专利名称：改良的使用dxp和mva途径的异戊二烯生产的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及组合物和方法，所述组合物和方法用于改善使用DXP途径和MVA途径从培养的细胞生产异戊二烯。
背景技术：
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是用于多种合成聚合物、特别是合成橡胶的关键起始材料。多种微生物、植物和动物物种天然地产生异戊二烯。具体地，已经鉴定了异戊二烯的生物合成的两个途径甲羟戊酸(MVA)途径和非-甲羟戊酸(DXP)途径(图19A)。但是，从天然存在的生物体生产异戊二烯的产率在商业上不具有吸引力。每年从异戊二烯的聚合生产约800，000吨的顺式-聚异戊二烯；这些聚异戊二烯中大部分用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯也经共聚化而用作其它产品例如鞋类、机械产品、医疗产品、体育用品和胶乳中的弹性体。目前，轮胎和橡胶工业是基于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶获自非洲雨林中的橡胶树或植物的乳状汁液。合成橡胶主要是基于丁二烯聚合物。对于这些聚合物，作为乙烯和丙稀生产中的共同产物而获得丁二烯。虽然可以通过分馏石油来获得异戊二烯，但是该物质的纯化是昂贵且耗时的。碳氢化合物的C5流的石油裂解仅产生约15%的异戊二烯。因此，需要更经济的用于生产异戊二烯的方法。特别地，需要以足以满足稳健的商业过程的需要的速率、效价和纯度生产异戊二烯的方法。同样需要用于从廉价的起始材料生产异戊二烯的系统。
发明内容
除了别的以外，本发明提供了用于生产增加的量的异戊二烯的组合物和方法，其中使用不同的DXP途径基因和多肽以及不同的MVA途径基因和多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因和多肽、异戊二烯合酶、和任选的与DXP途径有关的不同基因和多肽、与MVA途径有关的不同基因和多肽以及IDI基因和多肽。在一个方面，本发明表征了已经工程化成生产增加的量的异戊二烯的细胞或培养的细胞，其中使用不同的DXP途径基因和多肽、不同的MVA途径基因和多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因和多肽、异戊二烯合酶基因和多肽、和任选的DXP途径相关的基因和多肽、MVA途径相关的基因和多肽以及IDI基因和多肽的组合。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含(i)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽，(ii)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码DXP途径多肽和/或MVA途径多肽，和(iii)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，DXP途径多肽选自DXS(1-脱氧-D-木酮糖_5_磷酸合酶)、DXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)、MCT (4- 二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK (4- 二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS (2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS(1-羟基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基4- 二磷酸合酶)和HDR(1-羟基_2_甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶)。在一些实施方式中，DXP途径多肽是DXS、HDS或HDR0在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内 源核酸编码IDI (异戊烯基-二磷酸8 -异构酶)多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽选自乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AA-辅酶A硫解酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)和异戊烯基磷酸激酶(IPK)。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI (异戊烯基-二磷酸8 -异构酶)多肽。在一个实施方式中，DXP和MVA途径可以在细胞或培养的细胞中以任意比率存在，以从每个途径以任意比例生产异戊二烯。在另一个实施方式中，使用DXP途径生产约10% -50%的异戊二烯，使用MVA途径生产剩余部分。在另一个实施方式中，使用DXP途径生产至少约50%的异戊二烯，使用MVA途径生产剩余部分。在一些实施方式中，本发明提供了细胞或培养的细胞，其生产大于约400纳摩尔异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(nm0le/gra/hr)的异戊二烯。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞将细胞培养基中超过约0. 002%的碳转化成异戊二烯。在一些实施方式中，本发明提供了细胞或培养的细胞，其中在发酵运行期间维持HMBPP和DMAPP的水平低于ImM。在其它实施方式中，本发明提供了培养的细胞，其中在发酵的指数期内维持HMBPP和DMAPP的水平低于ImM。在其它实施方式中，本发明提供了细胞或培养的细胞，其中晚期DXP途径酶、尤其是IspG和IspH维持在与使Dxr的磷酸化水平最小化相一致的水平。在本发明的任意方面的一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽包括黄素氧还蛋白(例如，黄素氧还蛋白I)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(例如，铁氧还蛋白I)、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶以及编码它们的基因或多肽(例如，fpr和fldA)。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含(i)异源核酸，其编码铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，其编码铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含IspG和fldA。在另一个实施方式中，细胞或培养的细胞包含IspG、fldA和IspH。在一些实施方式中，铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI多肽。 在一些实施方式中，培养的细胞包含(i)异源核酸，其编码黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，其编码黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油月旨、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分或前述2种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，在限制葡萄糖条件下培养细胞。在其它方面，本发明提供了生产异戊二烯的方法，所述方法包括(a)在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和(b)生产异戊二烯。在一个实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI(异戊烯基-二磷酸S-异构酶)多肽。在其它实施方式中，培养的细胞生产大于约400nmole/gwc;m/hr的异戊二烯。在其它实施方式中，细胞从细胞培养基中消耗的碳中超过约0. 02摩尔％被转化成异戊二烯。在一个方面，本发明表征了生产异戊二烯的方法，例如使用本文所述的任一种细胞来生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，方法包括培养细胞，所述细胞包含(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，并生产异戊二烯。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、异戊二烯合酶多肽和DXP途径多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，DXP途径多肽选自DXS(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)、DXR(1-脱氧-D-木酮糖_5_磷酸还原异构酶)、MCT (4- 二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK (4- 二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS(2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS (I-羟基-2-甲基_2_(E)-丁烯基4-二磷酸合酶)和HDR (I-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶)。在一些实施方式中，DXP途径多肽是DXS、HDS或HDR。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI (异戊烯基-二磷酸S-异构酶)多肽。在一些实施方式中，方法包括在足以生产大于约400nmOle/gra/hr的异戊二烯的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，方法包括在足以将细胞培养基中超过约0.002% (moI/mol)的碳转化成异戊二烯的条件下，培养细胞。在多个实施方式中，在稳定期中生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/0D_)大于在生长期的相同时间段内生产的异戊二烯的量，或是约2倍或更多倍。在一些实施方式中，气相包含大于或约9. 5% (体积)的氧，并且气相中的异戊二烯的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限。在具体的实施方式中，(i)气相中异戊二烯的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限；并且(ii)细胞生产大于约 400nmole/gw /hr 的异戍二烯。在一些实施方式中，仅在稳定期生产异戊二烯。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都生产异戊二烯。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/0D_)大于在生长期的相同时间段内生产的异戊二烯的量，或是约2、3、4、5、10、20、30、40、50倍或更多倍。 在一个方面，本发明表征了包含异戊二烯的组合物和系统。在一些实施方式中，组合物包含大于或约 2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或IOOOmg异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、10(^异戊二烯(w/w)，组合物中挥发性有机级分是异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃的总重量的大于或约
99.90%,99. 92%,99. 94%,99. 96%,99. 98%或 100%的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或约0. 12 %、0. 10 %、0. 08 %、0. 06 %、0. 04%,0. 02%,0. 01%,0. 005%,0. 001%,0. 0005%,0. 0001%,0. 00005%或 0. 00001%的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、I，4-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、3-甲基-I- 丁炔、戍-4-烯-I-炔、反式-戍-3-烯-I-炔或顺式-戊-3-烯-I-炔)。在一些实施方式中，组合物具有重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或约 0. 12 %,0. 10 %,0. 08 %,0. 06 %,0. 04 %,0. 02 %,0. 01 %,0. 005 %、0. 001%,0. 0005%,0. 0001%,0. 00005%或 0. 00001 % 的 1，3-环戊二烯、反式-1,3-戊二烯、顺式-1，3-戍二烯、1,4-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、3-甲基-I- 丁炔、戍-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔或顺式-戊-3-烯-I-炔。在具体的实施方式中，组合物具有大于约2mg异戊二烯，并具有重量占组合物中所有C5烃总重量的大于或约99. 90%,99. 92%,
99.94%,99. 96%,99. 98%或 100%的异戊二烯。在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，组合物具有小于或约 50、40、30、20、10、5、1、0. 5,0. 1,0. 05,0. 01、或 0. 005 u g/L 的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，组合物还具有大于约2mg的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含(i)包含异戊二烯的气相和(ii)生产大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯的培养的细胞。在一些实施方式中，组合物包含封闭的系统，并且气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ii g/L的异戊二烯(当针对培养了 I小时的ImL IOD6tltl进行校正时)。在一些实施方式中，组合物包含开放的系统，并且气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ii g/L的异戊二烯(当以Ivvm的速率鼓泡时)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分包含重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的大于或约99. 90%,99. 92%,99. 94%,99. 96%,99. 98%或100%的异戊二烯。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分包含重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的小于或约 0. 12%,0. 10%,0. 08%,0. 06%,0. 04%,0. 02%,0. 01%,0. 005%,0. 001%,0. 0005%,0. 0001%,0. 00005%或 0. 00001 %的除了异戊二烯的以外的 C5 烃(例如1，3_环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、I-戊炔、2-戊炔、3-甲基-I- 丁炔、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔或顺式-戊-3-烯-I-炔)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分具有重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的小于或约 0. 12%,0. 10%,0. 08%,0. 06%,0. 04%,0. 02%,0. 01 %,0. 005 %,0. 001 %、0. 0005 %,0. 0001 %,0. 00005 % 或 0. 00001 % 的 I，3-环戊二烯、顺式 _1，3_ 戊二烯、反式_1，3-戍二烯、1,4-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、3-甲基-I- 丁炔、戍-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔或顺式-戊-3-烯-I-炔。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级分具有大于约2mg异戊二烯，并且具有重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的大于 或约 99. 90%,99. 92%,99. 94%,99. 96%,99. 98%或 100%的异戊二烯。在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级分中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，气相的挥发性有机级分具有小于或约50、40、30、20、10、5、1、0. 5,0. 1,0. 05、0. 01、或0. 005 u g/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级分还具有大于约2mg异戊二烯。在本发明的任意组合物的一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在气相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在液相(例如冷凝物)中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在固相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯吸附至固体支持物，例如包括二氧化硅和/或活性炭的支持物。在一些实施方式中，组合物包括乙醇。在一些实施方式中，组合物包括约75 %至约90重量％的乙醇，例如约75 %至约80 %、约80 %至约85%或约85%至约90重量％的乙醇。在一些实施方式中，组合物包含约4%至约15重量％的异戊二烯，例如约4%至约8%、约8%至约12%或约12%至约15重量％的异戊二烯。在一些实施方式中，本发明的特征还在于包括本文描述的任意细胞和/或组合物的系统。在一些实施方式中，系统包括反应器，其反应室包含培养的细胞，所述细胞生产大于约 400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3, 000,4,000、
5，000、或更多11111016/^。 1/111'的异戊二烯。在一些实施方式中，系统不是封闭系统。在一些实施方式中，从系统中回收至少一部分的异戊二烯。在一些实施方式中，系统包括包含异戊二烯的气相。在多个实施方式中，气相包含本文描述的任意组合物。在一个方面，本发明提供了包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中，如下生产聚异戊二烯(i)使本文描述的任意组合物中的异戊二烯聚合，或(ii)使从本文描述的任意组合物回收的异戊二烯聚合。在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺式-I，4-聚异戊二烯。在本发明的任意组合物、系统、和方法的一些实施方式中，生产气相中的非可燃浓度的异戊二烯。在一些实施方式中，气相包含小于约9. 5% (体积)的氧。在一些实施方式中，气相包含大于或约9. 5% (体积)的氧，并且气相中的异戊二烯的浓度小于燃烧下限或大于燃烧上限。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约0%至约100%(体积)的氧，例如约10%至约100% (体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约O%至约99% (体积)的氮。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约I %至约50% (体积)的CO2。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码DXP途径相关的多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养的细胞生产大于或约400、500、600、700、800、900、1，000、1，250、1，500、1，750、2，000、2，500、3，000、4，000、5，000 或更多nmole/gwcm/hr的异戍二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养的细胞将大于或约 0. 002、0. 005、0. 0U0. 02,0. 05,0. U0. 12,0. 14,0. 16,0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、
0.9、I. O、I. 2、I. 4、I. 6%或更多的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1,500,1,750,2,000,2,500,3,000,4,000,5,000、 10，000、100，000或更多ng的异戊二烯/克细胞的细胞湿重/hr (ng/gwem/h)生产异戊二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1,250,1,500,1,750,2,000,2,500、3，000,4, 000,5, 000、10，000,50, 000、100，000 或更多 mg 异戊二烯 /L 培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)生产异戊二烯的累积效价(总量)。本文公开了异戊二烯生产的其它示例性速率和异戊二烯生产的总量。在本发明的任意方面的一些实施方式中，通过使用源自它们的突变型DXP途径多肽和核酸，可以进一步增加异戊二烯生产。在一些实施方式中，突变型DXP途径多肽是去除了铁硫簇调节物(iscR)的HDR多肽。在一些实施方式中，突变型DXP途径多肽是仅生产DMAPP或与IPP相比生产大量DMAPP的突变型HDR多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，通过增加经过DXP途径和/或MVA途径的碳通量，可以进一步增加异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过避免在DXP途径下游的代谢物和/或使用DXP途径多肽作为底物的其它途径的中间体对DXS活性的任何反馈抑制，可以增加碳通量。在一些实施方式中，使用DXP途径多肽作为底物(例如，DXP)的其它途径是硫胺素(维生素BI)或吡哆醛(维生素B6)途径。在一些实施方式中，通过表达来自不同生物体的DXP途径多肽(其不会受到DXP途径的下游产物的抑制)，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过解调节葡萄糖摄取，可以增加碳通量。在其它实施方式中，通过使DXP途径和/或MVA途径所需的前体之间的平衡最大化，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过利用分别升高或降低丙酮酸盐或G-3-P的效应来重新指导碳通量，可以实现DXP途径前体丙酮酸盐和甘油醛-3-磷酸(G-3-P)的平衡。在一些实施方式中，通过使用CRP(cAMP受体蛋白)_删除的突变体，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过使用含有丙酮酸脱氢酶El亚基变体的菌株(其含有一个或多个DXP途径基因或一个或多个属于DXP途径和MVA途径的基因)，可以增加碳通量。在一些实施方式中，丙酮酸脱氢酶(I3DH)El亚基变体具有一个E636Q点突变。在本发明的任意方面的一些实施方式中，可以如下进一步增加异戊二烯生产通过利用DXP途径的下游基因或多肽，通过将异源萜合酶核酸或内源萜合酶核酸的副本拷贝导入细胞中，所述萜合酶包括、但不限于罗勒烯合酶、法呢烯合酶和青蒿素合酶。在本发明的任意方面的一些实施方式中，在一些实施方式中，载体包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。在本发 明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至17启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的17启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至内源启动子，例如内源碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合进入不含选择性标志物的细胞染色体中。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、和DXP途径、MVA途径中的任意一个或多个核酸以及异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期中比在生长期中更有活性的启动子或因子的控制之下。在一个实施方式中，也包括IDI核酸用于IDI表达，以生产比不使用IDI时更高量的异戊二烯。例如，一个或多个铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、IDI核酸或异戊二烯合酶核酸可以置于稳定期E因子(例如RpoS)的控制之下。在一些实施方式中，一个或多个铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、MVA途径核酸、IDI核酸或异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期中可诱导的启动子(例如可被在稳定期中有活性的响应调节物诱导的启动子)的控制之下。在本发明的任意方面的一些实施方式中，在非诱导条件下培养细胞，所述细胞表达铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、异戊二烯合酶多肽和DXP途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，在非诱导条件下培养细胞，所述细胞表达铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、IDI多肽和异戊二烯合酶多肽。例如，非诱导条件是不进行Trc启动子调节的基因构建体的IPTG-诱导的表达的条件。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了第一种DXP途径多肽以外，细胞表达第二种DXP途径多肽，包括DXS (I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)、DXR(1-脱氧_D_木酮糖-5-磷酸还原异构酶)、MCT (4- 二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK (4- 二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS (2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS (I-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶)和HDR (I-羟基-2-甲基_2_ (E) - 丁烯基4-二磷酸还原酶)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种DXP途径多肽以外，细胞表达两种或更多种DXP途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种DXP途径多肽以外，细胞表达2、3、4、5、6或7种DXP途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了第一种MVA途径多肽以外，细胞表达第二种MVA途径多肽，包括乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AA-辅酶A硫解酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)和异戊烯基磷酸激酶(IPK)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种MVA途径多肽以外，细胞表达两种或更多种MVA途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种MVA途径多肽以外，细胞表达2、3、4、5、6或7种MVA途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、IDI核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、异戊二烯合酶核酸、DXP途径核酸和/或IDI核酸的核酸也包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的多肽，所述植物例如葛属(例如越南葛藤或葛根)或白杨(例如美洲山杨、银白杨、欧洲黑杨、毛果杨或杂交体、银白杨X欧洲山杨)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌细胞(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌或灰色链霉菌细胞)或蓝细菌细胞(例如，Thermosynechococcus细胞例如Thermosynechococcus elongates细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如，埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；或泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞)或蓝细菌细胞(例如，Thermosynechococcus细胞例如Thermosynechococcuselongates细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如，木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属细胞，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如，耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻或亚麻仁的一种或多种多肽。在一个方面，本发明表征了由本发明的任意组合物或方法生产的产物。
图I是针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化的野葛(kudzu)异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO :I)。atg起始密码子以斜体表示，终止密码子以加粗字体表示，添加的PstI位点以下划线标示。图2 是 pTrcKudzu 的图谱。图3A、B和C是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO :2)。RBS以下划线标示，野葛异戊二烯合酶起始密码子以加粗大写字母表示，终止密码子以加粗大写斜体字母表示。载体骨架是pTrcHis2B。图4 是 pETNHisKudzu 的图谱。图5A、B 和 C 是 pETNHisKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO :5)。图6 是 pCL-lac-Kudzu 的图谱。
图7A、B 和 C 是 pCL-lac-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO :7)。图8A的图显示了在无载体的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。图8B的图显示了在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。图8C的图显示了在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。图8D的图显示了在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。图9A的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间的0D。图9B的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随 时间生产的异戊二烯。图IOA的图显示了朽1檬泛菌(Pantoea citrea)中异戍二烯的生产。对照细胞中无重组野葛异戊二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示0D_。图IOB的图显示了表达pCL-lac Kudzu的朽1檬泛菌中异戍二烯的生产。灰色菱形表不异戍二烯的合成，黑色方框表不OD600O图IOC的图显示了表达pTrcKudzu的朽1檬泛菌中异戍二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示0D_。图11的图显示了表达重组异戍二烯合酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中异戍二烯的生产。BG3594comK是无质粒的枯草芽孢杆菌菌株(天然的异戍二烯生产)。CF443-BG3594comK是具有pBSKudzu的枯草芽孢杆菌菌株(重组的异戊二烯生产)。y轴上的IS表示异戊二烯。图12 是 pBS Kudzu #2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 56)。
图13是针对在耶氏酵母属(Yanwia)中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 8)。图14是包含针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的pTrex3g的图谱。图15 是载体 pSPZl(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO 11) 图16是针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的合成的野葛(越南葛藤(Pueraria montana))异戍二烯基因的核苷酸序列(SEQ ID N0:12)。图17是合成的杂交白杨(poplar)(银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populustremula))异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO : 13)。ATG起始密码子以加粗表示，终止密码子以下划线标示。图18A显示了载体pYLAl、pYLl和pYL2的构建示意图。图18B显示了载体pYLA(POPl)的构建示意图。图18C显示了载体pYLA(KZl)的构建示意图。图18D显示了载体pYLI (KZl)的构建示意图。图18E显示了载体pYLI(MAP29)的构建示意图。图18F显示了载体pYLA(MAP29)的构建示意图。图19显示了异戍二烯的MVA和DXP代谢途径(基于F. Bouvier等人，Progressin Lipid Res. 44 :357-429, 2005)。以下描述包括该途径中的每种多肽的替代性名称，以及公开了用于测定指明的多肽的活性的测定法的参考文献(这些文献中的每一篇皆通过引用方式整体并入本文，尤其是关于测定MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性的测定法的那些)。甲羟戊酸途径=AACT ；乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶，MvaE, EC 2. 3. I. 9.测定法 J. Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ；HMGS ;羟基甲基戊二酰-辅酶 A 合酶，MvaS,EC 2. 3. 3. 10.测定法J. Bacteriol.，184 :4065-4070,2002 ；HMGR ；3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶 A 还原酶，MvaE，EC I. I. I. 34.测定法:J. Bacteriol.，184 :2116-2122，2002 ；MVK ；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC 2. 7. I. 36.测定法=Curr Genet 19 :9_14，1991. PMK ;磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8, EC 2. 7. 4. 2，测定法Mol Cell Biol.，11 :620_631，1991 ;DPMDC ;二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVDI, EC 4. I. I. 33.测定法Biochemistry，33 :13355_13362，1994 ;IDI ；异戊烯-二磷酸 6 -异构酶，IDI1, EC 5. 3. 3. 2. Assay J. Biol. Chem. 264 :19169-19175，1989. DXP Pathway DXS ;1_ 脱氧 _D_木酮糖 _5_磷酸合酶，dxs，EC 2. 2. I. 7.测定法PNAS,94 :12857-62,1997 ；DXR ；1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸还原异构酶，dxr, EC 2. 2. I. 7.测定法Eur. J. Biochem. 269 :4446-4457,2002 ；MCT ;4_ 二磷酸胞苷 _2C_ 甲基-D-赤藓醇合酶，IspD, EC 2. 7. 7. 60.测定法PNAS,97 :6451-6456,2000 ；CMK ；4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶，IspE, EC 2. 7. I. 148.测定法PNAS,97 :1062-1067，2000 ；MCS ；2 C-甲基-D-赤藓醇 2，4_ 环二磷酸合酶，IspF, EC4. 6. I. 12.测定法=PNAS,96 :11758-11763,1999 ；HDS ;1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基 4-二磷酸合酶，ispG, GcpE, EC I. 17. 4. 3.测定法J. Org. Chem. ,70 :9168-9174,2005 ;HDR;1_ 羟基-2-甲基 _2_(E)-丁烯基 4-二磷酸还原酶，IspH, LytB, EC I. 17. I. 2.测定法:JACS，126 :12847-12855，2004。图20中的图显示了由不含(左侧)或含有(右侧)野葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶氏酵母(Y. Iipolytica)菌株生产的异戍二烯的GC-MS分析的结果。箭头表示真实的异戊二烯标准物的洗脱时间。图 21 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的图谱。图22A-D 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO :20)。图23A的图显示了在BL21/pTrcKudzukan中，从葡萄糖生产异戍二烯。时间0是以IPTG(400 ii mol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是0D_，y2轴是异戊二烯的总生产率(U g/L顶空或比生产率(U g/L顶空/0D)。菱形代表0D_，圆形代表总的异戊二烯生产率g/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(y g/L/OD)。图23B的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI kan中，从葡萄糖生产异戍二烯。时间0是以IPTG(400 u mol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是0D_，y2轴是异戊二烯的总生产率(U g/L顶空或比生产率(U g/L顶空/0D)。菱形代表0D_，圆形代表总的异戊二烯生产率g/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(y g/L/0D)。图23C的图显示了在BL21/pTrcKudzu DXS kan中，从葡萄糖生产异戍二烯。时间0是以IPTG(400 ii mol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是0D_，y2轴是异戊二烯的总生产率(U g/L顶空或比生产率(U g/L顶空/0D)。菱形代表0D_，圆形代表总的异戊二烯生产率g/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(y g/L/0D)。图23D的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中，从葡萄糖生产异戍二烯。时间0是以IPTG(400 u mol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是0D_，y2轴是异戊二烯的总生产率(U g/L顶空或比生产率(U g/L顶空/0D)。菱形代表0D_，圆形代表总的异戊二烯生产率g/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(y g/L/0D)。
图23E的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu中，从葡萄糖生产异戍二烯。时间0是以IPTG(400 ii mol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是0D_，y2轴是异戊二烯的总生产率(U g/L顶空或比生产率(U g/L顶空/0D)。菱形代表0D_，圆形代表总的异戊二烯生产率g/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(y g/L/OD)。图23F的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中，从葡萄糖生产异戍二烯。时间0是以IPTG(400 u mol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是0D_，y2轴是异戊二烯的总生产率(U g/L顶空或比生产率(U g/L顶空/0D)。菱形代表0D_，圆形代表总的异戊二烯生产率g/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(y g/L/OD)。图23G的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu DXS中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间 0是以IPTG(400 ii mol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是0D_，y2轴是异戊二烯的总生产率(U g/L顶空或比生产率(U g/L顶空/0D)。菱形代表0D_，圆形代表总的异戊二烯生产率g/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(y g/L/0D)。图23H的图显示了在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中，从葡萄糖生产异戍二烯。箭头指示以IPTG(400 ii mol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是0D_，y2轴是异戊二烯的总生产率(U g/L顶空或比生产率(U g/L顶空/0D)。黑色菱形代表0D_，黑色三角形代表异戊二烯生产率g/L)，白色方框代表异戊二烯的比生产率g/L/0D)。图24是p9796-白杨的图谱。图25A-25B 是 p9796_ 白杨的核苷酸序列(SEQ ID NO :21)。图26 是 pTrcPoplar 的图谱。图27A-27C 是 pTrcPoplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 22)。图28 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的图谱。图29 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 23)。图3O 是 pTrcKudzu DXS Kan 的图谱。图31A-33C 是 pTrcKudzu DXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 24)。图32 是 pCL PtrcKudzu 的图谱。图33A-33C 是 pCL PtrcKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 25)。图34 是 pCL PtrcKudzu A3 的图谱。图35A-35C 是 pCL PtrcKudzu A3 的核苷酸序列(SEQ ID NO 26)。图36 是 pCL PtrcKudzu yIDI 的图谱。图37A-37C 是 pCL PtrcKudzu yIDI 的核苷酸序列(SEQ ID NO :27)。图38 是 pCL PtrcKudzu DXS 的图谱。图39A-39D 是 pCL PtrcKudzu DXS 的核苷酸序列(SEQ ID NO 28)。图40的图显示了从生物质原料生产异戊二烯。图板A显示了从玉米秸杆生产异戊二烯，图板B显示了从甘蔗渣生产异戊二烯，图板C显示了从软木浆生产异戊二烯，图板D显示了从葡萄糖生产异戊二烯，图板E显示了不用额外的原料从细胞生产异戊二烯。灰色方框代表在接种后的指明的时间培养物的OD6tltl测量值，黑色三角形代表在接种后的指明的时间异戊二烯的产量。图41A的图显示了在未添加葡萄糖的培养物中，由BL21(ADE3)pTrcKudzu yIDIDXS(kan)生产的异戊二烯。方框代表OD6tltl，三角形代表生产的异戊二烯(yg/ml)。
图41B的图显示了由BL21 (入DE3)pTrcKudzu yIDI DXS (kan)从I %的葡萄糖原料转化糖生产的异戊二烯。方框代表0D_，三角形代表生产的异戊二烯(yg/ml)。图41C 的图显示了由 BL2lUDE3)pTrcKudzu yIDI DXS (kan)从 I % 的转化糖原料生产的异戊二烯。方框代表0D_，三角形代表生产的异戊二烯(yg/ml)。图41D 的图显示了由 BL21(XDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从 1%的 AFEX 玉米秸杆原料生产的异戊二烯。方框代表0D_，三角形代表生产的异戊二烯(yg/ml)。图42的图显示了酵母提取物对生产异戊二烯的影响。图板A显示了加入不同量的酵母提取物的发酵罐内的光密度的时间进程。图板B显示了加入不同量的酵母提取物的发酵罐内的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了酵母提取物对于补料分批培养物中生长的大肠杆菌生产异戊二烯的影响。图43的图显示了从500L的生物反应器中由含有pTrcKudzu+ylDI+DXS质粒的大 肠杆菌细胞生产的异戊二烯。图板A显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中的光密度的时间进程。图板B显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了从加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。图44 是 pBS Kudzu#2 的图谱。图45A的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的生长。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。图45B的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的异戊二烯生产。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表具有pBSKudzu的芽孢杆菌(重组的异戊二烯生产)。图46A-46D描绘了用于异戊二烯生产的空载体(对照)、HgS和HgS-FldA菌株的生长速率和比生产率。图46E 是 pBAD33 的图谱。图46F 和 46G 是 pBAD33 的核苷酸序列(SEQ ID NO :51)。图46H 是 pTrcHgS-pBAD33 的图谱。图461 和 46J 是 pTrcHgS-pBAD33 的核苷酸序列(SEQ ID NO 52)。图46K 是 pTrcHgSfldA-pBAD33 的图谱。图46L 和 46M 是 pTrcHgSf ldA_pBAD33 的核苷酸序列(SEQ ID NO 53)。图47显示了菌株REM19-22相对于REM23-26的生长和异戊二烯生产。在时间0当培养物处于约0. 2-0. 25的0DA6(l(lmi时，用200uM IPTG，诱导两组菌株中异戊二烯合酶的表达和实验组菌株中T. elongatus基因的表达。在图中显示的数据是在将IPTG加入培养物中以后4小时得到的数据。在30°C在TM3中摇动培养细胞。亲代菌株与实验组菌株的对比表明，GII. 0-dxs、GIl. 2-dxs、GIl. 5-dxs和GI-1. 6-dxs实验菌株的异戊二烯生产分别比亲代菌株增加了 10%、20%、30%和80%。图48显示了在菌株REM23-2中积累的GcpE产物HDMAPP的增加的水平。在5小时IPTG-诱导期，测定REM19-26 (菌株指示在x轴上)的DXP代谢物和更大的类异戊二烯分子的浓度。在图例中指示了测定的DXP代谢物和类异戊二烯DXP，1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸；MEP，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸；cMEPP，2_C_甲基-D-赤藓醇_2，4-环二磷酸；HDMAPP, (E)-4-羟基-3-甲基丁 _2_烯基二磷酸；DMAPP，二甲基烯丙基二磷酸酯；IPP，异戊烯基二磷酸酯；FPP，法呢基焦磷酸酯。
图49显示了菌株REM29与REMH86相比异戊二烯生产的比生产率。图50描述了使用RED/ET系统将GI I. X-启动子系列插入在dxs前面的策略的卡通表示。在3小时摇瓶发酵期间，每30分钟，测定REM29 (蓝色)和REMH86 (黄色)的生长速率(同样培养的菌株)和异戊二烯生产。在时间0，用400uM IPTG诱导两种培养物。在发酵过程中，从诱导以后的第一时间点开始，实验菌株产生了比亲代菌株高约16%的异戊二烯水平。图51 是 I7-MEARR alba/pBBRlMCS-5 的图谱。图52是用于制备菌株REM23-26的Ptac-gcpE-petF_petH/pK184构建体的图谱。图53A-53B 显示了用于制备菌株 REMH76 和 REMH86 的 I7-(_3)alba/pBBRlMCS-5(上图)和I7-MTE alba/pBBRlMCS-5 (下图)构建体的卡通表示。图54 是用于制备菌株 REM31 和 REM29 的 Ptac-gcpE_lytB-petF-petH/pK184 构建体的图谱。图55A-55C 是 I7-MEARR alba/pBBRlMCS-5 的核苷酸序列(SEQ ID NO 73)。图56A-56B 是 Ptac-gcpE-petF_petH/pK184 的核苷酸序列(SEQ ID NO 74)。图57A-57C 是 17-(_3_alba/pBBRlMCS_5 的核苷酸序列(SEQ ID NO 75)。图58A-58C 是 I7-MTE alba/pBBRlMCS-5 的核苷酸序列(SEQ ID NO 76)。图59A-59B 是Ptab-gcpE-LytB-petF_petH/pK184 的核苷酸序列(SEQ ID NO 77)。图60A-60B表明，AiscR BL21 (DE3)支持增加的异戊二烯生产。图板60A显示了 REM12相对于在其它方面同基因的AiscR菌株REM13的比生产率。在诱导菌株携带的IPTG-可诱导的异戊二烯合酶和DXP酶以后4. 5小时和8小时，测定异戊二烯水平。显示了来自每个菌株的3个生物副本的三组(A-C)的数据。误差棒描绘了每组的生物副本之间发生的标准差。从该数据可以确定，在4. 5小时和8小时时间点，从AiscR菌株产生的异戊二烯水平分别比野生型菌株生产的水平平均高40%和73%。图板60B显示了 REM12和REMl3异戊二烯生产菌株的生长速率。在8小时实验过程中，通过定期测量培养物在600nm的光密度，监测描绘在图板A中的相同菌株的生长速率。时间0对应着将50uM IPTG加入培养物中的时间。在30°C在TM3中摇动培养细胞。与更低的异戊二烯生产野生型(REM12)菌株相比，更高的异戊二烯生产菌株AiscR(REM13)以降低的速率生长。图61是使用RED/ET系统删除iscR基因座的策略的卡通表示。图 62 是 I7-MEARR alba/pBBRlMCS-5 的卡通表示。图63是DXP操纵子pET24a的卡通表示。图64A-64C 是 I7-MEARR alba/pBBRlMCS-5 的核苷酸序列(SEQ ID NO 78)。图65A-6 是 DXP 操纵子 pETt24a 的核苷酸序列(SEQ ID NO 79)。图66是使用RED/ET系统删除ispG和ispH的策略的卡通表示。图67 是用于制备菌株 MD09-219/GI1. 6-gcpE-lytB-yidi/pCRII-TOPO (Kan)的 GII.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO 构建体的卡通表不。图68 描述了憐酸戍糖(PPP)途径和 Entner-Doudoroff (ED)途径(Fraenkel,J. Bact. 95 :1267-1271 (1965)，它通过引用整体并入本文)。图69是pDu-39的图谱。图 70 是 pMCM596pET24 (MEA) alba-dxs-ylDI 的图谱。
图71A-71B 是 pDu-39 的核苷酸序列(SEQ ID NO :108)。图72A-72C 是 MCM596 的核苷酸序列(SEQ ID NO :109)。图73A-C 是 pMCM596 的核苷酸序列(SEQ ID NO :110)。图74显示了经由DXP途径(大肠杆菌、Chlorobium tepidum TLS、集胞藻属PCC6803、紫色粘杆菌PCC 7421、肉毒梭菌BI菌株Okra、结核分枝杆菌CDC1551)和经由MVA途径(黄色粘球菌DK 1622、Gramella forsetii KT0803、约氏黄杆菌UW101、约氏乳杆菌NCC 533、加氏乳杆菌ATCC 33323和乳酸乳球菌乳酸亚种111403)合成类异戊二烯的微生物中DXS序列的对比。注意到在2组微生物的位置200-260处的氨基酸序列的差异。图75A和75B是pDU_9的核苷酸序列。图76 是 pDu9_pET_16b rev-ylDI 的图谱。图77描述了 GB-CMP-GI1. X-yidi构建体设计。最终的构建体由与片段B (Frag B)融合的片段A(Frag A)组成，以建立Gil. X启动子文库，其转录在上游具有氯霉素抗生素抗性标志物的yIDI，并将50碱基对同源性区域侧接到染色体上的希望的整合位点。图78描述了 pDW33的质粒图谱。pBR322_质粒复制起点；laclq-lac阻遏蛋白；Ptrc-trc启动子；lac操纵子-Iac阻遏蛋白结合位点；银白杨IspS (MEA)-编码异戍二烯合酶的基因；rrn终止子-转录终止子；bla-0内酰胺酶基因。图79(包括 5 个图板图 79A、79B、79C、79D 和 79E)显示了菌株 CMP272、REMG39 和REM H8_12的15-L规模发酵对比结果生长、异戊二烯生产和碳的成品收率。图板(A)是异戊二烯效价(g/L培养液)；图板(B)是生产异戊二烯的培养物的比生产率；图板(C)是由光密度(550nm)描绘的细胞生长；图板(D)是由呼吸显示的细胞生长(碳形成速率，CER)；图板(E)是从碳至产物的总产率百分比(克异戊二烯重量/克碳原料重量*100)。发酵条件描述在实施例24的部分F(CMP272)、G(REMG39)和实施例29的部分E (REM H8_12)中。图80(包括 3 个图板，80A、80B 和 80C)显示了菌株 CMP272、REMG39 和 REM H8_12的大规模发酵对比的结果DXP代谢物。图板(A-C)显示了图79描绘的相同细胞。在每个图板的下面，显示了描述代谢物特性的图例。DXP，I-脱氧-D-木酮糖5-磷酸；MEP，2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸；CDP-ME，4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇；CDP-MEP，2-磷酸-4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇；cMEPP，2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸；HDMAPP，I-羟基-2甲基-2- 丁烯-4-基4- 二磷酸；DMAPP，二甲基烯丙基二磷酸酯；IPP,异戊烯基二磷酸酯；FPP，法呢基焦磷酸酯。图81(包括2个图板图8认和818)描述了一个将611.父fIdA插入BL21 (DE3)染色体中的策略。图板(A)显示了内源的150碱基对此21_3)行(^基因座。GI1.X fldAPCR片段内与染色体上的希望的5’和3’整合位点具有同源性的区域，被描绘为灰色块状箭头。半箭头线显示了用于验证构建体与染色体对合的PCR引物的位置。显示了核糖体结合位点(RBS)、编码的fldA mRNA的起始密码子和在要用Gil. X启动子系列替换的fldA的上游的内源DNA。图板(B)显示了经由Gene Bridges方法制备的313碱基对BL21 (DE3)GI1.X fldA区域(菌株REM 16_4的GI1.6fldA)。插入的Gil. X启动子序列显示为黑色块状箭头；指示了使用Gene Bridges插入方法制备的FTR症痕序列的放置。图82描述了 Gil. 6fldA/pCL的质粒图谱。repA-质粒复制蛋白；aad_氨基糖苷腺苷酰转移酶;M13正向和M13ReVerSe-各个引物的结合位点；RBS_核糖体结合位点；fldA-大肠杆菌fldA基因。图83描述了 GI1.6fldA-IspG/pCL的质粒图谱。与图82相同的质粒基础FldA_大肠杆菌fldA基因；IspG-大肠杆菌ispG基因。图84描述了 GII 61spG/pCL的质粒图谱。与图82和83相同的质粒基础IspG_大肠杆菌ispG基因。图85(包括 2 个图板，图 85A 和 85B)描述了菌株 REMC9_12、REME7_12 和 REMD6_12的小规模对比。图板(A)是异戊二烯生产相对于生长的比生产率(SP)。yl轴，异戊二烯生产的比生产率g/L/OD/hr) ;y2轴，细胞密度(OD6J。比生产率(实心条)和0D_ (菱形)。在诱导(600uM IPTG)后3和4. 5h，测量至少2个生物副本。图板(B)是细胞内代谢物浓度。cMEPP 2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸；HDMAPP_羟基二甲基烯丙基二磷酸酯；DMAPP- 二甲基烯丙基二磷酸酯；IPP-异戊烯基二磷酸酯。Y轴代谢物浓度，mM。在诱导(600uM IPTG)后3. 75h，进行显示的测量；单独的实验样品来自(A);副本产生类似的结果。图86(包括2个图板图86A和86B)显示了菌株REMG2_11、REMG4_11和REMG39的小规模对比的结果。图板(A)是异戊二烯生产相对于生长的比生产率。yl轴，异戊二烯生产的比生产率(Ug/L/OD/hr) ;y2轴，细胞密度(OD6tltl)。比生产率(实心条)和OD6tltl (菱形)。在诱导(400uM IPTG)后I和3. 5h，测量至少2个生物副本。图板⑶是菌株的细胞内代谢物浓度。I轴是代谢物浓度，mM。cMEPP 2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸；HDMAPP_羟基二甲基烯丙基二磷酸酯。显示的测量是在诱导(400uM IPTG)后3.5h来自(A)的样品；副本产生类似的结果(第1-3行REM G2_ll ;第4-6行REM G4_ll ;第7-9行REMG39)。图87描述了 pEWL454的质粒图谱。质粒基础是pK184。pl5A ori-质粒复制起点；RBS-核糖体结合位点；kan-卡那霉素抗生素抗性标志物。图88描述了 PtacAnabaenaAspA终止子/pEWL454的质粒图谱。这是与图87相同的质粒基础。鱼腥藻属IspH-来自鱼腥藻属的编码IspH酶的基因。图89描述了菌株REMI7_11，和REMH8_12的异戊二烯生产和细胞内代谢物的比生产率。在诱导(500uM IPTG)后3和3. 75h，对比了 2个菌株。显示了来自至少2个生物副本的异戊二烯测量结果；没有显示副本的代谢物数据，但是产生了类似的结果。图90(包括 3 个图板图 90A、90B 和 90C)描述了菌株 REM H8_12 和 REM G4_11(A)的15-L规模发酵的结果。图板(A)是REMH 8_12 (空心方框)和REM G4_ll(空心圆形)的异戊二烯效价(g/L培养液)；图板⑶由光密度(550nm)描绘的细胞生长；图板(C)DXP代谢物。在(C)的下面，显示了描述代谢物特性的图例；关于代谢物的描述，参见图80。
图91描述了 DMAPP对Dxr的制备规模灭活的结果。图92 (包括2个图板92A和92B)描述了携带工程化的DXP途径和更低的MVA途径的菌株REM H8_12和REM 17_11的异戊二烯生产。上图显示了异戊二烯生产，其具体地由于向在[U-13C]-葡萄糖上培养的培养物添加指示浓度的MVA。下图显示了异戊二烯生产，其具体地源自[U-13C]-葡萄糖]。在用IPTG诱导培养物以后指定的时间，进行异戊二烯测量。通过GC-MS监测形成的异戍二烯,在m/z = 67以及m/z = 73进行检测。m/z = 67会报告来自MVA(所有12C)的异戊二烯，m/z = 73会报告源自[U-13C]-葡萄糖的异戊二烯。图93描述了 pDW15的质粒图谱。mob-质粒活动化区域；AacCl (庆大霉素抗性)_氨基糖苷乙酰基转移酶，庆大霉素抗性基因；M13反向和M13正向-各个引物的结合位点；Ptrc, Trc启动子；mvaE和mvaS-分别是编码乙酰乙酰-辅酶A硫解酶/3-轻基-3-甲基戍二酰基-辅酶A还原酶和3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶的粪肠球菌基因；RepA-质粒复制蛋白。
图94描述了 PTrp mMVK/pDW15的质粒图谱。与图I相同的质粒基础)。Trp启动子；编码的马氏甲烷八叠球菌MVK-编码甲羟戊酸激酶的马氏甲烷八叠球菌基因；aspA终止子。图95描述了 pMCM900的质粒图谱。FRT-Flip重组酶靶位点；核心Trc启动子-RNA聚合酶结合位点；lac操纵子-LacI结合位点；PMK orf-酵母磷酸甲羟戊酸激酶编码序列；MVD orf-酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码序列；yIDI-酵母异戊烯基二磷酸酯异构酶编码序列；aspA终止子-aspA转录终止子；attTn7下游-glmS-下游重组祀向序列；KanR-卡那霉素抗性基因；R6K ori-质粒复制起点；attTn7上游(pstS)-上游重组靶向序列。图96描述了在有和没有膦胺霉素存在下，对于在未标记的葡萄糖上培养的菌株REM A2_17，测定相对于培养物密度的比生产率的实验的结果。yl轴，异戊二烯生产的比生产率(y g/L OD hr) ；y2轴，细胞密度(0D_J。比生产率(实心条)和细胞密度(菱形)。在用OmM或2mM膦胺霉素诱导后大约45分钟，进行测量；二者发生在400uM IPTG诱导后大约3小时。显示的数据是3个生物副本的平均值；显示了比生产率和细胞密度值的误差棒。数据提示，由MVA途径和DXP途径产生的异戊二烯分别占大约59%和41% ;MVA通量由在暴露于膦胺霉素过程中生产的异戊二烯相对于在没有抑制剂存在下生产的异戊二烯的量的分数决定。图97描述了测定膦胺霉素对REM A2_17菌株中DXP和MVA途径代谢物的积累和异戊二烯生产率的影响的实验的结果。在有和没有2mM膦胺霉素存在下(分别是“+FM”和“-FM”)温育45min结束时，在培养物中测量沉淀的细胞(与图96相同的细胞)中的代谢物浓度和异戊二烯生产率。将结果表示为在3个不同的培养物中测得的浓度和速率的平均比。图98描述了在有和没有膦胺霉素存在下，对于在未标记的和I-13C标记的葡萄糖上生长的菌株REM A2_17，测定比生产率相对于培养物密度的实验的结果。yl轴，异戊二烯生产的比生产率(Ug/L OD hr) ;y2轴，细胞密度(0D_J。比生产率(实心条)和细胞密度(菱形)。泳道I :没有色氨酸且没有膦胺霉素的未标记的培养物；泳道2 :没有色氨酸且没有膦胺霉素的I-13C葡萄糖培养物；泳道3 :含有50uM色氨酸且没有膦胺霉素的I-13C葡萄糖培养物；泳道4 :没有色氨酸且含有2mM膦胺霉素的未标记的培养物；泳道5 :含有50uM色氨酸且含有2mM膦胺霉素的I-13C葡萄糖培养物；泳道6 :含有50uM色氨酸且含有2mM膦胺霉素的I-13C葡萄糖培养物。在用OmM或2mM膦胺霉素诱导后大约45分钟，进行测量；二者发生在400uM IPTG诱导后大约3小时。显示的数据是2个技术副本的平均值；显示了比生产率值的误差棒。数据提示，对于未标记的培养物，由MVA途径和DXP途径产生的异戊二烯分别占大约52%和48%。类似地，数据提示，57% MVA-通量至43% DXP-通量和49% MVA-通量至51% DXP-通量分别促进了不含有和含有50uM色氨酸的I-13C葡萄糖培养物产生的异戊二烯。由泳道3和6表示的因色氨酸在培养物的生长培养基中的存在所介导的MVK酶的抑制表达，在数据上反映为与生长培养基中没有加入色氨酸时生长的培养物相比总通量降低了 24% -34%。对于每个具体的培养物类型，MVA通量由在暴露于膦胺霉素过程中生产的异戊二烯相对于在没有抑制剂存在下生产的异戊二烯的量的分数决定。图99描述了在有和没有膦胺霉素存在下，对于在3-1 葡萄糖上生长的菌株REMA2_17，测定比生产率相对于培养物密度的实验的·结果。yl轴，异戊二烯生产的比生产率(ug/L OD hr) ;y2轴，细胞密度(0D_J。比生产率(实心条)和细胞密度(菱形)。在用OmM或2mM膦胺霉素诱导后大约I小时，进行测量；二者发生在400uM IPTG诱导后大约3小时。显示的数据是2个技术副本的平均值；显示了比生产率值的误差棒。数据提示，由MVA途径和DXP途径产生的异戊二烯分别占大约58%和42% ；MVA通量由在暴露于膦胺霉素过程中生产的异戊二烯相对于在没有抑制剂存在下生产的异戊二烯的量的分数决定。图100(图板A和B)描述了经由糖酵解从A)1-13C葡萄糖和B)3_13C葡萄糖分解代谢产生的异戊二烯的DXP和MVA途径-特异性的标记模式。黑色圆形表示13C原子在指定的位置处的100%丰度。一半黑色的圆形表示50%的13C丰度，剩余的50%是来自空心圆形显示的葡萄糖中的位置的12C原子。图101 (图板A和B)描述了在有或没有膦胺霉素(分别是+FM和-FM)存在下，在A) I-13C葡萄糖或B) 3-1 葡萄糖上生长的REM A2_17菌株中异戊二烯和cMEPP特定同位素标记异构体(cumomer)的计算的分布。图102 (图板A和B)描述了下述物质的GC-MS波谱A)具有天然的13C丰度的未标记的(合成的)异戊二烯标准物，和B)在3-1 葡萄糖上生长的REM A2_17菌株的异戊二烯。注意到，由于13C富集，与异戊二烯标准物相比，在REM A2_17菌株中，m/z 68、69和70峰的强度比m/z 67峰更高。图103描述了随着MVA/MEP途径之比而变化的异戊二烯13C同位素富集的结果。图104描述了用于制备、收集和分析Bioisoprene 产物的一个示例性的仪器。图105描述的结果显示了天然13C-丰度异戊二烯的13C NMR谱。图106描述的结果显示了源自MVA/MEP双途径菌株的异戊二烯的13C NMR谱。与C-3相比，C-I和C-2/C-4是13C-富集的，等于或小于噪首水平的/[目号强度表明在该菌株中MVA和MEP途径对异戊二烯合成的贡献。图107描述了 PL. 6fkpB基因座的一部分的简图。在图中描绘的区域的核苷酸序列，用在简图下面列出的323个碱基指出。用灰色显示了具有同源性的5’和3’区域，所述区域用于整合在fkpB上游的PL. 6启动子。用黑色粗体文字突出显示的序列表示，在Gene Bridges氯霉素抗性盒环出(Ioopout)以后在该区域中剩下的外源序列,在该图中称作Gene Bridges疤痕，剩余的FRT(翻转酶识别靶物)位点标有下划线。用正常的黑色文字显示PL. 6启动子序列。在该图中指出了 -35、-10和RBS (核糖体结合位点)位置。图108 (图板A、B、C、D)描述了 4种菌株的异戊二烯生产的对比。图板A，在200uMIPTG的2个时间点时菌株WW119(图板B和C中的菌株的亲代)的典型的异戊二烯生产。如在关于图板B和C的菌株的文本中所述，进行该实验，但是，异戊二烯监测限于2和4小时。在所有菌株的培养期中，以每小时的间隔，监测0D_。图板B显示了在几个IPTG浓度时菌株REM 6_15(PL. 6fkpB-ispH8 AiscR)的异戊二烯比生产率。图板C显示了在几个IPTG浓度时 菌株REM D8_15(PL. 6fkpB-ispH)的异戊二烯比生产率。所述数据与AiscR挽救PL.6fkpB-ispH导入以后丧失的异戊二烯生产相一致。图板D显示了在几个IPTG浓度时菌株REM D7_15的异戊二烯比生产率。图109显示了大肠杆菌ispH蛋白印迹的照片。泳道描述如下泳道I, SeeBlue Plus2预染色的标准物，Invitrogen,泳道2,大肠杆菌ispH纯化的标准物(0. 4 u g),泳道3，REM A7_15可溶级分，泳道4，REM A7_15不可溶级分，泳道5，REM A8_15可溶级分，泳道6，REM A8_15不可溶级分，泳道6，REM Dl_14可溶级分，泳道7，REM Dl_14不可溶级分，泳道8，WW103可溶级分，和泳道10，WW103不可溶级分。显影方法1° Ab抗-兔大肠杆菌ispH 在 I : 10，000 稀释度，2。Ab Alexa Fluor 488 山羊抗-兔 IgG (H+L), Invitrogen,I 1，000稀释度；其它细节，参见文本。凝胶是Novagen 4_12%BT凝胶。将装载标准化为相同的0D6QQ。Pel，沉淀物；sup，上清液。图110显不了大肠杆菌ispH蛋白印迹定量。通过ImageQuant 5. 2 (MolecularDynamics)，定量蛋白印迹数据。浅色阴影条表示在可溶级分中发现的ispH的量。深色阴影条表示在不可溶级分中发现的ispH的量。
具体实施例方式除了别的以外，本发明提供了用于生产增加的量的异戊二烯的组合物和方法，其中使用不同的DXP途径基因和多肽、不同的MVA途径基因和多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因和多肽、异戊二烯合酶基因和多肽、和任选的IDI基因和多肽以及与DXP途径和/或MVA途径有关的不同基因和多肽。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology,第 2 版，John Wiley and Sons, New York (1994),和 Hale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N. Y. (1991)为技术人员提供了本发明中使用的很多术语的一般含义。应该理解本发明不限于所描述的特定的方法、程序和试剂，因为它们是可变的。本领域技术人员还将认识到，也可以使用与本文描述的那些相似或等同的任意方法和材料来实施或测试本发明。本文提供的小标题不是本发明的各个方面或实施方式的限制，而已通过参考作为一个整体的说明书来获得本发明。本文使用的术语“异戊二烯”或“2-甲基-1，3-丁二烯”(CAS# 78-79-5)是指，从3，3_二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消除焦磷酸而产生的直接的和最终的挥发性C5烃产物，并且不包括一个或多个异戊烯二磷酸(IPP)分子与一个或多个DMAPP分子的连接或聚合。术语“异戊二烯”一般不意在限于其生产方法。本文使用的短语“与DXP途径有关的不同基因和多肽”或“DXP途径相关的核酸或多肽”表示与DXP途径多肽或核酸直接地或间接地相互作用的任意核酸或多肽，包括，但不限于萜合酶(例如，罗勒烯合酶、法呢烯合酶和青蒿素合酶)。除非另有明确指明，否则在本文中使用的术语“一个”、“一种”等是指一个或多个。
在本文中提及“约”某数值或参数包括(并且描述)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括界定该范围的数值。应该理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括“包含”、“由......组成”、
和“基本上由......组成”的方面和实施方式。本发明部分地基于下述令人惊讶的发现，即增加的量的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽会增加DXP途径 多肽(例如HDS (GcpE或IspG)或HDR多肽(IspH或LytB)表现出的活性。尽管不希望受特定理论的约束，据信，一种或多种内源或异源铁硫相互作用的氧化还原核酸或多肽的增加的表达，会提高含有铁硫簇的DXP途径多肽(例如HDS或HDR)的形成速率和量，和/或稳定化含有铁硫簇的DXP途径多肽(例如HDS或HDR)。这又会通过增加HMBPP和/或DMAPP的合成和减少DXP途径中的cMEPP和HMBPP蓄池，而增加细胞中供给异戊二烯合成的碳通量。例如，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽(黄素氧还蛋白I)在过表达DXP途径多肽(DXS)、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽的细胞中的过表达，会使异戊二烯生产比仅过表达DXP途径多肽、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽的细胞增加约1-2倍。参见实施例8。一种或多种铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽(铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶)、一种或多种DXP途径多肽、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽的过表达，会导致增加的异戊二烯生产。参见实施例9。因此，在本发明的一个方面，培养的细胞包含(i)编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽的异源核酸、编码DXP途径多肽的异源核酸和编码异戊二烯合酶的异源核酸，和/或(ii)编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽的内源核酸的副本拷贝。在一些实施方式中，培养的细胞包含(i)编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽的异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，(ii)编码DXP途径多肽的异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，和(iii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝。在本发明的另一个方面，提供了生产异戊二烯的方法。在一个实施方式中，所述方法包括(a)在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和(b)生产异戊二烯。本文使用的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽是，能够将电子转移给含有铁硫簇的多肽的多肽。铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽包括、但不限于黄素氧还蛋白(例如，黄素氧还蛋白I)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(例如，铁氧还蛋白I)、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、以及编码它们的基因或多肽(例如，fpr或fldA)。例如，DXP途径多肽HDS (GcpE)是处理[4Fe-4S]2+中心的金属酶，并催化cMEPP还原成HMBPP，所述还原是通过在有黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶存在下由[4Fe-4S]2+中心的还原所介导的2个连续的单电子转移来实现(参见，Wolff等人，FEBS Letters, 541 :115-120 (2003))，它通过引用整体并入本文)。类似地，DXP途径多肽HDR(LytB)也是Fe/S蛋白，其催化HMBPP还原成IPP或DMAPP，所述还原是通过在有黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶/NADPH系统存在下的2个连续的单电子转移来实现。参见,例如，Seemann, M.等人Agnew. Chem. Int.Ed. ,41 :4337-4339(2002) ；ffolff, M.等人，FEBS Letters, 541 :115-120 (2003)，它们各自通过引用整体并入本文，特别是关于GcpE、LytB和黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶/NADPH系统的描述)。本文使用的黄素氧还蛋白是能够转移电子的蛋白，且含有辅基黄素单核苷酸。在大肠杆菌(E. coli)中，黄素氧还蛋白由fldA基因编码，并被含有FAD的蛋白NADPH :铁氧还蛋白氧化还原酶还原，且在类异戊二烯生物合成的DXP途径中起重要作用(实例参见，Kia-Joo, P.等人 FEBS Letters，579 :3802_3806，2005，它通过引用整体并入本文)。
本文使用的铁氧还蛋白是能够转移电子的蛋白，且含有等量的铁和不稳定的硫，并在类异戊二烯生物合成的DXP途径中起重要作用。例如，已经证实来自植物和蓝细菌的HDS是铁氧还蛋白，而不是黄素氧还蛋白-依赖性的酶(Seemann等人,FEBS Lett. , 580 (6)1547-52 (2006)，它通过引用整体并入本文)。本文使用的Fpr会编码黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白NADPH-氧化还原酶,并为HDS和HDR提供经由FldA从NADPH衍生出的必要的电子，以执行它们的催化功能(综述见下述报告L. A. Furgerson, The Mevalonate-不依赖的 Pathway to Isoprenoid Compounds Discovery, Elucidation, and Reaction Mechanisms, 13, 2006 年 2 月 13 日出版，它通过引用整体并入本文)。本文使用的编码的DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS和HDR多肽是异戊二烯生物合成的DXP途径的组分(图19A)。 DXS多肽会将丙酮酸盐和D-甘油醛-3-磷酸转化成I-脱氧-D-木酮糖_5_磷酸(DXP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加DXS多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。DXR多肽会将I-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)转化成2_C_甲基-D-赤藓醇4_磷酸(MEP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加DXR多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。MCT多肽会将2-C-甲基-D-赤藓醇4_磷酸(MEP)转化成4_(胞苷5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(⑶P-Me)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加MCT多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。CMK多肽会将4-(胞苷5 ’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(OTP-ME)转化成2_磷酸-4-(胞苷5’- 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(OTP-MEP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加CMK多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。MCS多肽会将2-磷酸-4-(胞苷5’ - 二磷酸)-2_C_甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加MCS多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。HDS多肽会将2-C-甲基_D_赤藓醇2，4_环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)转化成(E) -4-羟基-3-甲基丁 -2-烯-I-基-二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加HDS多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。HDR多肽会将(E) ~4~羟基_3_甲基丁 _2_烯_1_基-二磷酸(HMBPP)转化成异戊烯基二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加HDR多肽的量会增加经过DXP途径的碳流，导致更大的异戊二烯生产。
异戊二烯合酶多肽会将二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)转化成异戊二烯。异源的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽可以在多种宿主细胞中表达，例如大肠杆菌(E. coli)、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母和里氏木霉。所有这些细胞生产比单独的天然存在的DXP途径更多的异戊二烯。如下面进一步讨论的，通过增加铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽的表达的量，可以增强细胞的异戊二烯生产。DXP途径多肽包括DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS和HDR。例如，可以将一个或多个DXP途径核酸导入细胞中，这包括DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS 和 HDR。DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS 或 HDR 核酸可以是异源核酸或内源核酸的副本拷贝。类似地，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸可以是异源核酸或内源核酸的副本拷贝。类似地，异戊二烯合酶核酸可以是异源核酸或内源核酸的副本拷贝。在一些实施方式中，如下增加一种或多种铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXS、DXR、 MCT、CMK、MCS、HDS或HDR多肽中的一种或多种和异戊二烯合酶多肽的量通过将一个或多个内源铁硫簇-相互作用的氧化还原启动子或调节区、内源DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR启动子或调节区中的一个或多个、和异戊二烯合酶启动子或调节区替换为其它启动子和/或调节区，后者导致铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR核酸中的一个或多个和异戊二烯合酶核酸的更大转录。 在一些实施方式中，异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸的存在，会造成所述细胞与仅具有这些异源或额外的内源核酸中的一个或2个的对应细胞相比更有重现性地生长和/或存活更久。尽管不希望受特定理论的约束，据信，过表达铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽可以增加一种或多种DXP途径多肽(例如，GcpE和/或LytB)的形成速率或量，或稳定化一种或多种DXP途径多肽(例如，GcpE和/或LytB)，使得一种或多种DXP途径多肽在更长的时间段内具有活性，这又会造成含有异源的或额外的内源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞与仅具有这些异源或额外的内源核酸中的一个或2个的对应细胞相比更有重现性地生长和/或存活更久。例如，含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞，会比下述细胞更好地生长仅具有DXP途径核酸的细胞，仅具有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸的细胞，具有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸和DXP途径核酸的细胞，具有铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞，或具有DXP途径核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞。另外，可以在细胞中表达大量的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，而不造成对细胞的过量毒性。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了第一种DXP途径多肽以外，细胞表达第二种DXP途径多肽，包括DXS (I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)、DXR(1-脱氧_D_木酮糖-5-磷酸还原异构酶)、MCT (4- 二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK (4- 二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS (2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS (I-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶)和HDR (I-羟基-2-甲基_2_ (E) - 丁烯基4-二磷酸还原酶)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种DXP途径多肽以外，细胞表达两种或更多种DXP途径多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，除了如上所述的第一种DXP途径多肽以外，细胞表达2、3、4、5、6或7种DXP途径多肽。
另外，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸(例如，DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR)和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXS核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在其它实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、HDS (IspG或GcpE)和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，细胞包含IspG和fldA。在另一个实施方式中，细胞包含IspG、fldA和IspH。在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强 含有异源黄素氧还蛋白核酸、DXS核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在其它实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源黄素氧还蛋白核酸、HDS(IG或GE)核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁氧还蛋白核酸、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶核酸、DXS核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在其它实施方式中，通过增加细胞表达的IDI多肽的量，可以增强含有异源铁氧还蛋白核酸、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶核酸、HDS(IspG或GcpE)核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI (异戊烯基-二磷酸S-异构酶)多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、HDRdspH或LytB)核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，细胞包含IspG和fldA。在另一个实施方式中，细胞包含IspG、fldA和IspH。在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI (异戊烯基-二磷酸S-异构酶)多肽的量，可以增强含有异源黄素氧还蛋白、HDRdspH或LytB)和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI(异戊烯基-二磷酸S-异构酶)多肽的量，可以增强含有异源铁氧还蛋白核酸、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶核酸、HDR(IspH或LytB)核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过增加细胞表达的IDI (异戊烯基-二磷酸S-异构酶)多肽的量，可以增强含有异源铁氧还蛋白核酸、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶核酸、HDS和HDR核酸和异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产。IDI多肽会催化异戊烯基二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)的相互转化。尽管不希望受任何具体理论的约束，据信，增加细胞中IDI多肽的量，会增加转化成DMAPP的IPP的量(和转化率)，所述DMAPP又被转化成异戊二烯。IDI核酸可以是异源核酸或内源核酸的副本拷贝。在一些实施方式中，如下增加铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽(例如，DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR)中的一种或多种、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽的量通过将内源铁硫簇-相互作用的氧化还原启动子或调节区、内源DXP途径启动子或调节区中的一个或多个和IDI启动子或调节区替换为其它启动子和/或调节区，后者导致铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、异戊二烯合酶核酸和IDI核酸的更大转录。
异源的IDI多肽也可以在多种存在异戊二烯合酶的宿主细胞中表达，例如大肠杆菌(E. coli)、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母和里氏木霉。与不使用IDI时相比，所有这些细胞生产更多的异戊二烯。另外，通过增加细胞表达的DXP途径相关的多肽的量，可以增强含有异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸(例如，DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR)、异戊二烯合酶核酸和任选的IDI核酸的细胞的异戊二烯生产。在本发明的任意方面的一些实施方式中，通过使用源自它们的突变型DXP途径多肽或核酸，可以进一步增加异戊二烯生产。在一些实施方式中，突变型DXP途径多肽是去除了铁硫簇调节物(iscR)的HDR多肽。在一些实施方式中，突变型DXP途径多肽是仅生产DMAPP或与IPP相比生产大量DMAPP的突变型HDR多肽。例如，在DXP途径-介导的异戊二烯生产菌株中使用LytBG120D，允许独特地制备几乎完全源自DMAPP的类异戊二烯产物.参见实施例18。本文使用的iscR是由位于编码大肠杆菌Fe-S簇装配蛋白的基因的上游紧邻处的ORF编码。在DXP途径中，在大肠杆菌菌株中实现指导参与铁硫簇装配的isc操纵子的过表达的基因盒，从该菌株中厌氧地纯化的HDR蛋白被工程化了至少200倍(GrSwert等人，J Am Chem Soc. 126(40) :12847-55(2004) ;Schwartz 等人，PNAS，98 (26) :14751-3(2001)；Akhtar 和 Jones, Appl. Microbiol. Biotechnol. 78 (5) :853-62 (2008)，它们各自通过引用 整体并入本文)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，通过增加经过DXP途径的碳通量，可以进一步增加异戊二烯生产。在一些实施方式中，通过避免在DXP途径下游的代谢物和/或使用DXP途径多肽(例如，DXR)作为底物的其它途径的中间体对DXS活性的任何反馈抑制，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过再平衡途径酶和维持HMBPP和DMAPP的水平在低于l-2mM DMAPP和l_2mM HMBPP的浓度，可以减轻一些DXP途径多肽(例如，DXR)的反馈抑制。在一些实施方式中，在发酵运行期间，维持HMBPP和DMAPP的水平低于ImM。在其它实施方式中，在发酵的指数期内，维持HMBPP和DMAPP的水平低于ImM。在其它实施方式中，将晚期DXP途径酶、尤其是IspG和IspH维持在与使Dxr的磷酸化水平最小化相一致的水平。在一些实施方式中，使用DXP途径多肽作为底物(例如，DXP)的其它途径是硫胺素(维生素BI)或吡哆醛(维生素B6)途径。在一些实施方式中，通过表达来自不同生物体的DXP途径多肽(其不会受到DXP途径的下游产物的抑制)，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过解调节葡萄糖摄取，可以增加碳通量。在其它实施方式中，通过使DXP途径所需的前体之间的平衡最大化，可以增加碳通量。在一些实施方式中，通过利用分别升高或降低丙酮酸盐或G-3-P的效应来重新指导碳通量，可以实现DXP途径前体丙酮酸盐和甘油醛-3-磷酸(G-3-P)的平衡。在一些实施方式中，通过使用含有丙酮酸脱氢酶El亚基变体的菌株(其含有一个或多个DXP途径基因或一个或多个属于DXP途径和MVA途径的基因)，可以增加碳通量。在一些实施方式中，丙酮酸脱氢酶(I3DH) El亚基变体具有一个E636Q点突变。在一些实施方式中，通过使用CRP-删除的突变体，可以增加碳通量。本文使用的CRP(cAMP受体蛋白)是被环AMP活化的正调节蛋白。开始大肠杆菌的某些(分解代谢物敏感的)操纵子的转录，需要RNA聚合酶。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，可以如下进一步增加异戊二烯生产通过利用DXP途径的下游基因或多肽，通过将异源萜合酶核酸或内源萜合酶核酸的副本拷贝导入细胞中，所述萜合酶包括、但不限于罗勒烯合酶、法呢烯合酶和青蒿素合酶。在一些实施方式中，将可再生的碳源用于生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯和任意氧化剂的浓度是在不可燃范围内，以减小或消除在生产或回收异戊二烯过程中可能着火的风险。参见例如，美国申请号61/133，947(它通过引用整体并入本文，尤其是关于实施例13中异戊二烯的可燃性建模和测试)和W02010/003007。本发明的组合物和方法是合乎需要的，因为它们允许获得高异戊二烯产率/细胞、高碳产率、高异戊二烯纯度、高生产率、低能量使用、低生产成本和投入以及最小的副反应。这种用于生产异戊二烯的有效率的大规模的生物合成方法，提供了用于基于 合成的异戊二烯的橡胶的异戊二烯来源，并且提供了替代使用天然橡胶的合乎需要的低成本的替代方式。在一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸和异戊二烯合酶核酸至少约5、10、20、50、75、100、200、300次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在一些实施方式中，至少一部分细胞维持异源铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸和IDI核酸至少约5、10、20、50、75、100、200、300次或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含异源的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸和DXP途径相关的核酸或内源的对应核酸的副本拷贝的核酸也包含选择性标志物，例如卡那霉素、氨苄西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素抗生素抗性核酸。通过向细胞培养基中添加酵母提取物，可以进一步增加所生产的异戊二烯的量。例如，对于所测试的浓度，所生产的异戊二烯的量与细胞培养基中酵母提取物的量成线性比例。相对于在存在酵母提取物的情况下增加葡萄糖的量，在存在葡萄糖的情况下增加酵母提取物的量，可以生产更多的异戊二烯。另外，增加酵母提取物的量允许细胞在更长的时间生产高水平的异戊二烯，并改善细胞的健康。还使用三种类型的水解的生物质(甘蔗渣、玉米秸杆和软木浆)作为碳源证明了异戊二烯的生产。如果需要，可以在本发明的组合物和方法中使用任意其它生物质碳源。生物质碳源是合乎需要的，因为它们比很多常规的细胞培养基更便宜，从而促进了异戊二烯的经济生产。在一些实施方式中，在细胞培养基中包括油。参见，例如，美国61/134，094，它通过引用整体并入本文，尤其是关于在细胞培养基中包括的油。在一些实施方式中，在细胞培养基中包括了一种以上的油(例如2、3、4、5、或更多种油)。不被任何特定理论所限，相信(i)油可以增加细胞中的可用于被转化为异戊二烯的碳的量；(ii)油可以增加细胞中甘油醛3-磷酸和/或丙酮酸盐的量，从而增加经过DXP途径的碳流；和/或(iii)油可以向细胞提供额外的营养物，这是合乎需要的，因为细胞中的多数碳被转化为异戊二烯而不是其它产物。在一些实施方式中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天然地使用DXP途径来生产异戊二烯或经过遗传修饰以包含整个DXP途径的核酸。在一些实施方式中，在添加到细胞培养基中之前，油被部分地或全部地水解以促进宿主细胞对油的利用。
示例性的多肽和核酸在本发明的组合物和方法中，可以使用不同的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽和核酸、DXP途径多肽和核酸、DXP途径相关的多肽和核酸、异戊二烯合酶多肽和核酸和IDI多肽和核酸。本文使用的“多肽”包括多肽、蛋白、肽、多肽片段和融合多肽。在一些实施方式中，融合多肽包括第一种多肽(例如，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽或其催化活性片段)的一部分或全部，且可以任选地包括第二种多肽(例如，便利融合多肽的纯化或检测的肽，例如His-标签)的一部分或全部。在一些实施方式中，融合多肽具有两种或更多种DXP途径多肽的活性。在多个实施方式中，多肽具有至少或约50、100、150、175、200、250、300、350、400、或更多个氨基酸。在一些实施方式中，多肽片段包含来自全长多肽的至少或约25、50、75、
100、150、200、300、或更多个连续氨基酸并且具有至少或约5%、10%、20%、30%、40%、·50%、60%、70%、80%、90%、95%或100 %的对应的全长多肽的活性。在具体的实施方式中，多肽包括任意天然存在的铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的氨基酸序列区段或整个氨基酸序列。在一些实施方式中，相对于野生型(即天然存在的序列)铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的序列，多肽具有一个或多个突变。在一些实施方式中，多肽是分离的多肽。本文使用的“分离的多肽”不是多肽文库的一部分，所述多肽文库例如2、5、10、20、50或更多个不同多肽的文库；而是分离自天然状态下与其一起产生的至少一个成分。例如通过表达编码多肽的重组核酸，可以获得分离的多肽。在一些实施方式中，多肽是异源多肽。“异源多肽”是指这样的多肽其氨基酸序列与在相同宿主细胞中天然表达的另一多肽的氨基酸序列不相同。具体地，异源多肽与天然状态下存在于相同宿主细胞中的野生型多肽不相同。本文使用的“核酸”是指单链或双链形式的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。在一些实施方式中，核酸是重组核酸。“重组核酸”是指这样的目标核酸其不含在所述目标核酸所源自的生物体的天然状态下存在的基因组中侧接该目标核酸的一个或多个核酸(例如基因)。因此，该术语包括例如，掺入到载体中、掺入到自我复制型质粒或病毒中、或掺入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独分子(例如，cDNA、基因组DNA片段、或通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA片段)而存在。在多个实施方式中，核酸是重组核酸。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸可操作地连接至编码全部或部分的另一多肽的另一核酸，从而重组核酸编码融合多肽，所述融合多肽包括铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽和/或IDI和全部或部分另一多肽(例如促进融合多肽的纯化或检测的肽，例如His-标签)。在一些实施方式中，部分或全部的重组核酸是化学合成的。应该理解突变，包括单核苷酸突变，可以发生在本文定义的核酸内。在一些实施方式中，核酸是异源核酸。“异源核酸”是指这样的核酸其核酸序列与在相同宿主细胞中天然存在的另一核酸的核酸序列不相同。在具体的实施方式中，核酸包括任意天然存在的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的核酸序列区段或整个核酸序列。在一些实施方式中，核酸包括来自天然存在的铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的至少或约50、
100、150、200、300、400、500、600、700、800、或更多个连续核苷酸。在一些实施方式中，相对于野生型(即天然存在的序列)铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的序列，核酸具有一个或多个突变。在一些实施方式中，核酸具有增加铁硫簇-相互作用的氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关的核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的转录或翻译的一个或多个突变(例如沉默突变)。在一些实施方式中，核酸是编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关的多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的任意核酸的简并变体。“密码子简并性”是指遗传密码的多样性，其允许核苷酸序列变化而不影响所编码的多肽的氨基酸序列。技术人员熟知特定的宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定氨基酸时表现出的“密码子偏爱”。因此，当合成用于改善宿主细胞中的表达的核酸时，在一些实施方式中合乎需要地将核酸设计为使其密码子使用频率达到宿主细胞的优选密码子使用频率。示例性的异戊二烯合酶和DXP途径多肽和核酸的登记号列举于附件I (附件I的登记号和它们的相应序列通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。Kegg数据库也包含多个示例性的异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(参见，例如，互联网网址“genome, jp/kegg/pathway/map/mapOO 100. html”和其中的序列，它们各自通过引用整体并入本文,尤其是关于异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和/或核酸中的一项或多项具有与2007年12月12日 或2008年9月14日公开的序列相同的序列，例如对应于附件I中的登记号的任意序列，或Kegg数据库中的任意序列。另外的示例性的异戊二烯合酶和/或DXP途径多肽和核酸在下面进一步描述。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸如上所述，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化为异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中或在体内测定多肽将DMAPP转化为异戊二烯的能力，使用标准方法来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性的测定法中，按照实施例I描述的摇瓶方法使菌株(例如，本文描述的大肠杆菌/pTrcKudzu菌株)生长，以此来制备细胞提取物。诱导结束后，通过在7000x g离心10分钟沉淀约IOmL细胞，并重悬于5ml不含甘油的PEB中。使用弗氏压碎器(French Pressure cell)使用标准程序将细胞裂解。或者，在_80°C冷冻/解冻后，以溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理细胞。可以按照例如Silver 等人，J. Biol. Chem. 270 :13010-13016，1995 及其中的参考文献(其通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶多肽活性的测定法的部分)的描述来测定细胞提取物中异戊二烯合酶多肽的活性。在氮气流下，使DMAPP (Sigma)蒸发至干燥，并在PH8. 2的IOOmM磷酸钾缓冲液中重新水化至IOOmM的浓度，并储存于_20°C。为了进行测定，将 5uL IM MgCl2UmM (250 u g/ml) DMAPP,65 u L 植物提取物缓冲液(PEB) (50mMTris-HCl, pH 8. 0,20mM MgCl2, 5%甘油，和2mM DTT)的溶液加入到20ml的具有金属螺丝盖和特氟隆包被的硅隔膜的顶空瓶(Agilent Technologies)中的25 y L细胞提取物中，并在37°C摇动培养15分钟。通过加入200 u L 250mM EDTA使反应猝灭，按照实施例I第II部分的描述通过GC/MS进行定量测定。示例性的异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，例如蝶型花亚科(Faboideae)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自下列的多肽或核酸越南葛藤(野葛)(Sharkey 等人，Plant Physiology 137 :700-712, 2005),葛根(Pueraria Iobata),白杨(例如银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、或银白杨x欧洲山杨(CAC35696)Miller 等，Planta 213 :483-487,2001)，白杨(aspen)(例如美洲山杨)Silver等人，JBC 270(22) :13010-1316,1995),或英国栎(夏栎(Quercus robur)) (Zimmer 等人，WO 98/02550)，其通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达的内容。适宜的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登记号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070、和AY182241 (其通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列的内容)中记载的那些。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是的来自夏栎天然存在的多肽或核酸(即，异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然存在的多肽或核酸以外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。 示例性的DXP途径多肽和核酸示例性的DXP途径多肽包括、但不限于下述多肽中的任一种DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽和具有一种、两种或更多种DXP途径多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。具体地，DXP途径多肽包括具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的DXP途径核酸包括这样的核酸其编码具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽。示例性的DXP途径多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
具体地，DXS多肽会将丙酮酸盐和D-甘油醛3-磷酸转化成1_脱氧-d_木酮糖5-磷酸(DXP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化丙酮酸盐和D-甘油醛3-磷酸的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有DXS多肽活性。DXR多肽会将I-脱氧-d-木酮糖5-磷酸(DXP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇4_磷酸(MEP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化DXP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有DXR多肽活性。
MCT多肽会将2-C-甲基-D-赤藓醇4_磷酸(MEP)转化成4_(胞苷5’ - 二磷酸)-2-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化MEP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有MCT多肽活性。CMK多肽会将4-(胞苷5 ’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(OTP-ME)转化成2_磷酸-4-(胞苷5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(OTP-MEP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化CDP-ME的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有CMK多肽活性MCS多肽会将2-磷酸-4-(胞苷5 ’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)转化成2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化CDP-MEP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有MCS多肽活性。 HDS多肽会将2-C-甲基-D-赤藓醇2，4_环二磷酸转化成(E) _4_羟基_3_甲基丁-2-烯-I-基二磷酸酯(HMBPP或HDMAPP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化ME-CPP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有HDS多肽活性。HDR多妝会将(E) ~4~轻基-3-甲基丁 -2-烯_1_基二憐酸酯转化成异戍烯基二憐酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化HMBPP的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有HDR多肽活性。IDI多肽会将异戊烯基二磷酸酯转化成二甲基烯丙基二磷酸酯。通过在体外、在细胞提取物中或在体内测量多肽的转化异戊烯基二磷酸酯的能力，可以使用标准方法测定多肽是否具有IDI多肽活性。 示例性的MVA途径多肽和核酸在本发明的一些方面，在本文描述的任意组合物或方法中所述的细胞包含编码MVA途径多肽的核酸。在一些实施方式中，MVA途径多肽是内源多肽。在一些实施方式中，细胞包含编码MVA途径多肽的内源核酸的一个或多个额外的拷贝。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子上。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子上。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至强启动子上。在一个具体实施方式
中，将细胞工程化成过表达与野生型细胞有关的内源MVA途径多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽是异源多肽。在一些实施方式中，细胞包含编码MVA途径多肽的异源核酸的超过一个拷贝。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子上。在一些实施方式中，编码MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子上。示例性的MVA途径多肽包括乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AA-辅酶A硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽和具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的MVA途径核酸包括这样的核酸其编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽。示例性的MVA途径多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸。另外，也可以使用MVA途径多肽的变体，其赋予更好的异戊二烯生产结果。可以使用的MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的类型以及制备编码MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的微生物(例如，兼性厌氧菌例如大肠杆菌)的方法，也描述在国际专利申请
发明者A·T·尼尔森, C·M·派瑞斯, D·H·韦尔斯, D·V·瓦维林, G·K·肖塔尼, J·C·麦考利夫, M·C·米勒, R·E·穆尔, W·韦勒, Z·Q·贝克 申请人:丹尼斯科美国公司, 固特异轮胎和橡胶公司