一种治疗肾癌的倍半萜化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥的独活中分离得到的一种新的倍半萜 类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 独活为伞形科植物重齿毛当归Angel ica pubescens Maxim, f.biserrata Shan et Yuan的干燥根。春初苗刚发芽或秋末茎叶枯萎时采挖，除去须根及泥沙，烘至半干，堆置 2~3天，发软后再烘至全干。性微温，味辛、苦，归肾、膀胱经。有祛风除湿、通痹止痛、解表之 功效，临床上主要用于治疗风寒湿痹、腰膝疼痛、风寒挟湿表证、少阴伏风头痛等证。始载于 《神农本草经》，列为上品，言其"味苦，平。主风寒所击，金疮止痛，奔豚，痫痉，女子疝瘕。月艮 轻身耐老"。主产于湖北、四川、陕西、浙江等地，又称川独活、资丘独活、巴东独活、恩施独 活、肉独活、浙独活、绩独活、香独活等，以根条粗壮，油润，质软，香气浓者为佳。
[0003] 目前从各种不同品种独活中已分离出香豆素、萜类、挥发油、有机酸和糖类等多种 化学成分。香豆素是独活重要的活性成分。香豆素(Coumarin)是具有苯骈α-吡喃酮结构的 一类化合物。可看作是顺式邻羟基桂皮酸脱水而形成的内酷，绝大多数在C 7位有羟基或烃 基，具有芳香气味。
[0004] 现代研究证实，独活具有镇静催眠、镇痛、抑制血小板聚集、抗氧化、抗衰老、抗肿 瘤、抗血管生成等药理作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从干燥的独活中分离得到的一种新的倍半萜类化合物， 含其的药物组合物及其制备方法和应用。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物(I):
[0008]
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将干燥的独活粉碎，用80~ 90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正 丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇 取物用大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙醇洗脱8个柱体积，收集 75%洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浓缩物用正相 硅胶分离，依次用体积比为65:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、8:1和5:1的二氯甲烷_ 甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用 体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩 得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用85%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] 药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备治疗肾癌的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)计算E⑶和实验E⑶图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021 ] 主要材料、试剂来源及仪器类型：
[0022]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限 公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0023]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0024] (a)将干燥的独活(8kg)粉碎，用85 %乙醇热回流提取(30L X 3次），合并提取液，浓 缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次)和水饱和的正丁醇(6L X 3 次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（375g)和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙醇洗脱8个 柱体积，收集75 %洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱浓缩物（129g);(c)步骤(b)中75 %乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1 (8个柱体积）、30:1 (8个柱体积）、15:1 (8 个柱体积)和8:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至Ij4个组分；（d)步骤(c)中组分 4(27g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1 (8个柱体积）、8:1 (10个柱体积)和5:1 (8个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2(15g)用十八烷 基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个 柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I) (40mg)。
[0025] 结构确证:无色油状物;册43頂3显示[1+似]+为111/2 259.1720，结合核磁特征可 得分子式为C15H24〇2，不饱和度为4。核磁共振氢谱数据δΗ( ΡΡπι，DMS〇-d6，400MHz):H-1 (2 · 19， m)，H-2(1.93，m)，H-2(2.01，m)，H-3(1.38，m)，H-3(1.56，m)，H-5(3.18，m)，H-6(1.54，m)，H-6(1.67，ddd，J=12.7，11.0,2.4)，H-8(1.93，m)，H-8(2.02，m)，H-9(1.49，m)，H-9(1.55，m)， H-10(5.02，t，J=6.5)，H-12(1.54，s)，H-13(1.56，s)，H-14(4.60，s)，H-14(4.69，s)，H-15 (3.24，(1，了=11.1)，!1-15(3.47，111) ;核磁共振碳谱数据6。(卯111，0130-(16，1001抱）：37.4(〇1， 1-C)，27.6(CH2,2-C)，29.3(CH2,3-C)，68.2(C，4-C)，58.7(CH，5-C)，35.1(CH2,6-C)，155.2 (C，7-C)，35.6(CH2,8-C)，27.0(CH2,9-C)，125.1(CH，10-C)，131.8(C，n-C)，17.6(CH 3，12-C)，25 · 4(CH3，13-C)，107 · 5(CH2，14-C)，68 · 9(CH2，15-C);碳原子标记参见图 1 ,Η-NMR谱显 示了两个甲基信号[SH1.54(3H，s，H-12)和1.56(3!1，8，!1-13)]，一个烯属亚甲基[6!14.60(8， H-14)和4.69(8，!1-14)]，一个含氧亚甲基[5!13.24((1，了=11.1!^，!1-15)和3.47(111，!1-15)]， 一个烯属次甲基质子信号[阳5.02(^ = 6.5抱，!1-10)]，一个含氧次甲基信号[6!13.18(111， H-5)L13C-NMR谱显示了 15个共振碳信号，包括两个甲基，七个亚甲基(一个烯属亚甲基，一 个含氧亚甲基），三个次甲基(一个烯属次甲基，一个含氧次甲基），以及三个季碳(两个烯烃 季碳，一个含氧季碳）。HMBC谱中，H2-15 (δΗ3 · 24，3 · 47)，与C-3 (SC29 · 3)，C-4 (SC68 · 2)和C-5 0058.7);!1-5(3!13.18)与(：-1(3037.4)，(：-3(3029.3)，(：-4(3068.2)和(：-15(3068.9) ;!1-10 0!15.02)与(：-8(5035.6)，(：-120(：17.6)和(：-130025.4) ;以及16-12(5!11.54)与(：-10(3 C125.1)和C-13(SC25.4)的相关性表明C-4和C-5为环氧碳，C-11连有两个甲基。R0ESY谱中， H-5与H-15和Η-6α，Η_15与Η_3α和H-5,以及Η_3α与H-15的相关性表明H-5和H-15为α构型；H-6β与Η-1的交叉峰表明Η-1为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和R0ESY谱，以及文献关于相关 类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值 与实验值基本一致(图2)。
[0026]实施例2:化合物（I)药理作用试验
[0027] 一、材料和仪器
[0028] 人肾癌RC-2细胞株购于ATCC细胞库(美国）。分析纯蔗糖购于国药集团化学试剂公 司。重水(D20)购于青岛腾龙微波科技有限公司。1^8、303、30%丙烯酰胺单体、1'冊61120购 于重庆医科大学基础研究所实验室。小牛血清、RPMI-1640购于美国Gibco公司。Centriplus 离心超滤管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管（100kD)、PVDF膜购于 Mi 11 ipore公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海安亭科学仪器厂。5 X SDS-PAGE蛋白质 上样缓冲液、BeyoECL荧光检测试剂、考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250购于碧云天生物技 术研究所。化合物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98%。鼠抗人批？70单克隆抗体、兔抗人 ICAM-1单克隆抗体、兔抗人G250多克隆抗体购于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗体武 汉博士德生物有限公司。
[0029] 超净工作台（苏州华新空调净化有限公司），自动平衡离心机(上海医用分析仪器 厂）