专利名称：含有表没食子儿茶素没食子酸酯与索拉非尼的抗肿瘤药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药及基因工程领域，涉及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与索拉非尼(SORA)组合及其在制备抗肿瘤药剂中的应用。
背景技术：
索拉非尼(sorafenib)是拜耳和ONYX公司共同研制的一种多靶点的生物靶向新药，临床前研究和临床试验提示索拉非尼有广泛的抗肿瘤作用。美国FDA已于2005年12月 20日批准了索拉非尼用于治疗晚期肾细胞癌，这是近十多年来世界上被批准的治疗晚期肾癌的第一个新药，是晚期肾癌治疗的重大进展。2006年11月30日索拉非尼也在中国上市。 索拉菲尼的CAS编号为284461-73-0，分子式为C21H16C1F3N4O3，分子量为464. 83，化学名为4- {4- [3- (4-氯-3-三氟甲基-苯基)-酰脲]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸盐。索拉非尼是首个双芳基尿素类口服多激酶抑制剂，即酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂和血管内皮生长因子抑制剂。它具有双重抗肿瘤作用，一方面通过抑制Raf/MEK/ ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长，另一方面通过抑制几种与新生血管生成和肿瘤发展有关的酪氨酸激酶受体的活性，包括血管内皮生长因子受体-2 (VEGFR-2)，VEGFR-3，血小板衍生的生长因子受体-β (PDGFR-β )和c-KIT原癌基因，阻断肿瘤新生血管生成，间接抑制肿瘤细胞的生长，从而起到抗肿瘤作用。索拉非尼是本类化合物中第1个进入临床试验的药物，可在抑制Raf活性的剂量下，显著抑制肿瘤细胞增殖。索拉非尼对晚期肝癌也具有极佳的治疗效果。索拉非尼用于治疗晚期肝癌的三期临床试验已经完成，目前已在美国FDA和欧盟药监局进入了快速审批程序。同时，索拉非尼也可用于转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌等癌症的治疗。索拉非尼最常见的不良反应包括手足综合征、疲乏、腹泻、皮疹、高血压、脱发、皮肤瘙痒和恶心或食欲下降。恶性肿瘤的发生发展过程是由多因素诱导和多基因参与的。索拉非尼具有独特的多靶点的抗肿瘤作用，是基于对肿瘤发生的分子生物学机理认识的基础上研制成功的新药。索拉非尼的临床试验结果显示，索拉非尼与化疗药物不同，其作用主要为抑制肿瘤细胞的生长和血管的形成，而非细胞毒效应，因此毒副反应较轻，耐受性较好。多靶点抑制剂在治疗方面优于单靶点抑制剂，索拉非尼具有潜在广谱的抗肿瘤作用。如何进一步提高索拉非尼的疗效(如与其他药物联用)无疑也是目前临床试验急待研究解决的问题。雷帕霉素是一种mTOR通路抑制剂，有一定的抗肿瘤的作用。已有的临床前研究表明，在肝癌治疗中将雷帕霉素与索拉非尼联合使用能够极大的提高索拉非尼的疗效，但是这两种化合物联合使用时的毒副作用较强。所以如何在增强索拉非尼抗肿瘤活性的同时，保持较低的毒副作用也是需要考虑的问题。茶叶(tehcamellia sinensis)是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20%为绿茶、78%为红茶、洲为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目。大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。绿茶中的主要成分为茶多酚，占茶叶干重的30%左右，茶多酚中大部分为儿茶素， 表没食子儿茶素没食子酸酯〔(-)_印igallocatechin gallate, (EGCG)〕含量最高，占儿茶素的80%左右。EGCG分子式为C22H18O11,分子量为458. 4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。但是绿茶提取物毕竟不是细胞毒类药物，在体外对肿瘤细胞的直接杀伤作用不是很强。绿茶提取物及其主要成分不会也不能取代现有的抗肿瘤药物，其独特价值在于作为肿瘤化疗中的生化调节剂，可增强现有抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，降低抗肿瘤药物的毒性。到目前为止，还没有EGCG与索拉非尼联合使用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的抗肿瘤药物。本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，该组合物含有表没食子儿茶素没食子酸酯和索拉非尼，两者的摩尔比为200 1-4 :1。较好的，表没食子儿茶素没食子酸酯和索拉非尼的摩尔比为160:1 8:1。更好的，摩尔比为120:1 8:1，或者80:1 13:1,40 1，60 :1，100 :1，32 :1，20 :1，26 :1，39 :1，52 :1 等。索拉菲尼的CAS编号为观4461-73-0，分子式为C21H16C1F3N4O3,分子量为 464. 83,化学名为4- {4-[3- (4-氯-3-三氟甲基-苯基)-酰脲]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸盐。源自德国拜耳公司。表没食子儿茶素没食子酸酯〔(-)_印igallocatechin gallate, (EGCG)〕的分子式为C22H18O11,分子量为458. 4。EGCG购自Sigma公司，货号5(^99，英文全称()-cis-2 -(3,4, 5-Trihydroxyphenyl)-3, 4-dihydro-l(2H)-benzopyran-3, 5, 7-triol 3-gallate, ( )-cis-3, 3 ' , 4 ' , 5, 5 ' , 7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG ;CAS 号 989-51-5。MDL 号MFCD00075940。本发明中，EGCG与临床常用的抗肝癌药物sorafenib在肿瘤细胞株中均具有一定的协同效应。本发明中，将EGCG与索拉非尼的组合物用于肿瘤细胞(例如，肝癌细胞株 SK-H印1)，结果显示，与仅使用索拉非尼相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。EGCG和索拉非尼联用，明显降低了索拉非尼的使用量，其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明
Mo本发明中，将EGCG和索拉非尼的组合物用于裸鼠移植瘤模型，结果显示，与仅使用索拉非尼相比，本发明的EGCG与索拉非尼组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制效果显著增强，并且效果优于雷帕霉素与索拉非尼组合物。同时，检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示，EGCG和索拉非尼联合使用时对裸鼠体重没有明显影响，而雷帕霉素和索拉非尼联合使用则引起的裸鼠体重的降低。并且EGCG和索拉非尼联合使用时对裸鼠的肝脏和肾脏基本没有毒性，而雷帕霉素和索拉非尼联合使用则对裸鼠的肝脏和肾脏有较高毒性。EGCG和索拉非尼联用，与单独使用EGCG或者索拉非尼相比，在抑制肿瘤细胞生长方面具有明显的增效作用，而且增效作用具有EGCG和索拉非尼浓度梯度效应。本发明的实施例列举T EGCG和索拉非尼含量比为20 1，100 1，200 1等。实验表明，在两者含量为 200:1-13:1的范围都是有效果的。本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，即在肿瘤细胞中加入EGCG和索拉非尼组合物，EGCG和索拉非尼的摩尔比为200 1-13:1。本发明中，所述的肿瘤细胞可以是HepG2、SK-hep-1、YYl、L02、或者PLC细胞。本发明的组合物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中PH通常约为7-8， 尽管PH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。以本发明的EGCG与索拉非尼的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和索拉非尼可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物， 可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的EGCG与索拉非尼的组合物还可与其他治疗剂一起使用。本发明中，EGCG与索拉非尼的组合物可以是针剂或者片剂。当本发明的EGCG与索拉非尼的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约60毫克索拉非尼+50毫克EGCG/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明提供了一种新的组合物，该组合物含EGCG和索拉非尼。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。EGCG和索拉非尼联用，用于制备抗肿瘤药物，可以大大增强索拉非尼的抗肿瘤效果，同时相对减少了索拉非尼的用量及药物成本。由于EGCG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。EGCG作为索拉非尼的辅助药物使用，为一种新的高效价廉抗肿瘤药物的配伍方案，提高了肿瘤的抑制率，降低了肿瘤患者的治疗成本。
图1是SK-Ifepl细胞中EGCG与CBP、MITOC、SORA、DAU有协同作用。其中，横坐标 fa是药物作用效应。图2是H印;3B细胞和SMMC7721细胞中EGCG与SORA有协同作用。其中，横坐标fa 是药物作用效应。图 3 是 EGCG 增效 SORA。
图4是EGCG降低SORA用量。图5是EGCG与SORA联合使用对裸鼠体重无影响。图6是EGCG与SORA联合使用使肿瘤体积减小。图7是EGCG与SORA联合使用使瘤体重量减少。图8是图7相应的柱状图。
具体实施例方式实施例1 EGCG在十种肝癌细胞系中与十种抗肝癌药物有协同效应
我们在十种肝癌细胞系中固定EGCG的浓度，分别与四种抗肝癌药物联合用药。使用金氏公式Q值来评价联用效果。Q=Ea+b/ a+Eb-EaXm3)，Ea+b为合并用药抑制率，Ea和 Eb分别为A药和B药的抑制率。分子代表实际测量的两药合并抑制率，分母是期待合并抑制率。Q=O. 85-1. 15范围表示单纯相加，Q=L 15-2范围表示有增强，Q>2表示明显增强， Q<0. 55-0. 85表示有拮抗效应，Q<0. 55表示明显拮抗。由表1可知，EGCG与四种抗肝癌药物在特定的细胞株中均有一定的协同效果，说明EGCG在特定的细胞株中可以增强现有抗肝癌药物的抗肿瘤活性。下述细胞均来源于ATCC，均为人肝癌细胞。Carboplatin> Mitomycin C、sorafenib、Daunorubicin 分别是卡钼、丝裂霉素 C、 索拉非尼柔红霉素。这四种药物的抗癌机理和作用性质有所不同=Carboplatin是DNA合成抑制剂，Daunorubicin是DNA、RNA合成抑制剂，Mitomycin C是叶酸拮抗剂，sorafenib 是多激酶抑制剂。表1 EGCG与抗肝癌药物的联合用药效果
权利要求
1.一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，其特征在于，该组合物含有表没食子儿茶素没食子酸酯和索拉非尼，两者的摩尔比为200 :1 4 :1。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和索拉非尼的摩尔比为160:1 8:1。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和索拉非尼的摩尔比为120:1 8:1。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和索拉非尼的摩尔比为80:1 13:1。
5.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是肝癌。
7.一种抑制肿瘤细胞增长的方法，其特征在于，在肿瘤细胞培养液中加入权利要求1 所述组合物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是H印G2、SK-hep-UYYU L02、或者PLC细胞。
全文摘要
本发明属于医药和基因工程领域，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物。该组合物含有表没食子儿茶素没食子酸酯和索拉非尼，两者的摩尔比为200:1～4:1。本发明组合物中EGCG和索拉非尼联用，一方面抑制肿瘤细胞增殖的效果比单独使用效果的叠加更明显；另一方面，两者联用对裸鼠肝脏和肾脏则基本没有毒性，增强了索拉非尼的抗肿瘤效果。本发明组合物中的EGCG来自于天然的茶叶提取物，不仅资源丰富，价格低廉，且经过常年饮用证实，几乎没有毒副作用，因此所述的EGCG和索拉非尼联用，增强了抗肿瘤效果，减少了药物毒性及药物成本。
文档编号A61K31/353GK102526046SQ20101058725
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者余龙, 刘祖龙, 唐丽莎, 张明君, 朱恒锐 申请人:复旦大学