到茎部区域的引物。也可以将这些茎部引物进ー步定义为结合到正向链的正向交互引物结合区的区域3’上和结合到反向链的反向交互引物结合区的区域3’上的引物。可以理解交互引物结合位点与茎部引物的结合位点没有明显地重叠。优选地，交互引物结合位点与莖部引物的结合位点完全没有重叠。描述引物结合区的重叠程度时使用的词语“明显地”指的是引物结合位点的重叠少于10个核苷酸,少于9个核苷酸,少于8个核苷酸,少于7个核苷酸,少于6个核苷酸,少于5个核苷酸,少于4个核苷酸,少于3个核苷酸,少于2个核苷酸,或者少于I个核苷酸。优选地，上述引物结合位点完全没有重叠。可以将茎部引物仍然进一步定义为结合到正向链的正向交互引物结合区的区域3’上和结合到反向链的反向交互引物结合区的区域3’上 的引物，但是引物结合区并没有显著地与作为特定的核酸扩增技术所采用的引物尤其是用于形成环状物的引物(LFP)的直接结果而生成的分子内的ニ级结构重叠(參考图Id)。已经惊奇发现使用茎部引物显著地増加了扩增速度。其明显优点是比如诊断测试，可以在更短时间内形成测试結果，即诊断测试用户的共同数值。快速扩增的另ー个好处是可减小假阳性结果的可能性，进而可以增加测试的特异性。本申请发明人的经验是随着扩增所需时间的増加，采用了链置换聚合酶的核酸扩增技术逐渐变得倾向于非特异扩増。因此，快速扩增也可以导致结果更精确。茎部引物不仅提供了更快速的扩增，而且提供了至少两点关键好处。第一，使用茎部引物増加核酸扩增技术的扩增速度，比如増加环介导等温扩增(LAMP)、模板重引发扩增(template re-priming amplification, TRA)、自扩张扩增(self-extendingamplification, SEA)和智能扩增过程(smart amplification process, SMAP)的扩增速度(将在下文中讨论)避免了使用昂贵的替代物来实现速度更快的扩增，比如使用更多的聚合酶或更多的脱氧三磷酸核苷(dNTP)。比如在2009年的价格中，LAMP反应中的Bst DNA聚合酶的数量加倍导致实验成本増加了 60%，脱氧三磷酸核苷的数量加倍导致实验成本增加20 %，然而增加两个茎部弓I物仅仅导致实验成本増加4 %，因为引物通常并不贵。第二，茎部引物为给定目标模板的引物选择提供了更大灵活性。比如，为了检测核酸序列具有显著差异的特定ー组病原体，将会把引物设计在病原体族基因组中显示的序列差异最小的区域上。然而，这可能需要将ー个或多个引物放置在非优化位点上。这对NAAT比如LAMP形成一定问题(将在下文中讨论)，因为在此，最多6个不同引物的位置需要按照一定的形式调整。由于茎部引物的放置位置可以与NATT中使用的其他引物的放置位置大大不同，因此可以使用特定目标模板中的茎部引物结合位点，否则将难以使用茎部引物结合位点。实际上在通常情况下，使用茎部引物允许将LAMP (或SMAP)方法中使用的其他引物省略棹。比如对于特定的目标模板，发现所谓的“置換引物”(即，在图14b、14c和14e中占据位置R3、F3的引物)中的其中ー个引物的优化结合位点很困难，并且结果是测试性能受到不利影响。然而，如果目标模板上具有适当的茎部引物结合位点的话，则增加茎部引物可以恢复置換引物的缺乏所引起的性能损失(參考图19)。可以将该原理简单地应用到LAMP或SMAP中所采用的某些其它引物中。本发明方法可以通过任何NAAT得到实施，只有该NAAT导致形成了串联体。文中使用的术语“串联体”指的是多核酸，该多核酸具有实质上类似的核苷酸序列，这些核苷酸序列在单链中交替链接。这些排列后的序列可以是相互之间的简单重复、反向重复或其组
ム
ロ O适于生成串联体的NAAT已为业界所熟知，并且通常包括“等温”扩增技木。这意味着与已知的热循环技术比如聚合酶链式反应相反，多核酸的扩增不需要培养温度的变化。ー些等温扩增技术依赖于作为扩增过程一部分的转录，比如基于核酸序列的扩增(NASBA，參见美国专利5409818)和转录介导扩增(TMA，參见美国专利5399491)，而其他等温扩增技术则依赖于螺旋酶或重组酶的作用，比如依赖于螺旋酶的扩增(HAD ； W02004027025)和重组酶聚合酶扩增((RPA ;W003072805)，而其他等温扩增技术则依然依赖于一定的DNA聚合酶的链置换活性，比如链置换扩增(SDA ；US5455166)、环介导等温扩增(LAMP ；W00028082, W00134790, W00224902)、嵌合体置换反应(RDC ;W09794126)、滚环扩增(RCA ；Lizardi, P. Μ.等· Nature Genetics, (1998) 19. 225-231)、核酸的等温嵌合体扩增(ICAN;W00216639)、智能扩增过程(SMAP ;W02005063977)、线性等温多聚体扩增(LIMA;Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase,Hafner G. J. , Yang I. C. , Wolter L. C. , Stafford M. R. , Giffard P. M, BioTechniques,2001，vol. 30，no4，pp. 852-867)。以上方法同时描述于US6743605 (此后将其称为“模板重引发扩增”或TRA)及W09601327 (此后将其称为“自扩张扩增”或SEA)。这些NAAT的ー个特点是它们提供了通过单个引物或ー组引物的作用实现的多核酸的拷贝和通过单个或多个交互引物实现的再拷贝。从而能够成倍速度地生成原始多核酸的拷贝。当提及一般意义上的NAAT时，这有助于将该方法检测到的核酸的物理片段与该原始核酸制成的第一份拷贝区别开，与该原始核酸制成的拷贝的第一份拷贝区别开，与该拷贝的拷贝的其他拷贝区别开。为简明起见，将使用以下定义将来源于被分析的样本中的核酸称为“目标模板”(參考图3a);将实施的NAAT中的目标模板的第一份依赖于引物的拷贝称为“主扩增子”(參考图3a);将实施的NAAT中的主扩增子的第一份拷贝称为“第一代扩增子”(參考图3b);将第一代扩增子的进ー步的拷贝笼统称为“下一代扩增子”(參考图3c)。主扩增子、第一代扩增子及下一代扩增子都是总扩增子的子集。这是可能的双链扩增子包括上述子集的组合或由目标模板自身组成。此外，这也是可能的下一代扩增子与第一代扩增子相同。进ー步可能的是根据下一代扩增子生成与第一代扩增子相同的多核酸分子。本发明的主题涉及下一代扩增子，因为下一代扩增子提供了更进一歩的下一代扩增子传播机制，并且以提供了结果拷贝的进一歩再拷贝的方式传播。上述扩增子的子集通常具有不同特性。主扩增子可能具有不同长度，因为可以从所采用的特定NAAT中的引物所描述的核酸区域之外的第一引物位点拷贝得到目标模板。一般而言，NAAT的关键特征是提供ー种方法，该方法使得主扩增子可供所讨论的NAAT所采用的另ー个交互引物使用，从而能够生成第一代扩增子。主扩增子的依赖于引物的引发所形成的第一代扩增子将具有所使用的引物所描述的离散长度。同样，NAAT的关键特征是提供ー种方法，该方法使得第一代扩增子变得可用，以便被交互引物进ー步引发，从而生成下一代扩增子。同样，所讨论的NAAT的关键特征是提供ー种方法，以便进一歩再拷贝下一代扩增子。对于某些NAAT而言，下一代扩增子可能实质上与第一代扩增子不同，尤其是下一代扩增子可能是第一代扩增子的串联体。直接从线性目标模板产生串联体形式的扩增子的方法包括LAMP、TRA、SEA和SMAP (后者是LAMP和SEA的混合形式)。在每ー种情况下，串联体来自包括第一代扩增子的过程(參考图3b)。因此优选地，多核酸的合成过程通过来自以下小组的NAAT执行LAMP、TRA、SEA和SMAP。因此，在每种情况下，本发明涉及ー种NAAT，该NAAT提供了ー个或多个引物，这些引物具有直接从线性目标模板生成串联体的能力。RCA也可以生成串联体。然而在这种情况下，需要目标模板特定的探针连接，以便形成共价闭环DNA分子。因此，在没有任何交互引物的协助下或不要求任何包含第一和第ニ片段的引物的情况下，这种扩增子本质上将是串联体形式。其中，所述第一片段实质上与所述模板上的第一交互引物结合区互补，并且所述第二片段包括序列，该序列实质上与第一引物中的另ー个区域或第一引物的第一片段所生成的扩增子中的ー个区域互补，从而使得第二片段能够形成环状物。因此，RCA本身并不是本发明的主題。因此，LAMP、TRA、SEA和SMAP的共同特征是在第一代扩增子作为引物本身使用的情况下，分子内事件或分子间事件导致的依赖于第一代扩增子的引发导致生成了下一代扩增子(文中将使用该术语表示第一代扩增子的更进一歩的拷贝以及这些拷贝的拷贝，參考图3c)，该下一代扩增子的尺寸大于第一代扩增子并且本质上是串联体形式。事实上，这些NAAT的ー个特性是较短的扩增子生成了越来越长的扩增子，从而使得扩增过程中的茎部引物的结合位点的数量成倍増加，进而增强了茎部引物加快扩增速度的能力。理解引物在这些NAAT中生成串联体的作用机制有助于理解这些茎部引物的作用效果。此外，熟悉串联体生成机制的普通技术人员将容易想到其他可以在本发明方法中使用的适当NAAT。图4详细展示了 LAMP形成串联体结构的过程。可以预料到TRA方法通过相同的机制形成串联体形式的扩增子。事实上，图4b-4c展示了至少两种形成串联体的机制，一个是通过分子内的机制(图4b)，而另ー个是通过分子间的机制(图4c)。事实上，如图所示，从第一代和下一代扩增子的结构方面讲，两种机制具有相同结果(比较图4b(iv)与图4c (iv))。应当理解图4中仅仅结合正向交互引物结合区展示的流程可以均等地适用于反向交互引物结合区。此外，应当将上述流程理解为可以由下一代扩增子重复，从而可以形成越来越长的串联体。通过SEA生成的串联体基本上与LAMP和TRA生成的串联体一祥，区别在于引物自身内具有固有的必须的反向重复结构，而不需要多核酸上的引物扩张来形成反向重复结构(LAMP和TRA的情况)。图5a-5c展示了如同用于LAMP/TRA的用于SEA的对应机制。许多NAAT使用了在文中被称为“简单引物”的东西(图6a)。文中所使用的术语“简单引物”指的是实质上与多核酸上的引物结合位点互补的引物，并且该引物不含大量其他核苷酸，即与引物结合位点实质上互补的引物区域的核苷酸3’或5’。文中使用的术语“实质上”是指简单引物包含的额外核苷酸的数量少于20个，少于15个，少于10个或少于 5个。LAMP和TRA(lSMAP)中采用的引物在扩增子中产生单链环状物，因此将该引物称为“用于形成环状物的引物”(LFP)。文中使用的术语“LFP”是指包括第一个第二片段的引物，其中，所述第一片段实质上与所述模板上的引物结合区互补，并且所述第二片段包括序列，该序列实质上与第一引物的第一片段所生成的扩增子中的ー个区域互补，从而使得第二片段能够形成环状物。LFP的大致结构展示于图6b中。LFP导致的目标模板的引发所形成的第一代(和下一代)扩增子包含了单链多核苷酸环状物，并伴有反向重复序列的沃森-克里克碱基配对所形成的双链多核苷酸。可以理解单链多核苷酸环状物可以与所讨论的NAAT所采用的其他引物结合，但不会与茎部引物结合。图6c展示了 SEA(及作为SEA与LAMP的混合形式的SMAP)所采用的引物。可以看出这些引物在其5’端部包含随机的反向重复结构。因此，该引物导致的目标模板的引发所产生的第一代扩增子将形成紧密发卡环状物，该紧密发卡环状物将可能导致第一代扩增子自我引发(或引发(prime off)类似扩增 子)。在文中，将这种引物称为“发卡引物”。文中所使用的术语“发卡引物”是指包括第一和第二片段的引物，其中所述第一片段实质上与所述模板上的引物结合区互补，并且所述第二片段包括序列，该序列实质上与第一引物中的另ー个区域互补。发卡引物通常不提供位于第一代或下一代扩增子中的单链多核苷酸环状物，其可以供讨论中的NAAT所采用的其他多核苷酸结合。然而，本申请的发明人已经意识到能够提供发卡引物，其中，引物中的第二片段中的反向重复结构由接头区域分开。接头长度可以为至少10个核苷酸，至少15个核苷酸，至少20个核苷酸或至少30个、至少40个、至少50个或至少60个核苷酸。这种引物可以形成单链环状物，并且允许在扩增过程中结合额外的引物(參考图64和图8c)。在文中，将包含位于反向重复结构之间的这种接头的发卡引物称为“提供环状物的引物”(loop-providing primers, LPP)。这种引物没有见诸现有技术中，因此形成了本发明的优选特征。很明确，LAMP、SMAP和SEA使用能够在第一代扩增子中产生反向重复结构的引物，从而允许第一代扩增子的分子内引发。结果是，第一代扩增子拷贝了自身的一部分(section)，因此形成了串联体。在TRA中，则上述机制不明显。不过，TRA确实生成了串联体，并且可能通过与LAMP相同的机制生成了串联体(參考例子I及相关的附图7)。上述分子内的引发并不是可供这些方法中采用的引物使用以便生成串联体的唯一的机制，而是不论精确的机制如何，茎部引物的有益效果是明显的。正如针对LAMP、TRA和SMAP中使用的LFP以便进行第一代扩增子的分子内(參考图8a)或分子间(參考图Sb)自我引发所讨论的那样，结果形成的下一代扩增子使得单链区域可供使用，单链区域能够结合原始引物，该原始引物用于从目标模板生成扩增子。应当注意所形成的单链环状物的交互链能够结合下文中提到的“环状引物”。在SEA和SMAP中描述的发卡引物没有在扩增子中产生这种单链环状物。然而，如前所述，发明人已经认识到通过使用包含位于反向重复结构之间的接头区域的SEA引物的变体(图6d中展示的LPP)，发卡引物可以生成单链环状物，如图Sc所示。LFP及LPP能够生成稳定的扩增子单链区域的能力对于其他扩增子的快速传播至关重要，并且这种能力展示了采用这些引物的技术的关键特征。这意味着串联体形式的扩增子能够包含用于讨论中的NAAT所采用的引物的许多新的引发位点(priming site)。在LAMP和TRA(以及SMAP)中，在扩增子中生成反向重复结构的LFP也提供了扩增子的单链区域，这些单链区域自身能够结合到扩增子的单链区域，并且进而引起扩增子的进ー步再拷贝，从而加快了扩增。在LAMP及SMAP中，除了可以使用LFP之外，还可以使用其他额外的引物，这些引物(被称为环状引物)也结合到扩增子的这些单链区域，以便有助于进一歩加快扩增。本发明的ー个特性是茎部引物没有结合到LFP和/或LPP生成的稳定单链环状物，而是通过不同机制加快了扩增速度。对于LAMP、TRA和SEA(以及SMAP)而言，可以看出无论是否通过自我引发(不管是通过分子间方式还是分子内方式实现)、其他引物从扩增子的单链区域进行的结合和扩张进行的下一代扩增子的拷贝过程，还是通过其他引物与正向或反向交互引物结合区的结合动作进行的下一代扩增子的拷贝过程，都可以使得下一代扩增子的茎部区域瞬间变成单链结构。根据所显示的LAMP、TRA和SEA(及SMAP)机制，可以预料到通过其他扩增子的自我引发及再拷贝动作，或通过将引物结合到指向正向或反向交互引物结合区的引物的外露结合位点的动作，所述单链茎部区域将快速转换为双链多核苷酸。曾期望茎部区域瞬间转变为单链结构，而不是稳定地成为单链结构。未曾预料茎部区域提供有用的用于扩增的引物结合位点。然而，现在惊奇地发现指向茎部区域的引物实际上大大增加了扩增速度。将茎部引物结合到扩增子的机制展示于图9和10中。虽然期望茎部引物的动作作用于扩增子的再拷贝形成的瞬间外露的单链多核苷酸上，这是可能的其他机制也解释了通过茎部引物观察到的扩增子速度増加的原因。比如，在串联体结构中这是可能的正如在复制滑动过程中那样，多核苷酸的某个链可能“移除出去”。当从本质上讲，串联体形式的多核苷酸结构能够在重复序列之间形成ニ级结构的时候，这种可能性尤其明显。所生成的单链多核苷酸环状物可以提供比如茎部引物的结合位点。其他机制也可能解释茎部引物的效果，但是，茎部引物作用于串联体形式的多核苷酸序列是基本原理，可以将此看作本发明的共性。如前讨论，适当的交互引物可以包括第一和第二片段，其中，第一片段实质上与模板上的交互引物结合区互补。虽然已经參考第一引物详细解释了本发明的该特性，应当理解相同原理稍加变通即可应用于第二引物。术语“实质上互补”是指第一片段具有充足的互补性，以便在NAAT过程中的通用条件下能够结合到模板和/或扩增子上的交互引物结合区。这要求交互引物的第一片段相对于模板上的交互引物结合区具有至少70%、80%、90%、95%、99%或100%的互补性。交互引物的第一片段的长度可以为至少5个核苷酸，至少10个核苷酸，至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少40个核苷酸，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，甚至至少70个核苷酸。在交互引物进ー步包括第二片段的场合，第二片段包括序列，该序列实质上与第一引物中的另ー个区域或第一引物的第一片段所生成的扩增子中的ー个区域互补，从而使得第二片段能够形成环状物。“第一引物的第一片段所生成的扩增子”是指当聚合酶对第一引物扩张时产生的模板的第一份拷贝。该扩增子包括位于其5’端的第一引物的序列。在一些实施例中，第二片段与引物结合于其上的目标模板和/或扩增子上的ー个区域实质上相同。如前所述，将这种引物称为LFP。“实质上相同”是指第二片段与目标模板和/或扩增子上的所述区域之间具有至少70%、80%、90%、95%、99%或100%的一致性。同时可以想象到第二片段的仅仅一部分显示了与目标模板上的区域之间的实质上相同。不论是交互引物的第二片段的全部还是局部显示了与目标模板上的区域之间的实质上 相同，第二片段上与目标模板和/或扩增子上的区域实质上相同的区域的长度至少为5个核苷酸，至少10个核苷酸，至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少40个核苷酸，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，甚至至少70个核苷酸。根据本发明的该方面，一旦交互引物的第一片段被扩张而形成了第一扩增子，则第二片段能够结合到相同链中的交互区域上，并且因此形成了环状物。第二片段也可以包括ー个区域，该区域与第二片段中的另ー个区域实质上互补。如前所述，将这种引物称为发卡引物或提供环状物的引物。“实质上互补”是指第二片段中的两个区域相互之间具有至少70%、80%、90%、95%、99%或100%的互补性。优选地，互补区域的长度至少为5个核苷酸，至少10个核苷酸，至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少40个核苷酸，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，甚至至少70个核苷酸。当引物为发卡引物时，优选地，第二片段中的两个互补区域通过短的接头区域(即，少于10个核苷酸)分开，以便有助于将两个区域互相结合起来。接头区域的长度允许本领域中的普通技术人员将LPP与长度为至少10个核苷酸的接头区域或与具有长度小于10个核苷酸的接头区域的发卡引物区别开。引物的第一片段与第二片段可以通过接头区域连接起来。在一些实施例中，接头区域与该引物的第一片段实质上相同，以便允许一旦被拷贝，则能够将进一歩的 引物结合到接头区域的互补部分(图6d)。“实质上相同”是指第一片段与连接到引物的第一和第二片段上的接头区域之间的一致性至少为70%、80%、90%、95%、99%或100%。本发明方法可以通过相同种类的正向或和反向交互引物比如LFP或发卡引物来实施。当提及“相同种类的引物”时，该术语是指所有引物均是简单引物、LFP、LPP或发卡引物。因此，术语“不同种类的引物”是指两种或多种引物的组合，其中至少ー个引物与其他引物种类不同。比如，在使用4个交互引物的方法中，即3个LFP及I个LPP，则将认为这些引物是不同种类的引物。因此，可以想象到使用种类不同的正向和反向交互引物。比如，可以使用正向交互引物(比如LFP)并且结合使用反向交互引物(比如LPP或发卡引物)。将LFP或发卡引物与简单引物组合起来也是可行的，只要引物的组合导致形成了串联体。在用于扩增的NAAT采用多个(即2个或更多)正向和/或反向交互引物的情况下，将相同或不同种类的引物结合到相同的交互引物结合位点也是可行的。根据本发明的一方面，2个或更多正向和/或反向交互引物都是LFP。适当的引物组合对于本领域中的普通技术人员而言是显而易见的。比如，这对于本领域中的普通技术人员而言显而易见均为简单引物的正向和反向交互引物的组合可能不会提供用于形成串联体的机制，因此这种组合不适于在本发明中使用。一般而言，可以理解交互引物或多组交互引物作用于目标模板的不同链上。此夕卜，交互引物(或每组交互引物中的其中之一)将用于划定原始多核苷酸的拷贝和再拷贝的区域边界。因此，指数式扩增要求至少两个引物结合区之间的连接活动，即正向交互引物结合区与反向交互引物结合区之间的连接活动(图la)。正向和反向交互引物结合区中的每ー个可以包括用于引物的单个结合位点，在此，交互位点位于相对的有义链(sensestrand)上，即，一个引物结合位点位干“正向链”上，而另ー个引物结合位点则位干“反向链”上(如图Ia所示)。正向和反向交互引物区域也可以包括用于两个或多个引物的结合位点，其中，特定的NAAT采用2个以上的引物。在这种情况下，这是可能的正向和/或反向交互引物结合区中的2个或多个引物结合位点都位于目标模板和/或扩增子的相同链上，或位于目标模板和/或扩增子(或其拷贝，參考图Ib)的不同链上。本发明的茎部引物可以放置在正向和反向交互引物结合区之间的任何位置，只要茎部引物的结合位点没有与正向或反向交互结合位点明显地重叠即可。应当理解在采用LFP的情况下，在LFP为正向引物的情形中，正向交互引物结合区不仅包围F2位点(即，正向交互引物结合区)，而且包围Fl位点(S卩，实质上与LFP的第二片段相同的正向链上的区域)；在LFP为反向引物的情形中，反向交互引物结合区不仅包围R2c位点(B卩，反向交互引物结合区)，而且包围Rlc位点(S卩，实质上与LFP的第二片段相同的反向链上的区域，參考图Ie和图14)。通过这种方式，在采用2个LFP的情形中(如同LAMP和TRA的情形)，可以将茎部引物放置在Rl (c)与Fl (c)位点之间的任何位置；而在特定的NAAT中采用单个LFP的情形中，茎部引物可以结合到Rl (c)位点或Fl (c)位点的其中ー个与非-LFP占据的另ー个交互引物结合区之间。如图2a所示，仅仅采用一个与正向或反向多核苷酸链结合的茎部引物是可行的。或者，也可以使用2个或多个茎部引物，这些茎部引物可以结合到扩增子的交互链上(图2b)或结合到相同链上(图2d)。本发明方法可以通过I个、2个、3个、4个或更多个茎部引物得以实施，这些茎部引物可以通过任意空间组合的方式使用，并且这些茎部引物可以结合到正向或反向链上，只要茎部引物的结合位点没有明显地与正向或反向交互引物结合区重叠，或根本没有重叠(图2e)。茎部引物可以进ー步结合到茎部区域内的任何部位。因此，茎部引物可具有非常接近正向或反向交互引物结合区的结合位点(图2c)。术语“非常接近”是指茎部引物的结合区与交互引物结合区之间隔开不超过10bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp 或 IOOObp0根据本发明的茎部引物的长度可以为至少5个核苷酸，至少10个核苷酸，至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少40个核苷酸，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，至少70个核苷酸，至少80个核苷酸，或至少90个核苷酸。茎部引物可以为简单引物。然而，可以想象到可以使用其他茎部引物比如LFP、发卡引物、LPP、嵌合引物或其他衍生物。当使用多个茎部引物时，这些茎部引物可以种类相同，也可以为不同种类的引物的組合。当提及“相同种类的引物”时，该术语是指所有引物均是简单引物、LFP、LPP或发卡引物。因此，术语“不同种类的引物”是指两种或多种引物的组合，其中至少ー个引物与其他引物种类不同。比如，在使用4个交互引物的方法中，SP3个LFP及I个LPP，则将认为这些引物是不同种类的引物。因此，可以想象到使用种类不同的正向和反向交互引物。比如，所使用的茎部引物可以全部为简单引物，或者它们可以为简单引物、LFP和/或发卡引物的组合。事实上，可以想象到茎部引物可以在LAMP、TRA、SMAP或SEA的衍生物中采用茎部引物，这些衍生物使用目前采用的引物的许多引物变体，如图20所示。正如在本说明书中针对TRA和SMAP及其他文字描述的那样，“简单引物”、LFP、发卡引物、含有RNA的引物、含有切ロ酶位点的弓丨物与其他新颖引物的可能组合非常多，这些新颖引物可以在新颖组合中使用，以便生成在相应的NAAT方法中描述的衍生物。在这些组合形成能够生成串联体形式的扩增子的方法的情形中(所生成的串联体扩增子能够自我拷贝，从而生成更长的串联体)，可以预料到茎部引物也是适用的。比如，发明人已经注意到在LAMP中使用的置換引物(设计成在目标模板和主扩增子上运行，而不是在第一代扩增子或下一代扩增子上运行)的主要缺点是，如果在相关LFP结合并且扩张到目标模板之前，置換引物从其位点开始结合和扩展的话，则置換引物将阻塞并且阻止LFP的结合，LFP的结合对于指数级扩增是基本的，并且因而抑制扩增。发明人已经发现可以在一定程度上减轻这种效果，如果使用LFP作为置换引物(例子5，图15a-15b)，而不是使用用于置换引物的“简单引物”结构。这是令人信服的，因为LFP允许一定程度上的引物位点的重引发(如在与TRA技术有关的专利文献中描述的那样)，但更主要的是因为LFP能够作用于第一代和下一代扩增子，以及目标模板和主扩增子。在此，期望“简单”置换引物仅仅作用于目标模板和主扩增子。因此，在例子5中描述的该方法与茎部引物的使用一致。类似地，在ICAN和RDC中描述的嵌合引物可用作置換引物(而不是简单引物)，从而允许置换引物位点的重引发，进而减小了阻塞LFP结合位点的可能性。此外，由于茎部引物用于通过在正向和反向交互结合区中发生的连接过程来增加采用LFP的方法的扩增速度，并且由于现有文献中已经有这样的教导LAMP方法具有核苷酸数量的上限，核苷酸用于分开所采用的LFP的正向和反向交互结合位点(Notomi etal. Loop-meaiated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acias Research, (2000)Vol 28.，No. 12，e63)，因此，使用茎部引物可以明确地允许正向和反向交互结合位点在序 列中隔开的距离比先前预测的隔开距离更大(尤其是如果采用多个茎部引物)。这样的好处甚多，当希望证明序列的两个区域同时出现在多核苷酸上，但两个区域之间的距离隔得很远时，从而允许每个相应的区域有效地用作文中描述的NAAT中的正向和反向交互结合区。由于使用茎部引物允许正向和反向交互结合区比在没有它们的情况下隔开的距离更远，并且允许有效地扩增，因此多核苷酸上可以存在两个不同位点。因此，本发明提供ー种多核酸扩增方法，其中，正向和反向交互引物结合区隔开一定距离，从而使得仅仅在存在茎部引物的情况下才会合成多核酸。该距离可以通过并行执行两个单独的NAAT以实验方式确定，其中，所使用的NAAT、试剂和扩增条件相同，不同之处是将茎部引物添加到ー个反应过程中，而没有添加到另ー个反应过程中。当仅仅在存在茎部引物的情况下进行多核酸的合成时，可以认为交互引物结合位点位于一定距离处，从而仅仅在存在茎部引物的情况下进行多核酸的合成。比如，抗药性金黄色葡萄球菌(MRSA)中存在的mecA基因可与保守orfX序列隔开很大距离，保守orfX序列与SCCMec基因移动成分的插入位点相关联，而SCCMec基因移动成分与MRSA相关联(參考W002/099034)。使用茎部引物有助于通过允许将mecA基因和orfX序列作为扩增的交互结合位点使用而检测到MRSA，甚至即使交互结合位点在序列中相距太远而无法使用方法比如LAMP。因此，根据一方面，本发明提供一种检测样本中的MRSA的方法。茎部引物可以包含完全自然地形成的核酸。然而，也可以预想到使用包含改性碱基(modified base)的引物。这些改性碱基的例子包括但不限于N4-甲基胞卩密唳、肌苷、核糖核苷酸、突光碱基、光解碱基(photolysable base)或通用碱基(universal base)。也可以预想到使用标记有某个结构(moiety)的核酸，该结构允许检测茎部引物和/或标记的茎部引物结合于其上的扩增子。比如，可以对核酸进行荧光(fluorescently)标记。也可以借助捕捉结构(capture moiety)(比如生物素)对莖部引物进行标记。重要地，茎部引物并不直接对扩增子的指数级扩增负责(指数级扩增由结合到正向和反向交互引物结合位点的引物进行介导(mediated))，而是仅仅增加扩增速度。这是因为茎部引物被视为作用于特定的NAAT所采用的其他引物的扩增产物。因此，茎部引物的作用通过增加正向和反向交互引物介导的反应的扩增速度来发挥。这一点展示于图Ic中，从该图可以看出是茎部引物从目标模板引发和扩张，而目标模板的部分拷贝将仅仅包含正向交互引物结合区或反向交互引物结合区，而没有同时包含两者。因此，茎部引物生成的主扩增子将不允许交互拷贝，因此将不会对目标模板的指数级扩增有帮助(详细展示于图21中)。相同的分析适用于拷贝特定的NAAT采用的其他引物生成的主扩增子的茎部引物，并且类似地适用于第一代扩增子。如果下一代扩增子(即，第一代扩增子的进ー步拷贝(及这些进ー步拷贝的拷贝))本质上是串联体形式，则可以预料到茎部引物将明显地増加目标模板的扩增速度。茎部引物作用于串联体的要求根据这样的要求形成如果要求特定的多核酸对指数级扩增有助的话，则该多核酸必须包含能够作为正向和反向交互引物结合区使用的区域。可以从图21清楚地看出通过茎部引物进行的串联体结构的拷贝能够生成同时具有正向和反向交互引物结合位点的多核苷酸拷贝，而拷贝非串联体结构则不会具有上述效果。因此，发明人认为茎部引物的使用将对导致形成串联体的扩增方法有益处。现已发现茎部引物以连接的方式与NAAT中使用的其他引物互相作用，这种互相作用对于获得观察到的扩增速度的大幅増加至关重要。通过茎部引物观察到的扩增速度增加无法通过參加到另ー个并且独特的扩增过程中的茎部引物得以解释，在扩增过程中，通过ー个茎部引物产生的扩增子并没有用作特定的NAAT采用的所有其他引物的模板，以便对扩增子进行再拷贝。发明人通过实验和理论分析证实观察到的扩增速度的増加必须由单个的连接扩增(coupled amplification)过程实现,而不是由两个或多个独特的扩增过程实现(在此，一个过程产生的扩增子无法作为另ー个过程产生的扩增子的模板使用)。扩增技术TRA的扩增速度的显著增加的例子展示于例子2中(针对具有不同扩增动力学活动的多组引物)。在每种情况下，茎部引物显著地増加了扩增速度，并且在此过程中，増加了测试进行的时间范围内的测试灵敏度(图11)。因此，相对于没有添加茎部引物的控制反应，茎部引物可以将特定类型和数量的目标模板的检测时间减小至少I分钟，减小至少2分钟，减小至少3分钟,减小至少5分钟,减小至少10分钟，减小至少20分钟,减小至少30分钟或减小至少60分钟。已经描述了 TRA的表现(manifestation),比如使用单个引物连同LFP的TRA,在此，应当这样理解每个引物交互地结合到正向或反向交互引物结合区(US6743605)。在文中将这种组合称为非对称TRA或ATRA。因此，当将茎部引物添加到TRA中的时候，有人可能认为ー个实验中现在进行了三个独立的扩增过程，ー个是TRA，另外两个是ATRA扩增(图12a)。因此可能试图争辩茎部引物没有TRA自身的扩增速度，而是简单地将两个额外的ATRA扩增添加到同一个实验中了。然而，如果这是正确的话，则观察到的综合扩增速度将是TRA系统的扩增速度与两个ATRA系统的扩增速度之总和。然而，发明人已经说明了茎部引物的使用引起的扩增速度増加远远大于实质上互相独立的扩增系统可能预料到的速度之和。在例子3中，借助茎部引物和LFP的不同组合测量扩增速度。使用单个茎部引物和单个LFP的表现与ATRA均等。可以看出使用茎部引物和LFP的两个可能组合(即，两个ATRA的表现)的扩增速度具有极慢的动力学活动(图12b(i和ii))。当一起使用两个LFP时(即，TRA系统)，动力学活动快于两个ATRA系统(图12b (iii))。当结合使用茎部、引物和LFP时，扩增速度实质上快于先前的TRA或ATRA中任何ー个的表现(图12b(iv))。在展示了 ATRA动力学活动的快慢程度的情况下(记住扩增的指数级特性)，将图12b (iv)中所展示的扩增速度増加简单地推断为组合在一起的两个ATRA和TRA系统的反应速度的总和是不合理的。其中的潜在事实是茎部引物以连接的方式与指数级扩增中涉及的其他引物互相作用。再一次，这可以通过茎部引物对串联体的作用得到合理解释，串联体产生了扩增子的拷贝，该扩增子保留有正向和反向交互引物结合区。也可以对上述实验例子进行建摸。在例子4中，通过数学方法定义的扩增速度对三个独立的扩增过程进行建摸。模型的输出值为BART曲线(參考下文)。所使用的參数反映了发明人获得的用于等温NAAT的不同表现速度的结果范围。可以看出如果比如两个非常慢的扩增过程与非常快的扩增过程叠加起来，则无法观察到当将茎部引物添加到LAMP、LAMP+环状引物或TRA时观察到的那种明显加快的扩增类型(将图13a中的模型结果与例子2、3、5、6及7对应的附图ll、12b、15、16和17中展示的实验结果进行比较)此外，图13b (该图展示了将快速扩增过程与两个速度适度快的扩增过程叠加后的結果)显示即使 在这种条件下，也没有在模型中观察到使用茎部引物时看到的整体扩增的明显速度増加的类型。事实上，如图13c所示，即使将3个快速扩增过程叠加起来，整体的扩增速度仍然仅仅是稍微快于任何单个的过程这反映了扩增的指数级特性(与例子2、3、5、6及7对应的附图ll、12b、15、16和17进行比较)。已经通过多个等温NAAT证实了茎部引物所提供的扩增速度的増加。相对于特定NAAT中采用的其他引物可被利用的茎部引物的例子展示于图14a-14g。例子5、6和7展示了图14中示出的多个NAAT表现的实验数据。在每种情况下，都可以观察到明显的扩增速度増加(图15-17)。茎部引物在形成串联体的NAAT中的另ー个用处是作为探针，以便在荧光、化学发光、电化学或其他报告系统中作为用干“实时”追踪扩增程度的手段。相对于比如LFP或发卡引物，茎部引物作为包含探针的引物可能具有好处，因为其不需要在扩增子中产生可能影响一定类型的探针的反向重复结构。本发明中使用的目标模板可以为任何包括合适的交互引物结合区的多核酸，所述交互引物结合区允许所关注的多核酸的扩增。本领域中的普通技术人员将理解正向和反向交互引物结合位点需要以适当方式放置在目标模板上，从而将正向交互引物结合区域和反向交互引物结合区放置在序列上将分别在有义链和反义链上被扩增的5’上。目标模板可以为单链或双链结构。当目标模板为单链多核酸时，技术人员将理解初始时，目标模板将仅仅包括交互引物结合区。然而，第一引物的结合将引起互补链的合成，然后该互补链将包含第二交互引物结合区。目标模板可以来自RNA分子，在此情况下，在实施本发明方法之前，需要将RNA转录到DNA。适当的用于转录RNA的试剂为业界所知，并且包括但不限于逆转录酶。除了正向和反向交互引物结合区之外，目标模板还需要包括茎部区域，该茎部区域需要具有足够长度，从而允许本发明的一个或多个茎部引物的結合。因此，优选地，茎部区域的长度为至少5个核苷酸，至少10个核苷酸，至少15个核苷酸，至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少50个核苷酸，至少100个核苷酸，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸或至少500个核苷酸。
技术人员将知道除了扩增所需的引物之外，NAAT还需要进ー步的试剂，以便合成多核酸。本领域中的技术人员将会知道这种所需的试剂，并且通常包括合适的缓冲剂、dNTP、聚合酶等。技术人员将理解在添加了执行所讨论的NAAT所必须的所有组分之后，有必要提供合成多核酸所需要的合适条件。这可以通过比如提供合适的培养温度达成。优选地，扩增在等温条件下进行。这意味着在扩增过程中，温度保持恒定。“恒定”是指温度变化不超过±10°C。然而，在扩增过程中涉及到大于10°C的单次温度变化、大于10°C的两次温度变化、大于10°C的三次温度变化、大于10°C的四次温度变化或大于10°C的五次温度变化的方法也在本发明的范围之内。根据本发明的多核酸的扩增可借助本领域中的普通技术人员所知的方法检测。合适的方法包括但不限于荧光插入染料、荧光引物或探针的使用，測量浑浊度，电化学探针、生物发光信号和化学发光探针的使用。 可以借助实时方法检测多核酸的扩增，也就是在多核酸被扩增的同时能够进行检测的方法。这种检测系统的例子包括但不限于荧光(比如在扩增过程中加入的荧光探针)、生物发光信号和电化学探针。根据一方面，茎部引物自身可以借助可检测的结构进行标记，比如荧光标记物、化学发光标记物或电化学标记物，这些标记物允许对茎部引物结合于其上的扩增子进行检測。因此，茎部引物在形成串联体的NAAT中的另ー个用处是作为探针使用，以便在荧光、化学发光或电化学报告系统中作为用干“实时”追踪扩增程度的手段。本领域中的普通技术人员将会想到其他合适的报告系统。相对于比如LFP或发卡引物，茎部引物作为包含探针的引物可能具有好处，因为它们不需要在扩增子中产生可能影响一定类型的探针的反向重复结构。或者，可以通过终点测量检测扩增产物，终点测量就是在多核酸的扩增完成后进行的測量。也可通过NAAT检测中采用的其他检测方法来检测多核酸的扩增。合适的例子包括但不限于基因阵列、试纸条法、电泳法、质谱分析法和声波检测。在一个实施例中，使用实时生物发光实验(Bioluminescent Assay inReal-Time,BART)报告系统检测多核酸的合成。该系统在W02004/062338和W02006/010948中得到详细解释，这两篇文献通过引用结合于此。BART是为等温NAAT设计的ー种报告系统的示例，BART从样本中形成单ー类型的信号生物发光信号。BART使用依赖于萤火虫荧光素酶的无机焦磷酸盐的检测当通过NAAT对“目标”序列进行扩增时，产生的无机焦磷酸盐的数量非常大。因此，可以借助BART通过在均匀相实验中简单地测量从封闭管中发射出的光线而实现分子诊断。已经在多个NAAT中证实BART的运行温度在50_63°C之间。BART报告系统是ー种特别有效的追踪NAAT扩增速度的手段，因为光线的输出代表扩增速度的即时测量值(而荧光输出则表示信号的累积，因此需要对测量值进行微分运算以便获得扩增速度)。图22以举例的方式展示了与LAMP—起使用的BART，用于检测稀释系列的特定目标DNA分子。注意随着样本中目标DNA数量的減少，达到光线量最大的时间所需的延滞期(该延滞期与达到最大扩增的延滞期成正比)増加。换句话说，达到与BART中的阳性样本相关联的特征光线峰值(characteristic light peak)的时间的增加与样本中的目标多核酸的数量成反比。需要强调的是虽然上述例子使用了 BART报告系统，本发明不限制于使用BART系统，而是可以均等地适用于其他方法，比如荧光、浑浊度、其他光谱技术或电化学測量方法，而与这些方法是否在扩增的实时测量中或终点测量中使用无关。优选地，本发明方法在密封容器中进行。这样做的好处极大，因为可以减小甚至避免实验室被污染的可能性。这是特别重要的，因为即使模板多核酸或扩增子的一个拷贝逃逸进实验室，都可能会对将要测试的其他样本造成污染，并且产生假阳性結果。因此，在将本发明方法用于诊断领域时，避免污染的能力特别重要。本发明方法的进ー步用途是用于确定有机体的遗传密码中是否存在特定的多核酸序列。比如，本方法可用于确定作为模板核酸起源的核酸是否为转基因，用于检测与特定的非转基因或转基因植物种子相关的DNA，用于检测与纯种动物相关的DNA，或用于医疗或兽医诊断用途比如基因检测或法医学。本发明方法也适于检测单核苷酸多态性(,single-nucleotide polymorphisms, SNP)。根据本发明的方法可用于诊断用途。特别是，该方法允许对患者或样本中的有机体进行鉴定和定量化。有机体可以为任何微生物比如病毒、细菌、支原体或真菌。微生物可以为致病微生物，但是也可以为非致病微生物。微生物也可以为转基因组织(geneticallymodified organism,GM0)。此外,本发明方法可用于识别转基因农作物和动物,用于检测疾病状态，用于预测诊疗中的不良反应，以及用于疾病状态感染性预测。“患者样本“是指从患者身上取出的任何样本，其可以包括血液、粪便、药签、痰、支气管肺泡灌洗液、组织样本、尿液或脊髄液。其他适当的患者样本及其提取方法为业界的普通技术人员所熟悉。用于提取样本的“患者”或“主体”可以为人或动物。当没有将样本特定地称为患者样本时，本术语也可以包括从其他来源提取的样本。这些例子包括来自表面的药签、水样本(比如废水、海水、湖水、饮用水)、食品样本、化妆品、药品、发酵品、细胞和微生物培养物及其他需要检测微生物的样本。根据另一方面，提供一种在根据本发明的方法中使用的装置(kit)。优选地，所述装置包括实施本发明方法所必须的所有组件，除了待检测的目标多核酸之外，除非目标多核酸形成了所供应的阳性对照的一部分。一种在根据本发明的方法中使用的装置优选地包括多核酸聚合酶、用于核酸聚合酶的底物及适于对目标多核酸进行等温扩增的引物(如前所述)。更优选地，装置进ー步包括缓冲试剂，比如镁离子源，业界所知的用于改善NAAT性能的添加剂比如三甲铵こ内酷，或已知的用于提高装置试剂保质期的添加剂比如海藻糖，或已知的有助于保存试剂的添加剂比如叠氮化钠。或者，一种在根据本发明的方法中使用的装置可以仅仅包括这些组件和/或额外组件的一部分。然而可以将从装置中去掉的样本及任何其他组件在使用时添加到装置中。当使用BART检测多核酸时，可以将热稳定性荧光素酶、虫荧光素及将无机焦磷酸盐(PPi)转变为ATP的酶比如ATP硫化酶，及其他任何必要的将PPi转变为ATP的酶的底物和辅因子比如腺苷酰硫酸包含在所述装置中。因此在ー个实施例中，用于结合BART使用的装置包括a)核酸聚合酶，b)至少ー个茎部引物，c)对测试样本的等温扩增适宜的至少两个交互引物，d)热稳定性荧光素酶，e)虫荧光素，f)ATP硫化酶，及g)腺苷酰硫酸。
优选地，所述装置中的至少ー个组件被冷冻(Iyophilized)或呈另ー种适于在装置中储存的形式。更优选地，装置中的所有组件被冷冻或呈另ー种或多种适于在装置中储存的形式。这些其他形式包括已经添加了稳定因子(stabilizing factors)的组件和/或包含装置组件的冷冻或冷藏试剂盒。
一般说明相对于数字X描述的术语“大约”是可选的并且是指比如x±10%。术语“包括”涵盖“由...组成”，比如组分“包括” X可能是指只包括X，也可以指还包括其他东西，比如X+Y。BART是指用于确定样本中存在的模板多核酸数量的方法，在此，可以检测到是否存在来源于扩增反应的无机磷酸盐，并且可以显示样本中的模板多核酸的数量。现在将通过举例的形式详细描述本发明的多个实施例。应当理解在不脱离本发明范围的情况下，可以对细节进行修改。


图I该图展示了指数级扩增通常所需的多核苷酸上的两个区域，不论是使用两个引物(图Ia)，还是使用多个引物(图lb)。參考这些区域，多核苷酸的茎部区域(本发明的主题)展示于图Ic中。图Id清楚地展示了在这些方法中形成的所期望的第一代扩增子中用于NAAT (文中将其称为LAMP和TRA)的茎部区域。图Id显示了茎部区域位于形成分子内环状物的过程中涉及的扩增子区域之间。注意事实上，虽然LAMP和TRA所表示的第一代有所不同(參见相关专利申请)，其结构事实上相同。图Ie清楚地显示了位于目标模板上的用于NAAT (文中将其称为LAMP和TRA)的茎部区域。图2该图展示了将I个、2个或多个茎部引物放置到茎部区域的多个手段。图3该图展示了各种类型的扩增子的生成过程，包括主扩增子的生成(图3a)，第一代扩增子的生成(图3b)和下一代扩增子的生成(图3c)。图4该图展示了 LFP形成串联体结构的流程。在第一个例子中，形成了主扩增子，该主扩增子在其5’端具有反向重复结构(图4a)，因此图4a(ii)显示从主扩增子的5’端开始，具有Fl区域，继续沿着扩增子并且在同一个链内具有该区域的互补部分Flc (在该图及以后的附图中，小写字母c表示引物结合区的互补部分)。图4a没有详细展示特定的NAAT提供的机制，该机制用于让主扩增子成为单链结构，并且可供另ー个引物拷贝，但是该机制通过指向图4a(iii)的两个黑箭头来表示，在此也展示了作为结果的第一代扩增子。LFP形成的第一代扩增子自身可以用作引物，以便生成进ー步的扩增子。在此过程中，可以形成串联体结构。具有两种形成串联体的主要机制，其中ー个是通过分子内的事件(如图4b所示)，另ー个是通过分子间的事件(如图4c所示)。注意在上述两种情况下，该流程在串联体内形成扩增子的单链区域，參考图4b(ii)、(iii)和图4c(ii)、(iii)中的区域F2。这些区域可以结合进ー步的LFP。图8展示了接下来的步骤。图5该图展示了与图4相同的流程，区别是发卡引物内具有固有的形成串联体所需的反向重复结构，因此不需要通过链扩展来按照LFP形成。
图6 该图展示了文中提及的各种引物的特性。图6a展示了 “简单引物”，在此，大部分或全部引物与多核苷酸模板之间进行了沃森-克里克碱基配。图6b展示了 LFP与简单引物的不同之处，区别是具有额外的5’区域，该区域实质上与所述引物的3’端的结合位点的区域3’相同。上述区别带来的结果是该引物的扩展生成了位于引物的5’区域与扩展产物之间的反向重复结果(參考图4a(ii))。图6c展示了在SEA中使用的发卡引物。这些引物的5’区域包含了反向重复结构，从而可望5’区域折叠成发卡结构。可望发卡为紧密发卡，该紧密发卡包含非常少的单链核苷酸，因此该单链区域不太可能与另ー个引物结合。然而，如果发卡放大从而形成图6d所示的环状物，则引物与该环状物之间的结合是可能的。图7该图展示了通过溴化こ锭染色的琼脂糖凝胶，在此，并排展示了两个不同扩增技术的结果，其中ー个是LAMP，另ー个是TRA。对于LAMP而言，扩增使用了置换引物和LFP(但不是环状引物)。对于TRA而言，扩增则使用了与LAMP中相同的LFP，但是没有其他引物。可容易看出LAMP和TRA都产生串联体形式的扩增子。此外，扩增子的大小明显相同。这意味着LAMP和TRA具有共同的串联化(concatamerisation)机制。图8该图展示了将进一歩的LFP结合到这些LFP先前生成的环状物的效果。图8a展示了结合到环状物的LFP，这些环状物通过第一代扩增子(或下一代扩增子)的分子内的自我引发形成。图8b展示了结合到环状物的LFP，这些环状物为分子间形成的环状物。在以上两种情况下，新结合的LFP的扩张导致相对链成了单链结构(图8a(ii)和图8b(ii))。图9将展示茎部引物如何结合到这些区域。图Sc强调如果对发卡引物进行了修改(图8a(ii))，以便提供包含了与引物的3’端相同的序列的固有单链环状物(如图8c(ii)所示)，则结果形成的下一代扩增子将提供用干与进ー步的发卡引物结合的单链环状物(图8c (iii))。图9不论是分子内(图9a(i))还是分子间(图9a(ii))的下一代扩增子的形成过程，扩增子的茎部区域外露称为单链结构，并且可供茎部引物结合。对于LFP形成的交互环状物(即，图8a所示的所生成的交互链结构的环状物)而言，情况也是如此。该环状物无法结合LFP，但是该环状物与LFP具有相同的义向(sense)，但是当采用所谓的环状引物时，该环状物可以与环状引物结合(图9b(i))。环状引物的扩张同时使得扩增子的茎部区域变成单链结构，因此可以与茎部引物结合(图9b(ii))。图10该图展示了针对SEA，通过扩增子自我扩张实现的下一代扩增子的再拷贝使得扩增子的茎部区域变得可供茎部引物结合的过程。图11该图展示了针对单增李斯特菌系统中的三组不同引物的通过BART追踪的TRA中借助茎部引物实现的速度増加。LFP和茎部引物的示意位置展示于图ll(i)中。图ll(ii)-ll(iv)展示了慢、适中和快速LFP小组在没有茎部引物时的速度(左侧的图)与存在茎部引物时的速度(右侧的图)之间的BART比较。在每个图表中，早期出现的峰值代表较高的拷贝数(108)，而后期出现的峰值(如果可以看到)代表目标的IO4拷贝。用浅灰色线表示无模板对照(No-template controls)。图12该图展示了如何将单增李斯特菌系统中的TRA中的茎部引物的使用(图12a⑴)分解为三个独立的扩增过程，其中之ー是TRA，而另外两个是ATRA(图12a(ii))。ATRA与TRA速度的BART比较以及引物的所有组合展示于图12b(i)-(iv)中。在每个图表中，早期出现的峰值代表较高的拷贝数(108)，而后期出现的峰值(如果可看到)代表目标的IO4拷贝。浅灰色线表示无模板对照。图13该图展示了 BART的动力学模型，其中将3个不同的扩增反应组合起来。在图13a中，快速NAAT与2个非常慢的NAAT组合起来，可以看出扩增的综合速度(即，3个扩增反应速度的总和)出现了在时序上与3个NAAT中最快的那个相同的BART峰值。图13b与图13a类似，区别是将快速NAAT与两个稍微更快的NAAT组合起来，在这种情况下，扩增的综合速度仅仅是稍微受到影响，并且BART峰值的出现仅仅早了几分钟。图13c与图13b及图13a类似，区别是所谓的较慢的NAAT现在与最快的NAAT的速度相同结合后的扩增综合速度仍然仅仅是稍微受到影响，并且BART峰值的出现仅仅早了几分钟。图13说明当多个不同的指数级流程同时发生时，并没有观察到明显较早的BART峰值(采用茎部引物时可以观察到)。这表明当特定的NAAT采用茎部引物时，茎部引物的作用是促使扩增的固有速度得到重要和显著的増加，而不是加入単独的较慢或类似速度的流程中。图14对于图14中的每部分(a)-(g)，每个部分中的部位(i)展示了双链模板中各种NAAT采用的引物的引物结合位点的位置。与正向交互结合区相关的引物通过F表示，那些与反向交互结合区相关联的引物通过R表示。每个部分中的部位(ii)展示了特定NAAT采用的各种引物结合到相应的链上，同时展示了茎部引物的结合的潜在位置，但是茎部引物的精确位置及所采用的茎部引物的数量可能差异很大，如图2所示。图14a展示了在TRA中活动的茎部引物。图14b展示了在LAMP中活动的茎部引物。图14c展示了在LAMP的改进表现中活动的茎部引物，LAMP的改进表现也适用环状引物。图14d展示了在SEA中活动的茎部引物。图14e展示了在SMAP中活动的茎部引物。图14f 展示了在ATRA中活动的茎部引物。而图14g展示了在具有套式(nested) LFP的TRA中活动的茎部引物。图15该图展示了肠炎沙门氏菌系统中的TRA中存在和不存在茎部引物时的套式LFP的效果。图15a展示了茎部加速的TRA(图15a(i))与茎部加速的LAMP(图15a(ii))及茎部加速的套式TRA(图15a(iii))之间的比较結果。在每个图表中，早期出现的峰值代表较 高的拷贝数(108)，而后期出现的峰值(如果可以看到)代表目标的IO4拷贝。用浅灰色线表示无模板对照。图15(i_iv)分别展示了不存在茎部引物和存在茎部引物的情况下，具有内部LFP的TRA与具有外部LFP的TRA及同时具有内部和外部LFP的TRA的BART速度之间的比较結果。在每个图表中，早期出现的峰值代表较高的拷贝数(108)，而后期出现的峰值(如果可以看到)代表目标的IO4拷贝。用浅灰色线表示无模板对照。图16该图展示了单增李斯特菌系统中通过BART追踪的LAMP中使用茎部引物导致的速度増加。所有引物的示意位置展示在图16(iii)中，而存在和不存在茎部引物时的速度的BART比较则展示在图16(i)和图16(ii)中。在每个图表中，早期出现的峰值代表较高的拷贝数(108)，而后期出现的峰值(如果可以看到)代表目标的IO4拷贝。用浅灰色线表示无模板对照。图17该图展示了单增李斯特菌系统中通过BART追踪的TRA中使用茎部引物导致的速度増加，在此，与上述例子相比，茎部引物位于茎部的不同区域。所有引物的示意位置展示在图17 (iii)中，而存在和不存在茎部引物时的速度的BART比较则展示在图17 (i)和图17(ii)中。在每个图表中，早期出现的峰值代表较高的拷贝数(108)，而后期出现的峰值(如果可以看到)代表目标的IO4拷贝。用浅灰色线表示无模板对照。图18与比如LAMP中的环状引物进行比较，茎部引物在该图中显示为具有更大的放置自由度。严格地讲，环状引物限制于Fl与F2位点之间，或限制于Rl与R2位点之间。如果序列的实际情况不允许有效地放置一个或多个环状引物(因为环状物要么不够长，要么环状引物可能通过引物ニ聚体而导致非特异扩増)，则可能无法选择其他的环状引物设计。茎部引物可以放置在颈部的任何位置，并且它们具有适当朝向，从而允许有较大幅度的设计选择，并且优化成具有最高效率，同时避免了任何非特异的引物ニ聚作用。图19该图展示了假想的多核苷酸序列，在此，合适的引物结合位点用盒子形状的区域表示。然而，相对于白色区域，灰色区域是更优选的结合位点，可能因为有机体的基因组在该部位具有更好的序列保守性(sequence conservation)(当设计比如在不同品系(strain)之间具有明显序列差异的病原体的诊断测试时，该序列保守性有关联)。在图19(ii)中，针对与环状引物一起使用的LAMP，将不同区域赋予在LAMP的表现中使用的引物。注意必须将引物中的4个引物放置在非优化的结合位点上，而根本没有使用优化的结合位点。这显然是不理想的。另ー种情况是像图19(iii)那样放置引物，在此，使用了所有优化的结合位点。然而在该表现中，Rl和R2位点互相之间非常靠近，这意味着完全释放了(loosing)环状物R引物的位点。发明人也已经看出当Rl和R2位点互相之间非常靠近时(或者交互的Fl和F2之间)，可能会发生非优化的扩增，可能是因为在所形成的环状物中具有位阻(steric hindrance)。发明人进ー步观察到环状引物通常比置换 引物更能增加扩增速度。因此，可以预料到图19(iii)中的引物分配非常不理想。然而在图19 (iv)中，通过使用茎部引物，可以使用所有的优化结合位点，而且可以使用所有的环状和置換引物位点。因此，茎部引物増加了引物设计的灵活性。图20该图显示了针对所有置換引物、环状引物和茎部引物，使用各种类型的引物而不是“简单引物”是可行的。许多可能组合中的三种展示于图20(i)-(iii)中，在此仅仅展示了正向交互引物结合区和茎部引物。在图20(i)中采用了 LFP、发卡引物和简单引物的组合。在图20(ii)中，环状引物用改性简单引物表示，改性简单引物包含RNA区域或切ロ酶的裂解位点(cleavage site)。在图20(iii)中展示了 LFP、发卡引物和可裂解简单引物的其他可能的组合。许多其他组合也是十分明显的。图21该图说明如果将茎部引物作用于串联体，则茎部引物的作用将仅仅产生指数级扩增的扩增子。图21的左侧展示了茎部引物对第一 代扩增子的作用。可以看出结果形成的扩增子仅仅包含反向交互引物结合区，而没有包含指数级扩增所必须的正向交互引物结合区。相比之下，从图21的右侧可以看出当茎部引物可以通过串联体扩展时(所展示的茎部引物2可以扩展，而茎部引物I则不行)，结果形成的扩增子将同时具有正向和反向交互引物结合区，并且因此是指数级扩增的底物。图22该图展示了 BART-NAAT的ー个例子，强调了该技术的量化属性。BART象征了追踪NAAT中的扩增速度的有效手段，因为生物发光的输出反映了扩增的即时速度。图23图23(i)展示了与MRSA相关联的葡萄球菌染色体mec盒(SCCmeccassette)的一部分。SCCmec移动基因成分整合到了金黃色葡萄球菌的OrfX基因中的保守区域中，从而通过MecA基因将抗性(resistance)传递给抗菌性甲氧西林。因此，MecA基因和OrfX基因位于相同的DNA链上。然而，针对不同版本的SCCmec (及MRSA的不同品系)，序列内的MecA基因与OrfX基因之间的距离可能相差很大。因此，这已经从技术上证明相当困难在MRSA的诊断实验中将MecA基因和OrfX基因用作特定NAAT的交互引物结合区。比如，如果MecA基因和OrfX基因之间隔开到大于500个碱基对(base-pair)，并且将MecA基因和OrfX基因用作正向和反向交互引物结合位点的位点，则LAMP不太可能会扩增任何产物(图23(ii))。然而，由于茎部引物明显地改善了 NAAT比如LAMP扩增目标的能力，并且由于使用了 MecA基因和OrfX基因作为正向和反向交互引物结合位点的扩增子的“茎部”可被多个莖部引物定向(targeted),同时由于已经证实莖部引物以连接的方式与正向和反向交互引物配合，因此，茎部引物允许借助适当的NAAT比如LAMP进行MRSA的直接检测(图23 (iii))。可以使用很多茎部引物来解决MecA基因和OrfX基因之间的区域的差异。如上所述，相对于现有技术(其仅仅依赖OrfX和SCCmec的区域而不是MecA来指示MRSA的存在性)，使用茎部引物具有优势。这是因为ー些金黄色葡萄球菌包含SCCmec插入物，该插入物不含MecA基因，因此不是真正的MRSA。由于本方法需要MecA基因和OrfX基因都位于相同的DNA链上，因此不可能根据包含SCCmec而不含MecA基因的品系中获得假阳性。例子例子ILAMP和TRA的比较说明结果形成的扩增子在两种情况下都是串联体并且明显相同。在LAMP-BART 和 TRA-BART 中、温度为 60 °C 的 Lucy-bespoke 成像硬件系统(Lumora)中，并且在条件与例子2中的条件相同(区别是使用了 0. 32U/ u I Bst的DNA聚合酶(NEB)，并且使用了含量为11. g/yl的萤火虫荧光素酶)的情况下对肠炎沙门氏菌侵入型A基因的2-kb片段(fragment)进行了扩增。反应混合物包含浓度均为0. 8 y M的R-LFP (6)引物和F-LFP (6)引物，以及浓度为0. 2 y M的置换引物RD (2)和FD⑵。每个反应的总容积为20iU。反应进行了 100分钟LFP引物小组6 (R-LFP与目标序列上的R2c结合，而F-LFP与目标序列上的F2结合)R-LFP(6)5，-aac ctt gta gag cat att cgt ggt ttt ccg cca ttg gcg aat ttatgF-LFP (6) 5，-tct ctt ggc gcc cac aat gtt ttt aag cga acg tgt ttc eg置換引物小组2 (RD与目标序列上的R3c结合，而FD与目标序列上的F3结合)RD (2)5’ -cat tac tgc tcg taa ttcFD (2) 5’ -ata tct gaa gtt ttg cag c凝胶上的样式(pattern)并非取决于是否存在置换引物RD和FD，而是仅仅通过LFP限定(图7)。LAMP和TRA扩增都形成了完全相同的梯形样式，这充分说明两者的发生机制类似。置換引物在LAMP扩增的初始阶段起到非常大的作用，但是它们对接下来的扩增传播阶段没有效果。例子2莖部引物对具有不同效能(efficiency)的lamp引物的单增李斯特菌TRA的效果借助娃胶膜质粒小提标准试剂盒(QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen))对包含单增李斯特菌internalin A基因片段的Pls-质粒(pLS-plasmid)进行净化,并且在60°C的温度下在Lucy-bespoke成像硬件系统(Lumora)中，借助TRA-BART对其进行扩增。反应混合物包括浓度均为0. 8 ii M的R-LFPI、2或3引物，及F-LFPI、2或3引物(慢、中或快)，浓度为0. 8 ii M的StemR和浓度为0. 8 y M的StemF引物(Eurofins MWG)，浓度为0. 8mM的dNTPs (全部)(Invitrogen)，0. 16U/ u I Bst 的 DNA 聚合酶(NEB)，含量为 0. lmg/ml 虫荧光素(Europa Bioproducts),浓度为 0. 25mM 的腺苷酰硫酸(Biolog),含量为 5. 6 y g/ y I 的萤火虫突光素酶(UltraGlow,Promega),0. 375U/ml 的 ATP-硫化酶(NEB)(在 Ix Thermopol缓冲剂中(NEB))，并且具有ー些稳定剂和添加物，及高低数量的质粒108 or 104。每个反应的总容积为20iU。测试进行了 100分钟。引物在目标模板上的相对朝向展示于图ll(i)中，然而，从以下序列表可以看出实际使用的引物在B2c和F2结合区的序列中明显不同。(R-LFP与目标序列上的R2c结合，而F-LFP与目标序列上的F2结合)慢速LFPs小组IR-LFP (I) 5，-cct tct ttt aca ggc tta get ggt ttt tea aag aaa caa cca aagaag tggF-LFP ⑴ 5， -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt att ate aaa cgt tgctgt gta gc 中速 LFPs 小组 2R-LFP ⑵ 5， -cct tct ttt aca ggc tta get ggt ttt atg cta agt ttc atg tggacgF-LFP (2) 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gtt tga gat gtt gttaca ccg tcFast LFPs set 3
R-LFP (3) 5， -cct tctttt aca ggc tta get ggt ttt gga age tgg gaa ttt attgag tgF-LFP (3) 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cgatgt catttg茎部引物小组IStemF ⑴ 5， —tCB BBC CB6 C6B BCB BBt gStemR(I) 5’ -aac egg egg aac taa at当存在茎部引物时，对于任何ー组LFP引物或存在的任何数量的目标而言，所发生的扩增都是非常快。对于慢速和中速LFP引物小组而言(图ll(ii)和(iii))而言，当没有茎部引物时，只能检测到目标的IO8拷贝(峰值分别出现在92和73分钟)。然而，当存在茎部引物吋，IO8拷贝的峰值出现在39和41分钟，并且可以在实验时间内检测到IO4拷贝(峰值出现在55和62分钟)。在快速引物小组3的情况中(图11 (iv))，低和高拷贝数量的峰值出现在39和60分钟，而在有茎部引物的情况下，检测到这些低和高拷贝数量的时间非常早(峰值出现在22和34分钟)。该例子证明通过将茎部引物添加到LFP引物中可以实现基本的扩增加速，这些LFP引物具有不同效能、长度、位置、Tms, GC-丰富度、成型环的大小及其它參数。例子3对称、非对称和茎部加速的对称单增李斯特菌TRA之间的对比在温度为55 °C的Lucy-bespoke成像硬件系统(Lumora)中，且在与例子2相同的条件下，并且在具有大量或少量质粒(IO8或IO4)的情况下，通过浓度均为0. 8 i! M的R-LFP (3)、F-LFP (3)、StemB (I)和StemF (I)引物的不同组合对包含单增李斯特菌internalin A(IlnA)基因片段的Pls-质粒进行扩增。LFP引物小组3(R-LFP与目标序列上的R2c结合，而F-LFP与目标序列上的F2结合)R-LFP (3) 5， -cct tctttt aca ggc tta get ggt ttt gga age tgg gaa ttt attgag tgF-LFP (3) 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cgatgt catttg茎部引物小组IStemF ⑴ 5， —tCB BBC CBC CCB BCB BBt g
StemR⑴ 5’ -aac egg egg aac taa at两个非対称的扩增都是非常慢，并且仅仅检测到李斯特菌IlnA目标的高拷贝数(峰值分别出现在84和75分钟)。包含相同一组LFP的对称TRA展示了更高的扩增速度，并且IO8拷贝的峰值出现在38分钟，而IO4拷贝的峰值则出现在56分钟。当将茎部引物添加到TRA的对称表现(manifestation)中时,高拷贝数的峰值出现在23分钟,低拷贝数的峰值出现在34分钟，因此与没有茎部引物时看到的速度相比，显示了明显的速度増加(图12b)。简单地将3个较慢速度累加起来将不足以解释这种明显的扩增速度増加，这种明显的扩增速度増加也已经通过数学模型(例子4)得到证实。例子4
借助用于模拟指数级过程的标准理查德曲线公式将仿真BART动力学曲线绘制在Microsoft Excel中(图13)。对单个的具有不同动力学活动的扩增过程的扩增动力学进行建摸。具有不同、类似或相同动力学活动的单个扩增过程的组合的效果展示于图13中。从图13a、b和c的比较可以看出即使将3种快速扩增过程组合起来，将单个的不同扩增过程组合起来的综合扩增速度效果也是特别小的(图13c)。这表明茎部引物的效果是从根本上増加扩增速度，而不是简单地増加了额外的扩增过程。例子5(A)置換引物和外部用于形成环状物的引物对单增李斯特菌TRA效果的对比在温度为55°C的Lucy-bespoke成像硬件系统(Lumora)中，且在与例子2相同的条件下，并且在具有大量或少量质粒(IO8或IO4)的情况下，在LAMP-BART中对包含单增李斯特菌IlnA基因片段的Pls-质粒进行扩增。每个反应的总容积为20 yl。测试进行了 100 分钟。对包含浓度都是0.8 ii M的R-LFP (3)、F-LFP (3)、StemF (I)和StemR(I)的反应与添加了浓度都是 0. 8 ii M 的 OuterR(I)和 OuterF(I)或 Outer R-LFP (7)和 Outer F-LFP (7)的反应进行比较。LFP引物小组3R-LFP (3) 5， -cct tctttt aca ggc tta get ggt ttt gga age tgg gaa ttt attgag tgF-LFP (3) 5， -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cgatgt catttg茎部引物小组IStemF ⑴ 5， —tCB BBC CBC CCB BCB BBt gStemR(I) 5’ -aac egg egg aac taa at置换引物小组IRDQ) 5， -taa tgc taa gtt tea tgt gFDQ) 5， -ata ate tac tgt ttg aga tg外部LFP引物小组7R-LFP(7)5’-ctt ctt tgg ttg ttt ctt tgc ctt ttt get aag ttt cat gtg gacF-LFP (7) 5’ -gta tta aca get aca cag caa cgt ttt gag atg ttg tta cac cgtc茎部加速的TRA在该例子中引起了 IlnA基因的快速扩增，IO8和IO4拷贝数的峰值分别出现在23和35分钟。添加了两组不同的外部引物则分别将高低拷贝数的峰值时间减小到18和31分钟(图15a)。当将置换引物替换为LFP时，扩增反应进行的更快(图15a(iii))。(B)茎部加速的肠炎沙门氏菌套式TRA借助娃胶膜质粒小提标准试剂盒(QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen))对包含肠炎沙门氏菌侵入型A基因(InvA)片段的Pls-质粒(pLS-plasmid)进行净化，并且在55°C的温度下在Lucy-bespoke成像硬件系统(Lumora)中，借助TRA-BART对其进行扩增。反应混合物包括浓度均为0. 8 U M(如下面所显示的那样)的内部和/或外部反向和正向LFP，浓度为 0. 8 ii M 的 StemB 和 0. 8 y M 的 StemF 弓 I物(Eurofins MWG)，:浓度为 I. 6mM 的 dNTP (全部)(Invitrogen), 0. 16U/ u I Bst 的 DNA 聚合酶(NEB),含量为 0. lmg/ml 虫突光素(EuropaBioproducts)，浓度为0. 25mM的腺苷酰硫酸(Biolog)，含量为5. 6 y g/ 的萤火虫荧光素酶(UltraGlow, Promega)，含量为 0. 375U/ml 的 ATP-硫化酶(NEB)(在 Ix Thermopol 缓冲剂中(NEB))，并且具有ー些稳定剂和添加物，及高低数量的质粒IO8 or IO40每个反应总容积为20iU。测试进行了 100分钟。内部LFP引物小组4R-LFP (4) 5’ -gga gca atg gcg cgt tat att tgt ttt cgc cat tgg cga att tatgF-LFP (4) 5， -cac aat gcg age get tcc ttt tta age gaa cgt gtt tcc g外部LFP引物小组5 R-LFP (5) 5， -cga att acg age agt aat ggt ttt tea tcc tea act tea gca gF-LFP (5) 5’ -caa acg ctg caa aac ttc agt ttt tta aag aag tgc tea gac atg茎部引物小组2StemF (2) 5，-cct tgt gga gca tattcgStemB (2) 5’ -gac ate ttt ttc tct tgg eg在该肠炎沙门氏菌InvA TRA系统中，两组单独使用的LFP都如此之慢，以致于甚至在实验的100分钟内都无法检测到更高的IO8目标拷贝数。在套式TRA中，在没有茎部引物的情况下，扩增足够快，以至于仅仅检测到高目标拷贝数(峰值出现在68分钟)。当添加了茎部引物之后，速度得以增加，并且高目标拷贝和低目标拷贝都变成可以被检测到，其峰值时间分别为34和61分钟(图15)。该例子说明针对不同目标和LFP的不同表现，都可以观察到茎部引物实现的扩增加速。例子6茎部加速的单增李斯特菌LAMP在温度为55°C的Lucy-bespoke成像硬件系统(Lumora)中，且在与例子2相同的条件下，并且在具有大量或少量质粒(IO8或IO4)的情况下，在LAMP-BART中对包含单增李斯特菌internalin A基因片段的Pls-质粒进行扩增。每个反应的总容积为20 yl。测试进行了 100分钟。对包含全部LAMP引物混合物(浓度为0. 8 ii M的LFP，浓度为0. 4 y M的环状引物，浓度为0. 2 ii M的置换引物)的反应与添加了浓度为0. 8iiM的StemR引物和浓度为0. 8 ii M的StemF引物的反应进行了比较。LFP引物小组11R-LFP (I) 5，—cct tct ttt aca ggc tta get ggt ttt tea aag aaa caa cca aagaag tggF-LFP ⑴ 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt att ate aaa cgt tgctgt gta gc环状引物LoopRc 5，-cag tea ata aat tcc cag cLoopF 5，-cat cga ttt ata tgc gca at置换引物小组IRD Q) 5， -taa tgc taa gtt tea tgt g
FD (I)5， -ata ate tac tgt ttg aga tg茎部引物小组IStemF ⑴ 5，-tea BBC CBC CCB BCB BBt gStemR⑴ 5’ -aac egg egg aac taa at这是LAMP扩增的例子，该扩增非常快地检测到了单增李斯特菌Inl A目标的高和低拷贝数。在没有茎部引物的情况下，IO8拷贝的峰值出现在17分钟，而IO4拷贝的峰值则出现在26分钟。添加了茎部引物之后进ー步加快了反应，并且将峰值时间减小到13分钟(针对IO8拷贝)和19分钟(针对IO4拷贝)(图16)。在这种情况下，在LAMP中实现了加速，LAMP是目前为止所开发的最有效的等温扩增系统之一。检测时间的缩短对一般意义上的终端使用(point-of-use)应用及特别是医疗诊断中的终端护理测试(point_of-caretest)非常重要。例子7具有不同茎部引物朝向的加速单增李斯特菌TRA在温度为55°C的Lucy-bespoke成像硬件系统(Lumora)中，且在与例子2相同的条件下，并且在具有大量或少量质粒(IO8或IO4)的情况下，在TRA-BART中对包含单增李斯特菌internalin A基因片段的Pls-质粒进行扩增。对通过R_LFP(3)和F_LFP(3)引物运行并且在没有和有StemR(3)引物的情况下进行的反应与通过以0. 8 y M的浓度添加的StemF (3)引物运行的反应进行比较。LFP引物小组3R-LFP (3) 5，-cct tct ttt aca ggc tta get ggt ttt gga age tgg gaa ttt attgag tgF-LFP (3) 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cgatgt cat ttg茎部引物小组3StemF (3) 5，-agt tcc gcc ggt ttgStemR (3) 5，-aca ttt gtt ggg tgg ttt g在该例子中，与例子2中所示的效果相比，扩增子茎部上不同位置处的茎部引物的加速效果得到了证实。即使在没有茎部引物的情况下，TRA-BART也检测到了高低拷贝目标(峰值时间分别为39和69分钟)。添加茎部引物之后明显地加快了反应，并且将峰值时间缩短到22和39分钟。不像环状引物(在此，位置由LFP形成的环状物严格限定，并且朝向也是固定的)，茎部引物可位于内部Fl-Bl区域之间的任何位置，并且可面向任何方向。不论茎部引物的位置或朝向如何，都可以观察到加速效果(图17)。序列李斯特菌IlnA基因片段(SEQ ID NO 1)GGCAATTTTTAATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATTGACTGAACCAGCTAAGCCTGTAAAAGAAGGTTATACATTTGTTGGGTGGTTTGATGCCCAAACCGGCGGAACTAAATGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAATGACATCGATTTATATGCGCAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACGTTTGATAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCA沙门氏菌InvA基因片段(SEQ ID NO 2)权利要求
1.ー种合成多核酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤 a)提供包括至少第一和第二交互引物结合区的目标模板； b)提供包括第一和第二片段的第一引物，其中所述第一片段实质上与所述模板上的第一交互引物结合区互补，并且所述第二片段包括序列，该序列实质上与第一引物中的另ー个区域或第一引物的第一片段所生成的扩增子中的ー个区域互补，从而使得第二片段能够形成环状物； c)提供包括第一片段及可选的第二片段的第二引物，其中所述第一片段实质上与所述模板上的第二引物结合区互补，并且所述可选的第二片段包括序列，该序列实质上与第二引物中的另ー个区域或第二引物的第一片段所生成的扩增子中的ー个区域互补，从而使得第二区域能够形成环状物； d)提供至少ー个引物，其能够与第一和第二交互引物结合区之间的区域结合； e)提供合成所述多核酸所必须的试剂和条件； f)执行所述多核酸的合成。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于合成过程通过来自以下小组的核酸扩增技术执行环介导等温扩增、模板重引发扩増、自扩张扩增和智能扩增过程。
3.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于正向和/或反向交互引物结合区包括用于两个或多个引物的结合位点。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于结合到所述正向和/或反向交互引物结合区的所述两个或多个弓I物具有相同类型。
5.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于结合到所述正向和/或反向交互引物结合区的所述引物为提供环状物的引物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述两个或多个引物为用于形成环状物的引物。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在干结合到所述正向和/或反向交互引物结合区的所述两个或多个引物具有不同类型。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述两个或多个结合位点都位于所述目标模板和/或扩增子的相同链上。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述两个或多个结合位点都位于所述目标模板和/或扩增子的不同链上。
10.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于所述正向和反向交互引物结合位点隔开一定距离，从而使得仅仅在存在茎部引物的情况下才会合成多核酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述方法用于检测样本中的抗药性金黄色葡萄球菌。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于使用mecA基因和orfX基因检测抗药性金黄色葡萄球菌。
13.根据权利要求1-12中任何一项所述的方法，其特征在于在步骤(d)中使用了单个茎部引物。
14.根据权利要求1-12中任何一项所述的方法，其特征在于在步骤(d)中使用了两个或多个茎部引物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于在步骤(d)中使用的所述两个或多个茎部引物具有相同种类。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在干在步骤(d)中使用的所述两个或多个茎部引物具有不同种类。
17.根据权利要求14-16中任何一项所述的方法，其特征在于在步骤(d)中使用的所述两个或多个茎部引物结合到所述扩增子的交互链上。
18.根据权利要求13-15中任何一项所述的方法，其特征在于在步骤(d)中使用的所述两个或多个茎部引物结合到所述扩增子的相同链上。
19.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于所述茎部引物是简单引 物、用于形成环状物的引物、发卡引物或提供环状物的引物。
20.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于所述茎部引物包含改性喊基。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述改性碱基选自小组N4-甲基胞嘧啶、肌苷、核糖核苷酸、荧光碱基、光解碱基或通用碱基。
22.根据权利要求1-20中任何一项所述的方法，其特征在于所述茎部引物包含通过可检测结构标记的核酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述可检测结构为荧光标记物、化学发光标记物或电化学标记物。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于所述茎部引物作为荧光、化学发光或电化学报告系统中的探针使用。
25.根据权利要求1-21中任何一项所述的方法，其特征在于通过选自以下小组的方法检测多核酸的扩增基因阵列、试纸条法、电泳法、质谱分析法和声波检测。
26.根据权利要求1-20中任何一项所述的方法，其特征在于所述茎部引物包含通过捕捉结构标记的核酸。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于所述捕捉结构为生物素。
28.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于所述核酸的合成通过实时测量或終点测量进行检测。
29.根据权利要求26所述的方法，其特征在于多核酸的扩增通过选自以下小组的检测系统检测荧光、生物发光、浑浊度或电化学測量。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于通过实时生物发光实验报告系统对多核酸的合成进行检测。
31.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于所述方法在密封容器中进行。
32.根据前述权利要求中任何一项所述的方法在确定有机体的遗传密码中是否存在特定的多核酸序列时的用途。
33.根据前述权利要求中任何一项所述的方法在检测单核苷酸多态性时的用途。
34.根据前述权利要求中任何一项所述的方法在诊断领域的用途。
35.根据前述权利要求中任何一项所述的方法对样本中的有机体进行检测和定量化时的用途。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于所述有机体为微生物。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于所述微生物选择小组病毒、细菌、支原体或和真菌。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于所述微生物为转基因组织。
39.根据前述权利要求中任何一项所述的方法在识别转基因农作物和动物，检测疾病状态，预测诊疗中的不良反应或预测疾病状态感染性时的用途。
40.ー种用于执行前述任何一项权利要求所述的方法的装置，所述装置包括至少ー个茎部引物。
41.根据权利要求39所述的装置，进ー步包括热稳定性荧光素酶、虫荧光素及将无机焦磷酸盐转变为ATP的酶，及其他任何必要的将无机焦磷酸盐转变为ATP的酶的底物或辅因子。
全文摘要
本发明涉及核酸扩增技术领域。特别地，本发明涉及一种方法，该方法使用了茎部引物，该茎部引物改善了测试样本的快速和特异扩增。
文档编号C12Q1/68GK102652176SQ201080035868
公开日2012年8月29日 申请日期2010年6月15日 优先权日2009年6月15日
发明者凯瑟·J·迈克滚, 劳伦斯·C·第希, 奥尔加·甘德尔曼, 盖伊·柯德乐 申请人:路玛拉有限公司