蒲葵提取物单体、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种蒲葵提取物单体、其制备方法以及其应 用。
【背景技术】
[0002] 蒲葵，属于棕榈科蒲葵属，拉丁名为Livistona chinensis，喜温暖、湿润、向阳的 环境，分布在热带、亚热带地区，常用来绿化，此外，蒲葵还具有药用价值。
[0003] 蒲葵是一种多年生常绿高大的乔木，形态特征如下：单干，高5-20米，直径20-30厘 米，根部常膨大。叶阔呈肾状扇形，其直径1米余，掌状深裂至中部，裂片条状且披针形;叶柄 长1-2米，下部两侧有沟刺。花序呈圆锥状，长约1米，分支多而疏散;花萼裂至近基部成近尖 状裂片，裂片有宽的干膜质的边缘;子房上面有深雕纹，花柱突变成钻状;果实黑褐色呈椭 圆形，长1.4-2.2厘米，直径1-1.2厘米;种子椭圆形，长1.5厘米，直径0.9厘米。
[0004] 在中医临床上，蒲葵根具有止痛作用，蒲葵叶具有收敛止血止汗作用，蒲葵子具有 止痛及败毒抗癌、消淤止血之功效。民间常用其治疗白血病、鼻咽癌、绒毛膜癌、食道癌[陈 艳，林新华，李少光，翁绳美，姚宏.蒲葵子的体外抗癌活性.福建医科大学学报[J]，2008，2: 93-95.;曾春晖杨柯郑作文.蒲葵子的含药血清体外抗肿瘤作用的实验研究.广西中医药 [J]，2007，30( 1): 58-59.]。但尚无其它临床应用的报道。
[0005] 宫颈癌是一种在女性癌症患者中仅次于乳腺癌和大肠癌的恶性肿瘤，在发展中国 家是第二常见的恶性肿瘤，仅次于乳腺癌。宫颈癌的具体发病机制尚不清楚，主要与病毒感 染、基因突变、端粒酶活性、激素异常、营养不良、免疫功能异常等诸多因素有关。目前，宫颈 癌的治疗方案主要包括手术切除和放射疗法。化疗是一个重要的治疗手段，特别适用于晚 期和转移性的治疗。但在化疗的过程中，一些癌细胞可出现不同程度的耐药性现象。此外， 大多数化疗药物的毒性大，化疗后大多数患者出现很多不良反应，所有这些使化疗药物应 用受到一定限制。因此，寻找一种新的有效且低毒的化疗药物具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，旨在提供一种蒲葵提取物单 体及其制备方法和应用。
[0007] 本发明所述蒲葵提取物单体所采用的技术方案是，该单体的结构如下：
本发明上述蒲葵提取物单体的制备方法所采用的技术方案是:该方法用有机溶剂提取 并经过硅胶柱和HPLC分离得到蒲葵提取物单体。
[0008] -个优选的方案是，上述方法的具体步骤为： (1)将蒲葵原料洗净，烘干，粉碎至20-100目，得到干粉； (2 )取步骤(1)得到的干粉，加入70%的乙醇水溶液，室温条件下静置浸提24小时并循环 回流，其中加入的干粉和乙醇水溶液的质量/体积比为w/v=l:20; (3)将步骤(2)得到的全部液体在50°C的真空下将有机溶剂蒸发，得到棕色浆状粗提取 物，该粗提取物悬浮于水，用氯仿萃取，将上述提取物过200-300目硅胶柱，用氯仿-甲醇溶 液洗脱硅胶柱上的成分，用HPLC纯化分离即得到蒲葵提取物单体。
[0009] 进一步优选的方案是，所述蒲葵原料为蒲葵的种子、根或叶。
[0010] 由上述方法制备得到的蒲葵提取物单体在抑制宫颈癌细胞中的应用。
[0011] 所述应用为如下的至少一种： (1) 抑制宫颈癌细胞的增殖和/或生长； (2) 抑制宫颈癌细胞的克隆形成； (3) 促进宫颈癌细胞凋亡； (4) 降低宫颈癌细胞线粒体膜电位并使膜完整性受损； (5) 将宫颈癌细胞的细胞周期抑制在G1/S期； (6) 上调G1/S期的细胞周期蛋白CyclinA2和细胞周期依赖性激酶CDK2蛋白的表达水 平，同时升高P21蛋白的表达水平； (7) 裸鼠体内亦可抑制宫颈癌细胞增殖和/或生长； (8) 治疗宫颈癌。
[0012] 本发明的有益效果是:本发明制备得到的蒲葵提取物单体能显著以时间和剂量依 赖的方式抑制宫颈癌细胞的生长和增殖;能显著降低宫颈癌细胞的线粒体膜电位并使其受 损、诱导细胞发生凋亡性细胞死亡；能显著阻滞宫颈癌细胞停留在G1/S期、上调G1/S期的 Cycl inA2和CDK2蛋白的表达水平、增加抑癌蛋白P21的表达水平;也能在裸鼠体内抑制宫颈 癌细胞增殖和/或生长。本发明为开发蒲葵的药用价值开辟了新的途径，对宫颈癌的治疗具 有重要价值。
【附图说明】
[0013] 图1为所述蒲葵提取物单体的结构图； 图2为MTT增殖抑制实验的结果示意图； 图3为细胞克隆形成实验的结果示意图； 图4为Annexin V-PI双染细胞凋亡率的结果示意图； 图5为DAPI染色后细胞核形态的结果示意图； 图6为线粒体膜电位检测的结果示意图； 图7A为蒲葵提取物对宫颈癌细胞周期的影响示意图； 图7B为加入Cyclin A2的SiRNA后蒲葵提取物对宫颈癌细胞周期的影响示意图； 图7C为加入CDK2的抑制剂Flavopiridol后蒲葵提取物对宫颈癌细胞周期的影响示意 图； 图7D为蒲癸提取物对宫颈癌细胞的相关细胞周期蛋白的影响不意图； 图7E为分别加入SiRNA和Flavopiridol后蒲葵提取物对细胞周期蛋白Cyclin A2和 CDK2的影响示意图； 图8A为蒲葵提取物在裸鼠体内对肿瘤体积的影响示意图； 图8B为蒲葵提取物在裸鼠体内对肿瘤重量的影响示意图。
【具体实施方式】
[0014] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常 规生化试剂商店或公司均可购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验， 结果取平均值。实施例中的细胞培养均采用DEME高糖血清培养基。
[0015] Hela细胞（宫颈癌细胞）：购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，产品目录号： 3142C0001000000009<Xaski细胞(宫颈癌细胞）：购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，产 品目录号：3142C0001000000117。
[0016] 实施例1、蒲葵提取物的制备 1、将蒲葵种子、根、叶洗净、烘干、粉碎至60目（实际应用中20-100目均可），得到干粉。
[0017] 2、取10kg步骤1得到的干粉，加入200L 70%乙醇水溶液，室温条件下静置浸提24小 时并循环回流。
[0018] 3、将完成步骤2的全部液体在50°C的真空下将有机溶剂蒸发，得到的棕色浆状粗 提取物1.8kg，该粗提取物悬浮于水，用氯仿萃取。将上述提取物过200-300目硅胶柱，用氯 仿-甲醇溶液洗脱硅胶柱上的成分，用HPLC纯化分离即可得到2-(3'_羟基-5'-甲氧基苯 基)-3-羟甲基-7-甲氧基-2,3-二氢苯并呋喃-5-羧酸，结构见图1。以步骤2中的干粉计，蒲 葵提取物的浓度为1 〇mg/mL。
[0019] 实施例2、蒲葵提取物抑制宫颈癌细胞的生长和增殖 分别将Hela细胞和Caski细胞进行如下实验： 一、MTT增殖抑制实验 将Hela细胞悬液(细胞密度为1 X 104/ml)接种至96孔板中；然后加入实施例1制备的蒲 葵提取物，使其在各个孔中的终浓度分别为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或20yg/ ml(每个浓度设置3个复孔），设置用等体积液体培养基代替蒲葵提取物的空白对照，37°C培 养;从加入蒲葵提取物开始计时，分别于24h、48h(每个处理时间设置3个复孔)后每孔20ul 加入MTT溶液(5mg/ml)，37 °C培养4h，弃上清，每孔加150μ1的DMS0，震荡lOmin使结晶紫全部 溶解，然后于490nm测吸光度值(0D490nm)。抑制率=(空白对照组的0D49Q数值-实验组的 0D49Qr?数值）+空白对照组的OD49〇 nm数值X 100%。
[0020] 各浓度不同处理时间的抑制率结果见图2和表1。
[0021 ]表1各浓度处理实验组的抑制率结果(平均值）
结果表明，蒲葵提取物以时间和剂量依赖的方式显著抑制了宫颈癌细胞的生长和增 殖。
[0022] 二、细胞克隆形成实验 将配置的对数期Caski细胞悬液(细胞密度为1 X 103/ml)接种至6孔板上层(6孔板的每 个孔中，上层为lml含0.6g/100ml软琼脂和实施例1制备的蒲葵提取物的2XDMEM培养基， 下层为lml含1.2g/100ml软琼脂和实施例1制备的蒲葵提取物的2XDMEM培养基;上层和下 层的蒲葵提取物浓度相等；各孔中蒲葵提取物的终浓度分别为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5yg/ ml、10μg/ml或20μg/ml，每个浓度设置3个复孔;设置用等体积培养基代替蒲葵提取物的空 白对照），37 °C，5% C02及饱和湿度环境下培养2周，然后用1 %多聚甲醛固定并用0.1 %结晶 紫染色15分钟，计数克隆数并拍照。
[0023] 结果见图3。蒲葵提取物以剂量依赖的方式显著抑制了宫颈癌细胞的克隆形成。
[0024] 实施例3、蒲葵提取物促进宫颈癌细胞凋亡 分别将Hela细胞和Caski细胞进行如下实验： 一、Annexin V-PI双染细胞凋亡率分析 取对数生长期的Hela细胞接种至6孔板中（1 X 106个/孔），待细胞贴壁后，然后加入实 施例1制备的蒲葵提取物，使其在各个孔中的浓度分别为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μ g/ml、20μg/ml (每个浓度设置3个复孔），设置用等体积液体培养基代替蒲葵提取物的空白 对照，37 °C培养24h;用0.25%胰蛋白酶消化后每样本收集1 X 106个细胞，用PBS缓冲液洗涤2 次，加入195μ1 Annexin V-FITC结合缓冲液缓慢轻柔的重悬细胞，加入5μ1 Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10分钟。lOOOrpm离心5分钟，弃上清，加入190μ1 Annexin V-FITC结合缓冲液缓慢轻柔重悬细胞。加入10μ