含有栗子皮提取物的健康食品或药学组合物的制作方法

专利名称：含有栗子皮提取物的健康食品或药学组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有栗子皮提取物的健康食品或药学组合物。
背景技术：
瘙痒被定义为诱发想搔抓的欲望的不愉快的皮肤感觉，作为疼痛、触觉、冷或热之类的生理性自我防御机制，在皮肤被暴露于来自外部的有害刺激中时，对其进行认知而起到保护皮肤的作用。瘙痒症是在多种皮肤疾病或全身疾病中经常表现的共同症状中的一种，实际情况是，荨麻疹、各种药物的副作用所致的急性瘙痒症能够容易地被治愈，但是胆道闭锁、肾脏疾病或特应性疾病之类的重症慢性瘙痒症的治疗非常困难。瘙痒由炎症、癌、代谢性疾病、感染、精神科疾病、药物给药或压力等多种原因诱发，在最近的若干研究结果中，明确了皮肤与末梢神经系统及中枢神经系统的有机连接与针对诱发瘙痒的刺激的反应、调节密切相关。最近，明确了特定的感觉神经细胞及其受体对瘙痒特异性地反应，已经接受了瘙痒不是疼痛的下位状态，而是作为感觉神经系统的个别感觉，认为互不相同的瘙痒介质及其受体与多种诱发瘙痒的疾病相关(Steinhoff et al.，Journal of Investigative Dermatology, 126，ppl705_1718，2006)。在迄今为止的用于瘙痒症研究的实验中，主要使用组胺，但是提出以下主张，即特应性之类的慢性瘙痒症与其说是由组胺依赖性通路(pattway)导致，不如说是由神经性原因导致，这说明为什么抗组胺对特应性疾病的瘙痒症不起效(Stander et al., Experimental Dermatology, 11，ppl2~24,2002)。另外，已知第1代抗组胺剂主要用于全身给药，但具有抗副交感作用而显示镇静作用，作为第1代抗组胺剂的扑尔敏在局部给药时，无法抑制特应性皮炎患者的瘙痒 (Munday et al.，Dermatology, 205, pp40_45，2002)，由于存在皮肤过敏反应的危险，因此不鼓励对特应性皮炎使用局部抗组胺剂。作为没有镇静作用的第2代抗组胺剂的依巴斯汀、特非那定与阻碍细胞色素(cytochrome)P450活性的药物(酮康唑、红霉素)一起服用时，有时引起心律不齐(Hey et al.，Arzneimittelforschung, 46, ppl59_163，1996)，而引起与其相关的副作用。因此，目前迫切需要开发在有效的同时副作用小且安全的瘙痒症治疗剂，特别是对特应性之类的慢性瘙痒症有效的治疗药。

发明内容
因此，本发明的目的是解决一直以来所要解决的技术课题。具体而言，本发明的一个实施例的目的是提供含有栗子皮提取物的用于缓和或抑制瘙痒症的健康食品或药学组合物、用于改善皮肤屏障的健康食品或药学组合物、以及用于抑制免疫的健康食品或药学组合物。
根据这样的目的，本发明一个实施例涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于缓和或抑制瘙痒症的健康食品或药学组合物，其既减少以往的瘙痒症治疗药具有的副作用、又具有优异的抑制或缓和瘙痒症的效果。本发明一个实施例涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于改善皮肤屏障功能的健康食品或药学组合物。本发明一个实施例涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于抑制免疫的健康食品或药学组合物。本发明的一个实施例涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于改善或治疗特应性皮炎的健康食品或药学组合物。本发明的组合物含有栗子皮提取物作为有效成分，从而可通过抑制作为瘙痒刺激源的蛋白分解酶活性受体-2 (Proteinase-Activated Rec印tor_2 :PAR-2)的活性而发挥优异的瘙痒症抑制或缓和效果，不仅可以显著地改善由瘙痒症诱发的皮肤屏障破坏，而且还可以通过栗子皮提取物的免疫抑制活性而根本性地治疗能够成为诱发瘙痒症的原因的免疫过敏性反应。


图1是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物的PAR-2活性抑制效果(胰蛋白酶处理)的测定结果的图表。图2是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物的PAR-2活性抑制效果(SLIGKV 处理)的测定结果的图表。图3是示出本发明的一个实施例的栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物的PAR-2活性抑制效果(胰蛋白酶，SLIGKV处理)的测定结果的图表。图4是示出本发明的一个实施例的栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物的瘙痒症(胰蛋白酶处理)抑制效果的图表。图5是示出本发明的一个实施例的栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物的瘙痒症 (SLIGRL处理)抑制效果的图表。图6是示出本发明的一个实施例的栗子皮乙醇提取物的瘙痒症(SLIGRL处理)抑制效果的图表。图7是示出本发明的一个实施例的栗子皮乙醇提取物口服给药的瘙痒症(SLIGRL 处理)抑制效果的图表。图8是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少TNF- α分泌的效果的图表。图9是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少IL -6分泌的效果的图表。图10是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少IL-I α分泌的效果的图表。图11是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少IL-8分泌的效果的图表。图12是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少GM-CSF分泌的效果的图表。图13是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少胰蛋白酶与活性肽 (SLIGKV)所致IL-6分泌的效果的图表。
图14是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少胰蛋白酶与活性肽 (SLIGKV)所致IL-8分泌的效果的图表。图15是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少胰蛋白酶与活性肽 (SLIGKV)所致GM-CSF分泌的效果的图表。图16是示出本发明的一个实施例的栗子皮乙醇提取物的皮肤保湿效果的测定结果的图表。图17是示出本发明的一个实施例的栗子皮乙醇提取物的改善角化过度的效果的测定结果的图表。图18是示出本发明一个实施例的栗子皮乙醇提取物在NC/Nga模型中的瘙痒症改善效果的测定结果的图表。图19是示出本发明一个实施例的栗子皮乙醇提取物在NC/Nga模型中的IgE减少效果的测定结果的图表。图20是示出本发明的一个实施例的栗子的内皮(嫩皮)和外皮(外壳)提取物导致的PAR-2活性抑制效果的测定结果的图表。
具体实施例方式本发明涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于缓和或抑制瘙痒症的健康食品或药学组合物。本申请的发明人等将蛋白分解酶活性受体KProteinase-Activated Receptor-2 :PAR-2)作为瘙痒症治疗的目标，测定栗子皮提取物导致的PAR-2活性抑制的程度，结果如后述实施例中所证实的那样，确认了在试管内显示出优异的PAR-2拮抗作用， 另外，在作为使PAR-2特异性地活化的肽的SLIGRL、SLIGKV或作为蛋白分解酶的胰蛋白酶 (Trypsin)诱发的瘙痒抑制实验中，确认了显著地抑制PAR-2的活性，显示非常优异的瘙痒抑制效果。上述瘙痒症也被称为搔痒症，这种瘙痒症的诱发原因或形态没有特别限制，例如， 由包括炎症性皮炎、特应性皮炎、肌肤皲裂所致的皮炎、痱子、溃疡、冻伤、接触性皮炎、脂溢性皮炎、银屑病及副银屑病的皮炎中的一种以上诱发。在瘙痒症的情况下，会由于连续性瘙痒而持续地对皮肤进行擦、搔抓或掐。由此， 诱发皮肤的溃疡、擦伤、苔癣、痒疹、过度色素沉着或色素沉着减少等二次性皮肤损伤，分泌诱导皮肤中炎症反应的各种物质，这样的分泌再次增加瘙痒，而形成瘙痒-搔抓的循环。但是，本发明的健康食品或药学组合物中所含的栗子皮提取物显示有效的皮肤屏障功能改善效果，结果可以有效地预防或治疗瘙痒诱发的二次性皮肤损伤。上述组合物对例如由来自特应性皮炎的瘙痒而产生的2次性皮肤损伤在缓和皮肤屏障损伤或改善皮肤屏障恢复力方面显示显著的效果，由此，可以显著地改善皮肤屏障。特别是，上述组合物可以通过增进皮肤保湿、防止皮肤角化过度而改善皮肤屏障， 如通过后述实施例而证实的那样，本申请的发明人等利用对无毛小鼠(Hairless mice)用 ρ恶唑酮(oxazolon)进行处理的过敏模型进行实验，测定经表皮水分损失(trans印idermal water loss，TEWL)和皮肤厚度(skin thickness)，结果确认了栗子皮提取物显示有效的增进皮肤保湿或防止其角化过度的效果。进而，本发明涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于抑制免疫的健康食品或药学组合物。上述组合物可以是用于治疗例如特应性、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)或克罗恩病(Crohn，s disease)的健康食品或药学组合物，其中，可以是用于预防或治疗作为免疫过敏性反应的特应性疾病的组合物。在特应性疾病从皮肤损伤等导致的急性阶段向慢性疾病阶段发展时，观察到免疫介质的多种分泌状态的变化，但在患有特应性疾病的患者的损伤皮肤中，多数白细胞介素 (Interleukin)的浓度变得增加。另外，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)已知在特应性皮肤疾病患者的损伤皮肤中，其分泌量增加，引起慢性炎症反应，而会引起特应性患者免疫体系的不均衡(Matsubara et al.，FEBS Letters, 566，ppl95_200，2004)。与此相关，本申请的发明人等确认了栗子皮提取物可以显著减少与免疫过敏性反应相关的肿瘤坏死因子-a (Tumor Necrosis Factor- α :TNF_ α )、白细胞介素-6 (IL-6)、 白细胞介素-Ια (IL-la)、白细胞介素-8(IL_8)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor =GM-CSF)的表达，结果栗子皮提取物适于作为用于抑制免疫的健康食品或药学组合物的有效成分。特别是，本发明含有栗子皮提取物作为有效成分，适合用于改善或治疗特应性皮炎的化妆料组合物的有效成分。另外，上述白细胞介素-6(IL_6)和白细胞介素-8(IL-8)还被已知是在特应性疾病中诱发瘙痒的因子，栗子皮提取物可以有效地用于预防和治疗来自特应性疾病的瘙痒症预防。上述栗子皮是指覆盖栗子树果实的深褐色皮，本说明书中使用的栗子皮提取物是指选自栗子的内皮(嫩皮)、外皮及其混合物中的一种以上的提取物。上述栗子皮可以是来自任一种类的栗子的皮，没有特别限制，例如可以是选自 ^ (Castanea crenata S. et Z.，Castanea mollissima Bi.，Castanea bulgaris) (Castanea Bungeana Bi.)禾口卓月鲜栗(Castanea crenata for. multicarpa (Uyeki) Chung) 中的一种以上的栗子的皮。作为栗子皮，可以使用栗子的内皮(嫩皮)，也可以使用栗子的外皮(外壳)，但特别确认了在经栗子外皮(外壳)提取物处理的组中可呈现优异的PAR-2 拮抗作用。上述栗子皮提取物的提取方法没有特别限制，例如可以通过选自水、碳原子数为 1 4的低级醇、1，3- 丁二醇及其混合溶剂中的一种以上溶剂进行提取，上述溶剂例如可以是选自水、甲醇、乙醇、1，3_ 丁二醇、丁醇及其混合物中的一种以上，例如，上述栗子皮提取物可以由10 100%的醇水溶液或10 100%的1，3-丁二醇提取，具体而言，可以是栗子皮的20 90%乙醇水溶液提取物或10 70%的1，3-丁二醇提取物，更具体而言，可以是栗子皮的40 90%乙醇水溶液提取物或10 50%的1，3-丁二醇提取物，进一步具体而言，可以是栗子皮的60 90%乙醇水溶液提取物或20 40%的1，3-丁二醇提取物。上述组合物中所含的栗子皮提取物的含量没有特别限制，但以组合物的总重量为基准，能以0. 005 80重量％的含量含有，优选能以0. 01 30重量％含有。若上述栗子皮提取物的含量过少，则效果变得甚微，若过多，则剂型的稳定度会变低。根据情况，为了缓和或抑制瘙痒症、改善皮肤屏障、以及抑制免疫，栗子皮提取物也可以与抗组胺剂、类固醇剂、局部麻醉剂、免疫抑制剂中的一种或一种以上的物质并用。以往，用于缓和特应性皮炎和瘙痒症的技术是服用抗组胺剂、将类固醇制剂作为外用剂进行涂布，但这些制剂具有即使呈现暂时的治疗效果也很快复发这样的缺点，进而， 报告了服用这些药物时的中枢神经障碍、消化器官障碍等副作用。作为肾上腺皮质激素的类固醇制剂由于高效的消炎作用和免疫抑制作用而效果优异，但副作用也严重，报告了作为免疫抑制剂的他克莫司水合物软膏对特应性皮炎的治疗有效，但可能诱发皮肤癌，或者在皮肤损伤部位大量吸收到体内时诱发肾脏障碍，实际情况是在安全性方面考虑，难以长期使用。因此，将含有栗子皮提取物作为有效成分的组合物与抗组胺剂、类固醇剂、局部麻醉剂、免疫抑制剂中的一种或一种以上适当地并用时，能够对瘙痒症的缓和或抑制、皮肤屏障改善、以及免疫抑制等不伴有副作用而安全地显示显著的效果。上述药学组合物还可以进一步含有防腐剂、稳定剂、水合剂或乳化促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂等药用辅料以及其他在治疗上有用的物质，除了常用的无机或有机载体以外，还能够以固体、半固体或液状的形态进行口服给药，或者以非口服、直肠、局部、经皮、静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下等进行给药，特别优选口服给药。上述口服给药制剂有例如片剂、丸剂、硬质和软质胶囊剂、液体制剂、悬浮剂、乳齐U、糖浆剂、颗粒剂等，这些剂型除了有效成分以外还可以含有稀释剂(例乳糖、葡萄糖、 蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁或钙盐、以及聚乙二醇)。片剂还可以含有硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮之类的结合剂，根据情况，可以含有淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐之类的崩解剂、吸收剂、着色剂、香味剂和甜味剂等药剂学添加剂。上述片剂可以通过通常的混合、颗粒化或涂布方法而制备。另外，上述非口服给药剂例如可以是皮肤外用剂，也可以是洗剂、软膏、凝胶、霜、 贴剂或喷雾剂的剂型，但并不限于这些。上述健康食品组合物没有特别限定剂型，例如可以制成片剂、颗粒剂、饮剂、糖蜜、 餐棒(diet bar)等剂型。对各剂型的健康食品组合物，除了有效成分以外，本领域技术人员可以毫无困难地将该领域通常使用的成分根据剂型或使用目的而适当地选定配合，与其它原料同时使用的情况下，能够起到协同效果。上述有效成分的给药量的确定在本领域技术人员的水准内，药物的1日给药用量根据要给药的对象的进展程度、发病时期、年龄、健康状态、合并症等多种因素不同而异，但若以成人为基准，则一般可以将上述组合物1 500mg/kg、优选为30 200mg/kg按照1日分成1 2次进行给药，上述给药量无论用任何方法也不限定本发明的范围。以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但下述实施例是用于例示本发明，本发明的范围不被它们所限定。[实施例1]栗子皮提取物的制备1-1)栗子皮1，3_ 丁二醇提取物的制备利用30%的1，3_ 丁二醇(l，3-buthylene glycol)，使栗子皮在室温下浸出3天。 接着，用250目、34!11、14111、0.54111大小的过滤器依次进行过滤。然后，在0 4°C下放置 6tanding)3天后，用0. 5μπι、0. 3μπι、0. 2μπι大小的过滤器依次进行过滤，得到栗子皮1， 3-丁二醇提取物。1-2)栗子皮乙醇提取物的制备
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利用70%乙醇，使栗子皮在室温下浸出3天。接着，用250目、3 μ m、1 μ m、0. 5 μ m、 0. 3μπι、0. 2μπι大小的过滤器依次进行过滤。然后，在60°C下浓缩溶液后，在30°C下实施 18小时的真空干燥，得到粉末形态的栗子皮乙醇提取物。[试验例1]栗子皮乙醇提取物的PAR-2活性抑制效果(体外，胰蛋白酶处理，HEK 人表皮角质细胞)实验前一天，将角质形成细胞(细胞株名HaCaT，获取地点ATCC)在96孔(well) 板中以成为4X IO4细胞/孔的方式进行分株，然后在37°C、5% CO2的培养箱(incubator) 中培养M小时。24小时后，将96孔板用HBSS(Hanks，Balanced Salt solution)缓冲液清洗(washing) 2 次后，将反应缓冲液(reaction buffer :2uM Fluo-4-AM, 20 % Pluronic 酸，2. 5mM丙磺舒)加入细胞中。在37°C、5% CO2的培养箱(inciAator)中反应30分钟， 在室温下反应30分钟后，用HBSS缓冲液清洗(washing) 2次，将栗子皮乙醇提取物分别以 lppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm和50ppm的浓度对细胞进行处理。反应10分钟后， 用2U/ml胰蛋白酶(Trypsin)进行处理，测定80秒钟的细胞内Ca2+浓度变化。细胞内Ca2+ 浓度变化的测定利用Fledtation 3(分子器件，美国)。在栗子皮乙醇提取物与胰蛋白酶 (Trypsin)处理后，求出测定80秒钟的屈曲(flex)而得到的值中的最小值与最大值之差后，将该值与胰蛋白酶(Trypsin)处理时的最小值与最大值之差进行比较而求出抑制率。参照图1，可以确认利用胰蛋白酶在PAR-2的N-末端剪切丝氨酸序列(sequence) 而使PAR-2活化的情况下，钙离子流入细胞内，但经栗子皮提取物处理的组的情况下， PAR-2活化被抑制，钙离子的流入显著减少。[试验例2]栗子皮乙醇提取物的PAR-2活性抑制效果(体外，SLIGKV处理，HEK 人表皮角质细胞)实验前一天，将角质形成细胞(细胞株名HaCaT，获取地点ATCC)在96孔(well) 板中以成为4X IO4细胞/孔的方式进行分株，然后在37°C、5% CO2的培养箱(incubator) 中培养M小时。24小时后，将96孔板用HBSS(Hanks，Balanced Salt solution)缓冲液清洗(washing) 2 次后，将反应缓冲液(reaction buffer :2uM Fluo-4-AM, 20 % Pluronic 酸，2. 5mM丙磺舒)加入细胞中。在37°C、5% CO2的培养箱(inciAator)中反应30分钟， 在室温下反应30分钟后，用HBSS缓冲液清洗(washing) 2次，将栗子皮乙醇提取物分别以 lppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm和50ppm的浓度对细胞进行处理。反应10分钟后，用 5uMPAR-AP (SLIGKV)进行处理，测定80秒钟的细胞内Ca2+浓度变化。细胞内Ca2+浓度变化的测定利用Fledtation 3 (分子器件，美国)。在栗子皮乙醇提取物与5uM PAR-AP (SLIGKV) 处理后，求出测定80秒钟的屈曲(flex)而得到的值中的最小值与最大值之差后，将该值与 5uM PAR-AP(SLIGKV)处理时的最小值与最大值之差进行比较而求出抑制率。参照图2，可以确认如果属于活化肽的SLIGKV(人)作为直接配体发挥作用而使 PAR-2活化，则细胞内流入钙离子，但经栗子皮提取物处理的组的情况下，PAR-2活化被抑制，钙离子的流入显著减少。[试验例3]栗子皮1，3-丁二醇(BG)提取物的PAR-2活性抑制效果(体外，SLIGKV 处理，HEK:人表皮角质细胞)实验前一天，将角质形成细胞(细胞株名HaCaT，获取地点ATCC)在96孔(well) 板中以成为4X IO4细胞/孔的方式进行分株，然后在37°C、5% CO2的培养箱(incubator)中培养M小时。24小时后，将96孔板用HBSS (Hanks'Balanced Salt solution)缓冲液清洗(washing) 2 次后，将反应缓冲液(reaction buffer :2uM Fluo_4_AM，20% Pluronic 酸， 2. 5mM丙磺舒)加入细胞中。在37°C、5% CO2的培养箱(incubator)中反应30分钟，在室温下反应30分钟后，用HBSS缓冲液清洗(washing) 2次，将栗子皮1，3- 丁二醇(BG)提取物分别以0. lw/v%,0. 5 八％和lw/v%的浓度对细胞进行处理。反应10分钟后，用2U/ml 胰蛋白酶CTrypsin)或5uM PAR-AP(SLIGKV)进行处理，测定80秒钟的细胞内Ca2+浓度变化。细胞内Ca2+浓度变化的测定利用FlexMation 3 (Molecular Device, USA) 经过栗子皮1，3-丁二醇(BG)提取物与2U/ml胰蛋白酶CTrypsin)或5uM PAR-AP (SLIGKV)处理后， 求出测定80秒钟的屈曲(flex)而得到的值中的最小值与最大值之差后，将该值与经2U/ml 胰蛋白酶或5uM PAR-AP(SLIGKV)处理时的最小值与最大值之差进行比较而求出抑制率。参照图3，可以确认胰蛋白酶或PAR-2活性肽(SLIGKV)导致的细胞内钙离子的流入随着栗子皮提取物的浓度变高而显著减少。[试验例4]栗子皮1，3_丁二醇(BG)提取物对由胰蛋白酶诱发的瘙痒症的抑制效果观察到在无毛小鼠(Hairless mice)中，将栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物(在 PBS缓冲液中)分别以lw/v^UOw/v1^和20W/V%的浓度同时进行注入，而使皮内(ID)注射胰蛋白酶(在PBS缓冲液中)200 μ g/部位所致的搔抓行为特性(scratching behavior) 按浓度得以抑制。各测定值以相对于2次基线(Baseline)测定平均值的百分率变化进行表示，将其结果示于图4。参照图4，1，3- 丁二醇(BG ；载体)处置组与1 %栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物处置组被观察到没有抑制由胰蛋白酶诱发的瘙痒的效果，但在10%、20%栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物处置组中观察到抑制效果非常大。[试验例5]栗子皮1，3-丁二醇(BG)提取物对由SLIGRL诱发的瘙痒的抑制效果观察在无毛小鼠(Hairless mice)中，将栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物(在PBS 缓冲液中)分别以1%、10%和20%的浓度同时注入，而使皮内(ID)注射SLIGRL(小鼠 PAR-2活性肽，在PBS缓冲液中)50 μ g/部位所致的搔抓行为特性(scratching behavior) 按浓度得以抑制。各测定值用相对于2次基线(Baseline)测定平均值的百分率变化进行表示，将其结果示于图5。参照图5，可以观察到从栗子皮1，3_ 丁二醇(BG)提取物处置组开始至10%、 20%栗子皮1，3-丁二醇(BG)提取物处置组，随着栗子皮提取物的浓度增加，由SLIGRL诱发的瘙痒得以抑制的程度增加。[试验例6]栗子皮乙醇提取物的皮肤涂布导致的抑制由SLIGRL诱发的瘙痒症的效果对各试验组进行皮肤涂布处理的栗子皮提取物均是溶解于将水、乙醇、1，3 丁二醇以5 3 2的比例进行混合的溶液中而使用，试验浓度是将粉末形态的栗子皮乙醇提取物以1、3和10W/V%的浓度使用。载体(vehicle)组使用不添加实施例1的提取物而制作的制剂，作为瘙痒诱发物质，将PAR-2活性肽(Activating Peptide (SLIGRL，来自啮齿类的肽))溶解于PBS缓冲液中，以50 μ g/处的浓度进行皮内注射。取栗子皮乙醇提取物的各试样200 μ 1，以在无毛小鼠的背部部位广泛伸展涂布的方式进行处理。分为上午和下午，1天2次，处理4天，第5天的上午，在瘙痒诱发物质注射 30分钟前，进行最后的处理。为了比较瘙痒诱发物质(PAR-2活性肽、SLIGRL)所致瘙痒的增加和栗子皮乙醇提取物导致的瘙痒减少的有无，测定栗子皮乙醇提取物的皮肤涂布前2天每次测定40分钟的搔抓次数，将计算2天的平均值而得到的值与刺激源注入后40分钟的搔抓次数进行比较， 用百分比变化值表示。瘙痒的实验从将无毛小鼠在注射瘙痒诱发物质20分钟前装入观察用透明栏中而给予20分钟适应时间开始。适应时间结束时，将瘙痒诱发物质(PAR-2活性肽；SLIGRL)对适应结束的试验无毛小鼠的背部部位的皮肤进行皮内注射(intradermal injection)。注射结束时，直接将无毛小鼠再次装入观察用栏中后，测定40分钟的后肢搔抓注射有瘙痒诱发物质的部位的次数。将用前足搔抓或者用嘴咬的行为排除在外，仅将用后足搔抓注射部位的行为作为瘙痒行为的指标进行测定。参照图6，可以确认将栗子皮乙醇提取物(Chestnut Inner Bark Extract)涂布于皮肤后，在为10%的浓度时，即使在没有给与瘙痒刺激的通常状态下，搔抓次数也减少，在给与瘙痒刺激的情况下，从浓度开始搔抓次数减少。[试验例7]栗子皮乙醇提取物的口服给药导致的抑制由SLIGRL诱发的瘙痒症的效果将实施例1中获得的提取物对8周龄的雌性无毛小鼠(Hariless mice)进行口服给药，观察瘙痒抑制效果。对各试验组进行口服给药处理的栗子皮提取物均与蒸馏水混合而作为悬浊液使用，试验浓度是将粉末形态的栗子皮乙醇提取物分别以200和500mg/Kg的浓度进行口服给药。载体(vehicle)组没有添加实施例1的提取物而使用纯蒸馏水，作为瘙痒诱发物质，将 PAR-2活性肽(Activating P印tide (SLIGRL，来自啮齿类的肽))溶解于PBS缓冲液中，以 50 μ g/处的浓度进行皮内注射。口服给药是取适当量的上述试样，以1日1次给药5天，第5天的上午，在瘙痒诱发物质注射30分钟前，进行最后的给药。为了比较瘙痒诱发物质(PAR-2活性肽、SLIGRL)所致瘙痒的增加和栗子皮乙醇提取物口服给药导致的瘙痒减少的有无，测定栗子皮乙醇提取物的口服给药前2天每次测定 40分钟的搔抓次数，将计算2天的平均值而得到的值与刺激源注入后40分钟的搔抓次数进行比较，用百分比变化值表示。瘙痒实验从将无毛小鼠在注射瘙痒诱发物质20分钟前装入观察用透明栏中而给予20分钟适应时间开始。适应时间结束后，将瘙痒诱发物质(PAR-2活性肽；SLIGRL)对适应结束的试验无毛小鼠的背部部位的皮肤进行皮内注射(intradermal injection)。注射结束后，直接将无毛小鼠再次装入观察用栏中后，测定40分钟的用后肢搔抓注射有瘙痒诱发物质的部位的次数。将用前足搔抓或者用嘴咬的行为排除在外，仅将用后足搔抓注射部位的行为作为瘙痒行为的指标进行测定。参照图7，可以确认将栗子皮乙醇提取物进行口服给药后，栗子皮对瘙痒刺激的抑制效果随浓度而减少。[试验例8]栗子皮提取物导致TNF-α的分泌减少
实验前一天，将皮肤角化上皮细胞(Normalhuman skin IceratinocyteiNHEKjffI 售商L0nza)以成为5X104细胞/孔的方式在96孔(well)板中进行分株，然后在37°C、5% CO2的培养箱(incubator)中培养M小时。M小时后，用PBS清洗2次细胞，换成无血清 KBM(serum free KBM(角质形成细胞基底介质))。对各个孔(well)经栗子皮按浓度进行处理(10、25、50 111)，反应30分钟后，分别用？654(10、50 111)、1^5(1 111)处理。在 37°C、5% CO2的培养箱(incubator)中培养M小时后，取出培养液，进行对TNF-α的ELISA。ELISA 利用制造公司(BD science)的实验方法。参照图8，可以观察到栗子皮使因PGSA和LPS而增加的TNF- α分泌显著减少。[试验例9]栗子皮提取物导致IL-6的分泌减少进行对IL-6的ELISA，除此以外，利用与试验例8实质上相同的方法。参照图9，可以观察到栗子皮使因PGSA和LPS而增加的IL_6分泌得到悬殊的抑制。[试验例10]栗子皮提取物导致IL-Iα的分泌减少进行对IL-I α的ELISA，除此以外，利用与试验例8实质上相同的方法。参照图10，可以观察到栗子皮使因PGSA和LPS而增加的IL-I α分泌量随浓度增加而减少。[试验例11]栗子皮提取物导致IL-8的分泌减少进行对IL-8的ELISA，除此以外，利用与试验例8实质上相同的方法。参照图11，可以观察到栗子皮使因PGSA和LPS而增加的IL_8分泌显著减少。[试验例12]栗子皮提取物导致GM-CSF的分泌减少进行对GM-CSF的ELISA，除此以外，利用与试验例8实质上相同的方法。参照图12，可以观察到随着栗子皮的浓度增加，因PGSA和LPS而分泌的GM-CSF的量减少。[试验例13]栗子皮提取物对胰蛋白酶和活性肽(SLIGKV)所致IL_6分泌的抑制效果实验前一天，将皮肤角化上皮细胞(Normal human skin keratinocyte，NHEK，获取地点L0nza)以成为5X104细胞/孔的方式在96孔(well)板中进行分株，然后在37°C、 5% CO2的培养箱(inciAator)中培养M小时。M小时后，用PBS清洗2次细胞，换成无血清KBM(serum free KBM(角质形成细胞基底介质))。用栗子皮提取物对各个孔(well)按浓度进行处理(10、50ppm)，反应30分钟后，分别用胰蛋白酶(IOnM)或PAR-2活化肽(SLIGKV， 50uM)进行处理。在37°C、5% CO2的培养箱(inciAator)中培养M小时后，取出培养液， 进行对IL-6的ELISA。ELISA利用制造公司(BD science)的实验方法。参照图13，可以观察到栗子皮提取物浓度依赖性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV)导致的IL-6分泌。[试验例14]栗子皮提取物对胰蛋白酶和活性肽(SLIGKV)所致IL_8分泌的抑制效果进行对IL-8的ELISA，除此以外，利用与试验例13实质上相同的方法。参照图14，可以观察到栗子皮提取物浓度依赖性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV)导致的IL-8分泌。
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[试验例15]栗子皮提取物对胰蛋白酶和活性肽(SLIGKV)所致GM-CSF分泌的抑制效果进行对GM-CSF的ELISA，除此以外，利用与试验例13实质上相同的方法。参照图15，可以观察到栗子皮提取物浓度依赖性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV)导致的GM-CSF分泌。[试验例16]测定栗子皮乙醇提取物的皮肤保湿效果评价实施例1的栗子皮乙醇提取物对长时间皮肤损伤的皮肤屏障功能恢复能力。 首先，在出生后经7 8周的年轻无毛小鼠(Orient，韩国)的背部(back)每日涂布1次口恶唑酮(oxazolone)，周期性地涂布6天，使实验动物的皮肤屏障受到损伤。然后，用蒸发计(Delf in，芬兰)测定经皮水分损失量CTrans印idermal Water Loss :TEWL)，将具有每小时显示50g/m2以上经皮水分损失的皮肤的实验动物进行分组，将1和5w/V%的栗子皮提取物分别以每5cm2皮肤面积为100 μ 1的容量，每日2次，连续涂布10天后，测定实验动物的经皮水分损失量(TEWL)，将其结果示于图16。如图16所示，可知在对无毛小鼠进行ρ恶唑酮处理的过敏模型(Allergy model) 中，通过涂布栗子皮提取物，对由唑酮诱导的皮炎(特应性皮炎，atopic dermatitis)而导致增加的经皮水分损失量具有使损伤的屏障功能恢复而回到正常皮肤的功能。[试验例17]测定栗子皮乙醇提取物改善角化过度的效果在实施例1中，评价栗子皮乙醇提取物改善皮肤角化过度的效果。首先，在出生后经7 8周的年轻无毛小鼠(Orient，韩国)的背部(back)每日涂布1次“恶唑酮(oxazolone)，周期性地涂布6天，使实验动物的皮肤屏障受到损伤。然后，用蒸发计 (Delf in，芬兰)测定经皮水分损失量CTrans印idermal Water Loss :TEWL)，将具有每小时显示50g/m2以上经皮水分损失的皮肤的实验动物进行分组，将试验物质以每5cm2皮肤面积为100 μ 1的容量，每日2次，连续涂布10天后，夹起背部(back)的测定部位左右(双折叠测量，two-folding measurement)，利用测微计(三菱，日本)测定皮肤厚度，将其结果示于图17。参照图17，可以确认通过使用栗子皮提取物的粉末，对由0悉唑酮(oxazolon)诱发的皮炎而导致增加的皮肤厚度显示出抑制皮肤角化过度的效果。[试验例18]测定栗子皮乙醇提取物在NC/Nga模型中减少IgE和改善瘙痒症的效果在实施例1中，用NC/Nga小鼠模型评价栗子皮乙醇提取物的血清内IgE减少和瘙痒改善效果。首先，将出生后经7 8周的年轻NC/Nga小鼠的背部(back)部位利用剪毛机(clipper)进行脱毛，将残余的毛利用脱毛膏完全除去。对露出的背部部位和耳廓部位， 将Df (粉尘螨(dermatophagoides farinae)) IOOmg以一周2次在3周中均勻地涂布4次， 而诱发特应性疾病。以一周5次在3周中将栗子皮提取物分成100mg/kg和250mg/kg的2 组进行给药后，为了测定瘙痒症，将NC/Nga小鼠装入观察用栏后，测定在2小时之间用后肢搔抓背部部位的次数。将用前足搔抓或者用嘴咬的行为排除在外，仅将用后足搔抓的行为作为瘙痒行为的指标进行测定。血清IgE的测定为从通过眼窝静脉丛进行采血的血液样品分离血清，利用BD科学(BD science)的Opt IgE试剂盒(Opt IgE kit)实施ELISA而进行测定。图18中表示在250mg/kg给药组中瘙痒与非处理组相比减少，参照图19，可以确认在250mg/kg的给药组中显著地表现出IgE的减少。[试验例19]栗子外皮乙醇提取物与栗子内皮乙醇提取物的PAR-2活性抑制效果的比较(体外，SLIGKV处理，HEK 人表皮角质细胞)将栗子的外皮和内皮进行分离而干燥后，按照与实施例1-2)相同的方法制备栗子外皮提取物，栗子内皮提取物也按照与实施例1-2)相同的方法制备。使用与试验例2相同的方法来测定栗子外皮乙醇提取物与栗子内皮乙醇提取物的PAR-2活性抑制效果，并示于下述表2和图20中。表权利要求
1.一种用于缓和或抑制瘙痒症的健康食品或药学组合物，其中，含有栗子皮提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的用于缓和或抑制瘙痒症的健康食品或药学组合物，其中，所述组合物缓和或抑制由包括炎症性皮炎、特应性皮炎、肌肤皲裂所致的皮炎、痱子、溃疡、冻伤、接触性皮炎、脂溢性皮炎、银屑病及副银屑病的皮炎中的任一种以上诱发的瘙痒症。
3.根据权利要求1所述的用于缓和或抑制瘙痒症的健康食品或药学组合物，其中，所述组合物缓和或抑制由特应性皮炎诱发的瘙痒症。
4.一种用于改善皮肤屏障功能的健康食品或药学组合物，其中，含有栗子皮提取物作为有效成分。
5.根据权利要求4所述的用于改善皮肤屏障的健康食品或药学组合物，其中，所述组合物用于缓和来自特应性皮炎的皮肤屏障损伤或者改善皮肤屏障的恢复力。
6.根据权利要求4所述的用于改善皮肤屏障的健康食品或药学组合物，其中，所述组合物用于增进皮肤保湿或防止皮肤角化过度。
7.一种用于抑制免疫的健康食品或药学组合物，其中，含有栗子皮提取物作为有效成分。
8.根据权利要求7所述的用于抑制免疫的健康食品或药学组合物，其中，所述组合物用于特应性疾病的预防或治疗。
9.根据权利要求7所述的用于抑制免疫的健康食品或药学组合物，其中，所述组合物用于特应性的治疗。
10.一种用于改善或治疗特应性皮炎的健康食品或药学组合物，其中，含有栗子皮提取物作为有效成分。
11.根据权利要求1 10中任一项所述的健康食品或药学组合物，其中，以组合物的总重量为基准，以0. 005 80重量％的含量含有所述栗子皮提取物。
12.根据权利要求1 10中任一项所述的健康食品或药学组合物，其中，所述栗子皮是选自栗子的内皮、外皮及它们的混合物中的一种以上。
13.根据权利要求12所述的健康食品或药学组合物，其中，所述栗子皮是栗子的外皮， 即外壳。
14.根据权利要求1 10中任一项所述的健康食品或药学组合物，其中，所述栗子皮提取物是通过选自水、碳原子数为1 4的低级醇、1，3_丁二醇及它们的混合溶剂中的一种以上的溶剂进行提取的。
15.根据权利要求14所述的健康食品或药学组合物，其中，所述栗子皮提取物是通过选自水、甲醇、乙醇、丁醇、1，3_ 丁二醇及它们的混合物中的溶剂进行提取的。
全文摘要
本发明涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于缓和或抑制瘙痒症的健康食品或药学组合物。本发明涉及的健康食品或药学组合物中所含的栗子皮提取物在本发明的一个实施例中被确认通过抑制作为瘙痒刺激源的蛋白分解酶活性受体-2(Proteinase-Activated Receptor-2PAR-2)的活性，从而可以发挥优异的缓和或抑制瘙痒症的效果，结果可以适合用作用于缓和或抑制瘙痒症的健康食品或药学组合物的有效成分。
文档编号A23L1/30GK102458156SQ201080035903
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月18日 优先权日2009年6月18日
发明者尹侦训, 尹晙源, 徐姃我, 朱泳協, 朴永镐, 李昌锡, 林庆珉, 沈范, 金善暎, 金赫, 高在濚 申请人:株式会社爱茉莉太平洋