，光学显微镜(NIKON，日本），透射电子显微镜(LeicaTCS-NT，德国），低温高速离心机（日 立公司，日本），低温超高速离心机H-80B(日立公司，日本）。垂直电泳槽、电转槽(北京六一 厂，中国）。台式高速离心机、酶标仪(上海安亭科学仪器厂，中国）。96孔培养板(Corning公 司，美国）。凝胶仪、PCR扩增仪(BI0-RAD，美国）。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、MTT检测化合物（I)不同浓度48h对肾癌细胞株RC-2增殖的影响
[0032]用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(含有0.1 %青霉素、链霉素)常规培养人肾 癌细胞株RC-2，根据细胞生长密度1~2天换液一次，3天传代一次。取对数期生长细胞，按照 如下步骤操作：（1)接种细胞:胰酶消化对数生长期的肾癌RC-2细胞，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培养液lmL制成单细胞悬液，混匀后用移液管按照体积1 OOyL/孔，即接种肾癌细 胞数目5 X 103个/孔，加入96孔培养板中。每组细胞设置3个复孔；（2)培养细胞:将培养板小 心置入孵箱中（37 °C、5 % C02)培养3天；（3)处理细胞:分别按空白组(加5yL DMS0液）、0.25、 0.5、0.75、lymol/L化合物（I)处理组分组后加药处理48h; (4)显色：在各个时间点，予以每 孔各加入MTT溶液20yL，之后继续放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔内培养液用注射器吸 去;对于当天接种的细胞而言，离心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后将孔内培养液移除。之后把 150yL DMS0加入每孔，使其充分振荡lOmin后，把结晶物溶解完全；（5)比色:在全自动酶标 仪上检测各孔在580nm波长下的光密度值[(D580)]，按公式测定细胞活力:D(580)实验孔/D (580)对照孔 XI00 %。
[0033] 2、MTT检测0.5μΜ化合物（I)不同时间对肾癌细胞株RC-2增殖的影响
[0034] 接种和处理细胞及显色和比色步骤同上（1)、（2)、（4)、（5)，处理细胞:分别按空白 组（加5yL DMS0液）、0.5μΜ化合物（I)处理24h、48h、72h分组。
[0035] 3、制备 exosomes
[0036] (1)细胞分组：取6份细胞计数相近的人肾癌RC-2细胞株体外常规培养，其中三份 为对照组（CE)，另外三份为实验组（CE2)，等细胞呈对数生长时，两组细胞株按照3 X 106/ 100mL重新传代至新的培养瓶，严格控制每组细胞培养基的体积一致;在实验组，等细胞培 养48h后加入0.5μΜ的化合物（I)处理细胞48h，之后收集培养上清液各150mL;对照组不加药 物，加入与实验组等量的DMS0，48h后收集培养上清液各150mL，置于-20°C冰箱保存；（2)提 取exosomes:培养上清液150mL，300g低温离心(4°C) 10min去除细胞;800g低温离心30min获 取上清l〇〇〇〇g低温离心30min获取上清通过100kD MW⑶Centriplus离心超滤管浓缩超滤 (MWC0:分子量截留），以1000g离心30min，得到约20mL超滤液。将超滤液分别移至2mL含30g/ L的蔗糖重水垫的10mL的离心管中，100000g低温超速离心lh。收集离心管底部的缓冲垫用 PBS稀释，置于100kD MWC0高回收率高流速切向流超滤离心管中1000g离心30min，得到3mL exosome。。. 22μηι滤膜过滤除菌，_80°C保存备用设置对照组细胞(CE1)来源的exosomes为 EX1 组 exosomes，实验组细胞(CE2)来源的 exosomes 为EX2 组 exosomes。
[0037] 4、BCA法检测exosomes蛋白含量
[0038] (1)测定方法:取96孔酶标板，按下表加入试剂并绘制标准曲线：
[0039]
L0040」上述试剂加芫后，准确吸取10yL样品浴液于酶标孔中，加入BCA试剂200yL，轻摇， 于37°C保温30min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，以牛血清白蛋 白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的 吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质浓度；（2)计算方法:exosome浓缩液总蛋白质含量 (mg)=浓缩后的总体积XBCA法测定蛋白质浓度。重复6次实验，取平均值做统计学分析。 [0041 ] 5、统计学方法
[0042] 使用软件GRAGHPAD PRISM 5.0进行图表制作及统计学分析，计量资料以1±8表 示，比较组间差异使用方差分析或t检验。
[0043]三、结果及结论
[0044] 1、MTT显示不同浓度化合物（I)作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化
[0045] MTT结果显示当化合物（I)浓度0·75μΜ作用细胞时，细胞活力（71·32±4·68%)与 化合物（I)浓度〇·5μΜ及0·25μΜ作用细胞时细胞组（91.43±2.74%;94.67±1.21%)相比， 差异具有统计学意义(Ρ〈〇. 05)。
[0046] 2、ΜΤΤ显示0.5μΜ化合物（I)不同时间作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化
[0047] ΜΤΤ结果显示当0.5μΜ化合物（I)作用细胞72h组（71.34±1.64%)与作用4811组 (91 ·04±6· 23% )、24h组(94.56± 1 · 13% )对比，细胞活力差异具有统计学意义(Ρ〈0·05)。
[0048] 3、Exosomes计数和蛋白定量
[0049] 电镜下实验组(EX2)和对照组(EXl)exosomes计数和exosomes蛋白定量结果:经化 合物（I)处理后，RC-2细胞产生的exosomes数量和exosome蛋白含量较未经药物处理组都明 显增加，差异具有统计学意义(P〈〇. 05)。结果见表1。
[0050] 结果说明，化合物⑴能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖 性。经化合物（I)处理后，透射电镜观察肾癌细胞株RC-12源性exosomes形态未见明显改变， 其分泌量和蛋白含量较处理前明显增加(P<〇.05)，这些说明化合物（I)对肾癌细胞株RC-12的抑制作用与化合物（I)引起的肾癌细胞RC-2表达野生型p53mRNA上调有关。
[0051 ] 表1实验组和对照组分泌exosomes数量及蛋白含量对比 「nnm
[0053] 实施例3
[0054] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0055] 实施例4
[0056] 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口 服液。
[0057] 实施例5
[0058] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0059] 实施例6
[0060] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0061 ] 实施例7
[0062] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0063] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I):〇2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将干燥 的独活粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸 乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物； (b)步骤(a)中正下醇取物用大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙醇洗 脱8个柱体积，收集75%洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b)中75%乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烧-甲醇梯度 洗脱得到4个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、8:1 和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用85%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗肾癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗肾癌的倍半萜化合物，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的倍半萜类化合物，可以从干燥的独活中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖性，可以用来开发成治疗肾癌的药物。
【IPC分类】A61P35/00, C07D303/14, C07D301/32
【公开号】CN105566254
【申请号】CN201511023834
【发明人】吴金凤
【申请人】吴金凤
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月30日