类异戊二烯的生产的制作方法

专利名称：：类异戊二烯的生产的制作方法类异戊二烯的生产交叉引用本申请要求2006年5月26日提交的美国临时申请60/808,989和2006年12月18日提交的60/870,592的优先权，这些临时申请全文引入本文作为参考。
背景技术：
：类异戊二烯在自然界中普遍存在。它们包括不同家族的超过40,000种个体产物，其中许多对于活生物体是至关重要的。类异戊二烯用来维持细胞流动性、电子传递和其它代谢功能。大量的天然和合成类异戊二烯可用作药物、化妆品、香料、色素和颜料、杀真菌剂、抗菌剂、营养品和精细化学中间体。类异戊二烯产物通常由重复的五碳异戊烯二磷酸(IPP)单元组成，尽管也曾报道了不规则的类异戊二烯和多薛。实际上，类异戊二烯是通过它们的前体IPP和其异构体二曱基烯丙基焦磚酸(DMAPP)连续缩合而合成的。已知这些前体有两种途径。除植物以外，真核生物通常利用依赖于曱羟戊酸(MEV)的途径将乙酰辅酶A(乙酰-CoA)转化为IPP，然后IPP纟皮异构化为DMAPP。除了部分例外以外，原核生物一般只利用不依赖于曱羟戊酸的途径或脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径产生IPP和DMAPP。植物既利用MEV途径又利用DXP途径。参见Rohmer等人.(1993)历ocA亂丄295:517-524;Lange等人.(2000)户亂A^/.OS^97(24):13172-13177;Rohdich等人.(2002)尸roc.淑/.JcW.园99:1158-1163。传统上，类异戊二烯通过从诸如植物、微生物和动物的天然来源中提取来生产。然而，由于许多严重的限制，提取的产率通常极低。首先，大多数类异戊二烯在自然中只少量积累。其次，来源生物体通6常不适合大规模培养，而大规模培养是商业生产有效量的所需类异戊二烯所必需的。第三，类异戊二烯提取需要某些有毒溶剂，这需要特殊的处理步骤，因此使类异戊二烯的商业生产变得复杂化。MEV和DXP代谢途径的阐明已经使得类异戊二烯的生物合成生产成为可行的。例如，已经将微生物工程化为过量表达甲羟戊酸途径的一部分或者全部，用于生产被称为紫穗槐-4，11-二烯的类异戊二烯(美国专利7,172,886和7,192,751号)。其它努力集中于平衡甘油醛-3-磷酸和丙酮酸的集合，或者集中于提高l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)和IPP异构酶(idi)的表达。参见Farmer等人.(2001)肌o&c/mo/.7V。g.17:57-61;Kajiwara等人.(1997)肠cA亂丄324:421-426;和Kim等人.(2001)所o化c/mo/.72:408-415。然而，鉴于许多商业应用需要极大量的类异戊二烯产物，仍然需要比现有技术产生更多类异戊二烯的表达系统和发酵方法。微生物代谢向类异戊二烯生产的最佳重定向需要将引入的生物合成途径适当地工程化，从而在持续的时间期限内既能使碳用于有效地产生类异戊二烯，又能阻止代谢中间体的毒性水平的建立。本发明满足了这一需要并且也提供了相关的优势。
发明内容本发明提供用于在单独的或者组合的至少一个异源调节物或发酵条件控制下利用异戊烯焦磷酸途径酶大规模生产类异戊二烯的组合物和方法。合适的类异戊二烯的非限定性的例子包括半萜类(由l个异戊二烯单元衍生)如异戊二烯；单萜类(由2个异戊二烯单元衍生)如月桂烯；倍半碎类(由3个异戊二烯单元衍生)如紫穗槐-4,11-二烯；二萜类(由4个异戊二烯单元衍生)如紫杉二烯(taxadiene);三萜类(由6个异戊二烯单元衍生)如鲨烯；四碎类(由8个类异戊二烯衍生)如j3-胡萝卜素；和多萜类(由8个以上的异戊二烯单元衍生)如多异戊二烯。一个方面，一种生产类异戊二烯的方法包括以下步骤(a)获得多个包含产生异戊烯焦磷酸的酶途径的宿主细胞，其中所有途径酶都在至少一个异源转录调节物的控制之下；和(b)在与为宿主细胞提供最大比生长速率的条件相比为亚最佳的条件下，在培养基中培养该宿主细胞。在某些实施方案中，该途径是甲羟戊酸途径。在其它实施方案中，该途径是DXP途径。在其它实施方案中，该至少一种异源转录调节序列是可诱导的。在其它实施方案中，途径酶处于单个转录调节物的控制之下。在其它实施方案中，途径酶处于多个异源转录调节物的控制之下。在一些实施方案中，所述途径包括编码来自于具有内源曱羟戊酸途径的原核生物的曱羟戊酸途径酶的核酸序列。示例性的具有内源曱羟戊酸途径的原核生物包括〗旦不限于肠^求菌属(^Weracoccw)、j叚单月包菌属(尸sewdowow(xy)禾口葡萄3求菌属(^SV"/7/z少/ococcw51)。在一个实施方案中，甲羟戊酸途径酶选自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和曱羟戊酸激酶。在另一实施方案中，异源核酸序列编码II类HMG-CoA还原酶。在另一实施方案中，宿主细胞在培养基中培养，其中营养物和/或温度水平保持在低于为宿主细胞提供最大比生长速率的水平上。在另一实施方案中，宿主细胞在一种培养基中培养，该培养基中碳源保持在提供低于最大比生长速率的大约90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之间的水平上。在另一实施方案中，宿主细胞在一种培养基中培养，该培养基中氮源保持在提供低于最大比生长速率的大约90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之间的水平上。在另一实施方案中，宿主细胞在培养基中培养，其中温度保持在提供最大比生长速率的低于大约90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之间的水平上。在另一实施方案中，培养基温度保持在比提供最大比生长速率的温度至少低约2°C、4°C、5°C、6°C、8°C、10。C、15。C或20。C。在又另一实施方案中，一种生产类异戊二烯或类异戊二烯前体的方法包括以下步骤(i)进行包含发酵培养基和多个产生类异戊二烯的遗传修饰的宿主细胞的发酵反应，其反应条件使得(a)发酵培养基保持在低于提供所述宿主细胞的最大比生长速率的温度的温度下；(b)发酵培养基中碳源的含量低于提供宿主细胞的最大比生长速率的量；和/或(C)发酵培养基中氮源的含量低于提供宿主细胞的最大比生长速率的量；(ii)回收在(a)至(c)所述的一个或多个条件下产生的类异戊二烯。在一个方面，类异戊二烯在(a)至(c)所述的至少两个条件下产生。在另一方面，类异戊二烯在(a)至(c)所述的所有条件下产生。引用参考本说明书中提到的所有出版物和专利申请都引入本文作为参考，如果每一单独的出版物和专利申请具体且单独地引入本文作为参考。图1A是产生异戊烯焦磷酸("IPP")的曱羟戊酸("MEV")途径的示意图。图1B是产生异戊烯焦磷酸("IPP")和二甲基烯丙基焦磷酸("DMAPP")的l-脱氧-D-木酮糖5-二磷酸("DXP")途径的示意图。Dxs是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr是l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(也被称为IspC);IspD是4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤藓糖醇合成酶；IspE是4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶；IspF是2C-曱基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合成酶；IspG是1-羟基-2-曱基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG);ispH是异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。图2是异戊烯焦磷酸("IPP")和二曱基烯丙基焦磷酸脂("DMAPP")向香叶基焦磷酸("GPP")、法尼焦磷酸("FPP")和香叶基香叶基焦磷酸("GGPP")转化和各种类异戊二烯合成的示意图。图3显示表达质粒pMBIS-gpps的图谱。图4显示表达质粒pAM408的图谱。图5显示表达质粒pAM424的图谱。图6显示表达质粒pTrc99A-ADS、pTrc99A-FSA、pTrc99A-9LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-GTS、pTrc99A画APS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A画TS、pTrc99A画CS、pTrc99A-SS和pAM373的图"i普。图7A-C是质粒pAM489-pAM498的构建和pAM328的图示。图8显示与酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)截决豆HMG-CoA还原酶(tHMGR)相比，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)HMGR-CoA还原酶(HMGR)的较高的比活性和提高的稳定性。图9显示每升细胞干重("DCW")和OD60()之间的相关性。图IOA-B显示与携带酿酒酵母tHMGR和HMGS基因的宿主菌抹相比，携带金黄色葡萄5求菌(Stop/少/ococc^)HMGH和HMGS基因的宿主菌抹的紫穗槐-4,11-二烯体积产率和比产率提高。图11A-B显示较低的温度对大肠杆菌宿主菌抹的紫穗槐-4,ll-二烯产率的影响。图12A-B显示降低的葡萄糖水平对大肠杆菌宿主菌株的紫穗槐-4,11-二烯产率的影响。图13A-B显示较低的温度和降低的葡萄糖水平对大肠杆菌宿主菌抹的紫穗槐-4,11-二烯产率的联合影响。图14A-E和15A-E显示较低的温度和降低的葡萄糖水平和氮水平对大肠杆菌宿主菌林的紫穗槐-4,11-二烯产率的联合影响。图16显示大肠杆菌宿主菌林通过DXP途径产生紫穗槐-4,ll-二发明详述定义除非另外定义，此处使用的所有科技术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在此参考大量定义为具有以下含义的术语术语"任选的，，或"任选地"意思是随后描述的特征或结构可以存在也可以不存在，或者随后描述的事件或状况可以存在也可以不存在，10并且这种描述包括存在具体特征或结构的情况和不存在该特征或结构的情况，或者发生该事件或状况的情况以及不发生该事件或状况的情况。此处使用的术语"代谢途径"是指分解代谢途径或合成代谢途径。合成代谢途径涉及由较小的分子构建较大的分子，这是需要能量的过程。分解代谢途径涉及较大分子的分解，通常释放能量。此处使用的术语"曱羟戊酸途径"或"MEV途径"是指将乙酰-CoA转化为IPP的生物合成途径。MEV途径在图1A中示意性地显示。此处使用的术语"脱氧木酮糖5-磷酸途径"或"DXP途径"是指将甘油醛-3-磷酸和丙酮酸转化为IPP和DMAPP的途径。DXP途径在图1B中示意性地显示。词语"焦磷酸，，在此处与"二磷酸，，可以互换使用。术语"表达载体"或"载体"是指这样一种核酸，它转导、转化或感染宿主细胞，从而使细胞产生除细胞天然的核酸和/或蛋白质以外的核酸和/或蛋白质，或者以对于细胞而言非天然的方式表达核酸和/或蛋白质。术语"内源"是指自然存在的，例如在非重组宿主细胞中存在的物质或过程。术语"生成异戊烯焦磷酸的酶途径"是指任何能够产生异戊烯焦磷酸的途径，包括但不限于甲羟戊酸途径或DXP途径。术语"核酸，，是指任意长度的核普酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸，也可以是脱氧核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多4连DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或包含噤呤和嘧咬碱或其它天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的、或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。术语"操纵子"是指两个或多个连续的核香酸序列，其中每一个编码诸如RNA或蛋白质的基因产物，其表达被一个或多个控制元件(例如启动子)协同调节。术语"基因产物"是指由DNA编码的RNA(或者相反)，或者由RNA或DNA编码的蛋白质，其中基因一般包含一个或多个编码蛋白质的核香酸序列，并且也可以包含内含子和其它非编码核苷酸序列。术语"蛋白质"是指任意长度的氨基酸的聚合形式，可以包括编码的和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸和具有修饰的肽骨架的多肽。此处使用的术语"异源核酸"是指至少下述之一为事实的核酸(a)核酸对于给定宿主细胞来说是外来的("外源的")(即不是自然存在的)；(b)该核酸包含在给定宿主细胞中自然发现的(即，"内源的")核普酸序列，但是该核苷酸序列在细胞中以非自然的(例如高于预期或者高于自然发现的)量产生；(c)该核酸包含在序列上不同于内源核苷酸序列的核苷酸序列，但是该核苷酸序列编码相同的蛋白质(具有相同或基本相同的氨基酸序列)并且在细胞中以非自然的(例如高于预期或者高于自然发现的)量产生；或者(d)该核酸包含两个或多个核苷酸核酸是重组的)。"转基因，，是指外源导入宿主细胞中的基因。它可以包含内源或外源的或者异源的核酸。术语"重组宿主"(也被称为"遗传修饰的宿主细胞"或"遗传修饰的宿主微生物")是指包含本发明的异源核酸的宿主细胞。术语"外源核酸，，是指外源导入宿主细胞中的核酸，因此实际上在给定细胞中通常或自然地不存在和/或不产生。术语"调节元件"是指转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、多腺苷酸信号、终止子、蛋白质降解信号等等，它们提供和/或调节宿主细胞中编码序列的表达和/或编码多肽的产生。术语"转化"是指在导入新核酸后在细胞中诱导的持久的或瞬时的遗传改变。遗传改变("修饰")可以通过向宿主细胞基因组中掺入新DNA，或者通过瞬时或稳定地维-持新DNA作为附加型元件(episomalelement)来实现。在真核细胞中，永久的遗传改变通常通过向细胞基因组中导入DNA来实现。在原核细胞中，永久的遗传改变可以被导入染色体中或者通过染色体外元件如质粒和表达载体导入，该染色体外元件可以含有一个或多个选择性标记来帮助它们保持在重组宿主细胞中。术语"有效连接"是指一种并列，其中这样描述的成分的关系允许它们以预期方式起作用。例如，如果启动子影响核苷酸序列的转录或表达，则启动子与该核苷酸序列有效连接。术语"宿主细胞"和"宿主微生物"在此可以互换使用，是指任何古细菌(archae)、细菌或真核活细胞，其中可以或者已经插入了异源核酸。该术语也涉及原细胞的后代，由于自然的、意外的或故意的突变，它们在形态学上或者在基因组或总DNA互补上可能不一定与原亲本完全相同。术语"合成的"在用于核酸时是指化学合成的寡核苷酸结构单元退火，形成基因片段，然后通过酶装配，构建完整的基因。通过"化学方法"的核酸合成是指组成核苷酸在体外装配。术语"天然的"在用于核酸、细胞或生物体时，是指在自然中发现的核酸、细胞或生物体。例如，可以从自然来源中分离的并且没有在实验室中人工故意修饰的存在于非病原(非致病)生物体中的多肽或多核苷酸序列，是天然的。术语"天然存在的"在用于核酸、酶、细胞或生物体时，是指天然发现的核酸、酶、细胞或生物体。例如，可以从自然来源中分离的并且没有在实验室中人工故意修饰的存在于生物体中的多肽或多核苷酸序列，是天然存在的。术语"生物活性片段"在用于蛋白质、多肽或酶时，是指蛋白质或多肽或酶的功能部分。功能等价物可以具有变异的氨基酸序列，可能由于例如已知在核酸序列和这样编码的蛋白质内天然存在的密码子冗余和功能等价性而产生。或者，功能等价的蛋白质或肽可以通过应用DNA重组技术来构建，在该技术中基于对所交换的氨基酸性质的考虑，可以构建蛋白质结构的改变。术语"类异戊二烯"、"类异戊二烯化合物"、"类异戊二烯产物"、13"辟"、"辟化合物"、"类辟"和"类辟化合物"在此可互换使用。它们是指能够由IPP衍生的化合物。单数形式，如"一种"，包括复数的所指物，除非上下文中清楚地表明不是这样。因此，例如，提到"表达载体"包括一种表达载体以及多种表达载体，而提到"该宿主细胞"包括一种或多种宿主细胞，以此类推。进一步指出，权利要求可以撰写为不包括任何任选的组件。这样，该声明作为在描述权利要求组件时使用如"单独"、"仅仅"等排他性术语或者使用"负面"限制的前提基础。除非另外指出，本发明不限于特定序列、表达载体、酶、宿主微生物或方法，因为这些可能根据本发明所属领域的普通技术人员的理解考虑本文的教导而变化。此处使用的术语只是用于描述具体实施方案，而不是限制。任何合适的宿主细胞都可以在本发明的实施中使用。在一个实施方案中，宿主细胞是遗传修饰的宿主微生物，其中核酸分子已经插入、删除或修饰(即突变；例如，通过核苷酸的插入、删除、置换和/或倒置)，从而产生所需的类异戊二烯化合物或类异戊二烯衍生物，或者实现所需类异戊二烯化合物或类异戊二烯衍生物的提高的产率。在另一实施方案中，宿主细胞能够在液体生长培养基中生长。相反，"对照细胞，，是实验中用于比较目的的替代实验对象或样品，一般是不含对相应宿主细胞所做的修饰的亲本细胞。合适的宿主细胞的说明性例子包括任何原始细胞(archaecell)、原核细胞或真核细胞。原始细胞的例子包括但不限于属于以下属的那些细胞气热菌属(爿eropyrwm)、古生J求菌属(^n:/meg/c^ws)、盐杆菌属(//a/c^a"en'wm)、曱烷3求菌属(T^fe〃7"/70coc"")>曱-完才干菌属(AfW/m"o/"c/e厂/w附)、火；求菌属(尸少racoccws)、石危化叶菌属(5W/o/oZ)M)和热原体属(77^/7wo//wma)。原始细胞抹的说明性例子包括但不限于敏捷气热菌(;erm'x)、闪烁古生球菌(^4rc/meog7oZt^/w/g7'c/tw)、詹氏曱坑球菌(Afef/ia打ococct(s乂a打打osc/i")、热自养甲》咒杆菌(Me/77冊o/)a"en'謂./7zermoflWoro//H'CMm)、尸yracoccw51a6j^s7'、P少racoccws/zor汰o5"/^'、口藍酉菱热原体(T7^，o//(3扁flac^/op/H'/w/7),火山^^y^、体(T7zerwop/"smavo/caw/w附)。原核细胞的例子包括但不限于属于以下属的那些细胞土壤杆菌属(」gra^ac""'wm)、月旨环酉臾才干菌属(爿/z'qyc/o6ac/〃ws)>项圈藻属y4wa6aewa)、纟且囊蓝纟田菌属(^wacj^/^)>节才干菌属^W/zrc^ac/^厂)、固氮菌属(Jzo6fl"er)>芽孑包#干菌属Bac〃/rn1)>短杆菌属(BreW6ac"",画)、色素菌属C7zrow"//"m)、冲炎菌属(C7ay^7.<i/wm)、才奉斥f菌属C(90^7e^ac/^n'wm)、肠4干菌属(EV^ero/^cer)、区欠文氏菌属A，rw/m'a)、^矣希氏菌属(^^c/^Wc/z/a)>專'L一干菌属Lactohac〃/ws)、乳3求菌属(丄actococcM)、才艮瘤菌属M^or/z/zo/)/i,附)、曱基-干菌属(Afc^y/o/"c,er/w/M)、孩t^干菌属M/cra6acten'wm)、席蓝纟田菌属(P/zormzWwm)、布支单月包菌属i^ew^omowfls)、纟工纟田菌属(WAo<io/7a"￡r)、纟工々I单月包菌属)、红螺菌属(i/o<ic>—n7/謂)、红球菌属W/zoti(9coccws)、沙、门氏菌属(》Sa/mowe〃a)、Sce"e(iesmw"、沙、雷氏菌属(^rra"fl)、志贺氏菌属(57^'ge〃a)、葡萄球菌属(^SVfl/7/z/ococcw6")、链球菌属(^SV"ram少ces)>5y朋ecocc"5和发酵单月包菌属(Z拜o附o冊s)。原核菌林的说明性例子包括但不限于枯草芽孢杆菌(^7"7/w>解淀粉芽孢杆菌(紐/〃m菌(Bre"W/(2cten'wwam附o"Zage"^s1)、5reW/)acten'ww/mm"rz'o//n7wm、拜氏才炎菌(C7oWnWwwhe,'geri"ch7)、阪崎肠沐干菌(￡>^era^"ersafa2za&")、大肠軒菌、乳酸乳球菌(丄a"ococci^1/"c"s)、A/^o厂/nio6/Mm/o"'>4同纟录，支单月包菌(尸5^wc/omowas1aerwgiwos"a)、尸sei^omowos1meva/ow//、Pseudomonas/w^ca、荚月莫纟工4干菌(7/0(ic^ac,erca/ww/a/iM1)、J求形纟工沐干菌(iAo(i(9Z)a"e厂^s7/men^(ies)、；果纟工纟工虫累菌(i^cxias^/n7/wmn/Zn/m)、肠沙、门氏菌(iS"/mowe〃")>i另寒;少门氏菌(Sa/wo"e〃a(y//n')、鼠"f另寒沙门氏菌(Sa/mowe〃a妙/n'mwn'画)、痢疾志贺氏菌(5T〖ge〃a(ij^ewten'(2e)、弗氏志贺氏菌(S/z/ge〃"/7ex"en')、索氏志贺氏菌)等。通常，如果使用细菌宿主细胞，则优选非病原菌^^。非病原菌才朱的说明性例子包括但不限于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌(丄"c/^a"'〃M5"a"Wo//n7ws)、瑞士乳才干菌(丄a"o6"c/〃ws/w/ve"'cw5)、^同纟录斗叚单月包菌、/^ew(iomoway附eva/om'/、尸sewtio附o"a5、5求开j红片干菌、i^c/o/(3"erca/^w/Wt^、；果纟工纟工虫累菌，等等。真核细胞的例子包括但不限于真菌细胞。真菌细胞的例子包括但不限于属于以下属的那些细胞曲霉属(j^erg///^)、假丝酵母属(G3"AWa)>金小孑包子属(C7z厂j^os^or/Mw)、CVyc^ococcws、嫌孑包属(T^an'ww)、嫌刀菌属(X7i(yvero/"ces)、7Veo妙/iO(i^m、链孑包霉属(脸wms70ra)、青霉属(Pew/"7/z.wm)、毕赤酵母属(P/c/z/a)、酵母属(5VzccAara，ce^)、木霉属(7Hc/zo(ie，a)和Za"Z/zo;/^〃o附少c^s1(以前一尔为';去夫酵母属(P/zq/^")),真核菌抹的说明性例子包括但不限于构巢曲霉(A^w^〃wmWw/a/w)、黑曲霉(A/erg7'〃ws)>米曲霉(v^erg〃/wsor少zae)、白寸叚丝酵母(Cawd/(i(3a/6/caws)、C7厂j^c^pon'wm/wc/(wowewse、禾^一牛*孑包(^Fwsar/wmgram/wea厂wm)、Fwsar/wm乳酸克鲁维酵母(幻w"era附ycM/acto)、粗糙脉孢菌(7Vewmypora)、安格斯毕赤酵母(i^c/n'flawgw虚)、尸/c/H'a力'w/awAca、尸z'c/u'a^c(iam(3e、月菱醭毕赤酵母(P/c/n'amem/ra皿e/ac/ms")、尸Zc/n.ameAawo//ca、尸/c/n'"0/廳dae、巴斯德毕赤酵母(P/c/"'apaeon's)、皮杰普毕赤酵母(A'c/n'(3/^)》en')、才乐毕赤酵母(A'c/由《werc冊w)、柳毕赤酵母(尸/c/n'asa/z'Cz'")、尸z'c//",/ermc^o/er""s、喜》'每>菜4唐毕赤酵母(尸/c/n'aZre力〃/o/力z7")、才对干毕赤酵母(尸/c/n'a幼》/to)、产二素链霉菌(6^e/7tom少c^am/—cz'e/is1)、金霉素链霉菌(/SV，/owyc^薦re—c/e似)、金色链霉菌(/SV厂e/^o考c^鹿r6w)、Saccara考c^s16a，wws、iSaccaromyc&s16ow/aniz'、酉良酒酵母、杀真菌素4连審菌(5Vreptom少ce51/wwg/c/A'cws)、灰产色链霉菌(<SVrep,om_yce5gr&oc/ramoge"es1)、灰色链霉菌(5V厂e/^ow少cesgr&ews)、浅青紫链霉菌(iSVr一o"ces//v油ws)、撒揽灰链霉菌(o/zVogr^ws)、枝链霉菌(5^ep,o"ce51ra膨ws)、田无链霉菌(iSVr一cw少ces她os/n'e腺'5)、酒红链霉菌(5V厂e/^o，ces)、JHcAo(ie削a厂ee^和vYa"^zo//^〃omycesc/e"(iroWzca"(以前称为尸/a^ar/zcxiozjwa).通常，如果使用真核细胞，则优选非病原林。非病原林的说明性例子包括^旦不限于禾本-牛镰孑包、Fi^an'ww、巴斯德毕赤酵母、Saccwom少ces6ow/aniZ禾口酉良酒酵母。另外，某些菌抹已经被食品和药品管理局指定为GRAS或者通常被视为安全的。这些菌林包括枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌(Z^c/^ac〃/wsac/dop/H./i^)、^j士豸L斥干菌和酉良酒酵母。/尸P途径本发明的宿主细胞包括利用MEV途径、DXP途径或这两种途径来合成IPP及其异构体DMAPP。通常，除植物以外的真核生物只利用MEV类异戊二烯途径将乙酰-CoA转化为IPP,IPP随后被异构化为DMAPP。除了几个例外以外，原核生物利用不依赖于曱羟戊酸的途径或DXP途径通过分支点分开产生IPP和DMAPP。通常，植物利用MEV和DXP两种途径来合成IPP。MfK途径MEV途径的示意图在图1A中显示。通常，该途径包括六步。第一步，两个乙酰辅酶A分子通过酶组合，形成乙酰乙酰-CoA。已知催化该步骤的一种酶是，例如，乙酰-CoA硫解酶(也被称为乙酰-CoA乙酰转移酶)。核苷酸序列的"i兌明性例子包括^旦不限于以下GenBank登录号和所述序列的来源生物(NC—000913REGION:172324131..2325315;大肠杆菌)、(D49362;脱氮副球菌(尸,coc，^""ny^aw))和(L20428;酿酒酵母)。MEV途径的第二步，乙酰乙酰-CoA与另外一个乙酰-CoA分子酶促缩合，生成3-羟基-3-曱基戊二酰-CoA(HMG-CoA)。已知催化该步骤的一种酶是，例如，HMG-CoA合成酶。核苦酸序列的说明性例子包括但不限于(NC001145.互补19061..20536;酿酒酵母)、(X96617;酉良酒酵母)、(X83882;4以南芥(Jn^^fo;^^Aa/^ma))、(AB037907;A""a虚os^oragr&eo/a)、(BT007302;人(T7omosop/e似))和(NC—002758,基因座标签SAV2546,基因ID1122571;金黄色葡萄球菌(/SVop/z少/ococcwsawrews))。第三步，HMG-CoA被酶促转化为曱羟戊酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，HMG-CoA还原酶。核苷酸序列的"i兌明性例子包4舌但不限于(NM—206548;黑腹果蝇(Z>oso//n7flme/a"ogaWw))、(NC—002758，基因座标签SAV2545,基因ID1122570;金黄色葡萄球菌)、(NM—204485;红原鸡(Gfl〃Mga〃w))、(AB015627;链霉菌属的种d一謹yc^平)PCO3988),(AF542543;Mco"a丽a"e服(3to)、(AB037907;《"證鄉oragn',/a)、(AX128213，提供编码截短HMGR的序列；酿酒酵母)和(NC—001145:互补(115734..118898;酉良酒酵母)。第四步，曱羟戊酸被酶促磷酸化，生成甲羟戊酸5-磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，甲羟戊酸激酶。核普酸序列的说明性例子包括但不限于(L77688;拟南芥)和(X55875;酿酒酵母)。第五步，向曱羟戊酸5-磷酸上酶促添加第二个磷酸基团，生成甲羟戊酸5-焦磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，磷酸曱羟戊酸激酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AF429385;巴西三叶胶(//ewa6m^7&似&))、(NM—006556;人)和(NC—001145.互补712315..713670;酿酒酵母)。第六步，曱羟戊酸5-焦磷酸被酶促转化为IPP。已知催化该步骤的一种酶是，例如，曱羟戊酸焦磷酸脱羧酶。核苷酸序列的说明性例18子包括^旦不限于(X9乃57;酿酒酵母)、(AF290095;屎肠^求菌如果IPP被转化为DMAPP,则需要第七步。已知催化该步骤的一种酶是，例如，IPP异构酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(NC—000913，3031087..3031635;大肠杆菌)和(AF082326;雨生红球藻(i/aew^ococc^))。如果需要转化为DMAPP,贝'J才是高的IPP异构酶的表达确保了IPP向DMAPP的转化不是整个途径的限速步骤。DZP途径DXP途径的示意图显示在图1B中。通常，DXP途径包括七个步骤。第一步，丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合，生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苦酸序列的说明性例子包括但不限于(AF035440;大肠杆菌)、(NC_002947,基因座标签PP0527;恶臭4艮单胞菌(尸化wJowo"^pw"t/a)KT2440)、(CP000026,基因座标签SPA2301;肠沙门氏菌尸flra(y//〃；参见ATCC9150)、(NC一007493,基因座标签RSP—0254;球形红杆菌2.4.1)、(NC—005296，基因座标签RPA0952;血色红假单胞菌基因座标签AT5G11380;拟南芥)。第二步，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AB013300;大肠杆菌)、(AF148852;拟南芥)、(NC—002947,基因座标签PP1597;恶臭假单胞菌KT2440)、(AL939124，基因座标签SC05694;天蓝色链霉菌(Ar印tomyc^coe"co/or)A3(2))、(NC—007493,基因座标签RSP—2709;球形红杆菌2.4.1)和(NC—007492，基因座标签Pfl—1107;焚光々1单月包菌(i^ei^cwow^w/Zwor^cem1)PfO-l)。.第三步，2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸被转化为4-二磷酸胞苷酰-(f".teracoccws/aec:wm))和(U49260;人)。PD1293;苛养木杆菌2C-甲基-D-赤藓糖醇。已知催化该步骤的一种酶是，例如，4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AF230736;大肠杆菌)、(NC007493,基因座标签RSP—2835;球形红杆菌2.4.1)、(NC—003(T71,基因座标签AT2G02500;拟南芥)和(NC一002947、基因座标签PP1614;恶臭假单胞菌KT2440)。第四步，4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤藓糖醇被转化为4-二磷酸胞苦酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤藓糖醇激酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AF216300;大肠杆菌)和(NC—007493,基因座标签RSP—1779;球形红杆菌2.4.1)。第五步，4-二磷酸胞普酰-2C-曱基-D-赤藓糖醇-2-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，2C-曱基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AF230738;大肠杆菌)、(NC_007493,基因座标签RSP—6071;球形红杆菌2.4.1)和(NC—002947,基因座标签PP1618;恶臭假单胞菌KT2440)。第六步，2C-曱基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸被转化为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，1-羟基-2-曱基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AY033515;大肠杆菌)、(NC—002947，基因座标签PP0853;恶臭假单胞菌KT2440)和(NC—007493,基因座标签RSP—2982;球形红杆菌2.4.1)。第七步，l-羟基-2-曱基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被转化为IPP或其异构体DMAPP。已知催化该步骤的一种酶是，例如，异戊基/二曱基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AY062212;大肠杆菌)和(NCJ)02947,基因座标签PP0606;恶臭假单胞菌KT2440)。在某些实施方案中，宿主细胞自身的代谢过程和本发明提供的IPP产生相关过程之间的"串扰"(或干扰)最小化或者完全消除。例如，当宿主微生物只依赖DXP途径合成IPP并且引入MEV途径才是供另外的IPP时，串扰被最小化或者完全消除。这种宿主生物将不能改变MEV途径酶的表达或者处理与MEV途径有关的中间体。仅仅或主要依赖于DXP途径的生物体包括，例如，大肠杆菌。在某些实施方案中，宿主细胞通过单独的MEV途径或MEV途径与DXP途径组合产生IPP。在其它实施方案中，宿主的DXP途径在功能上失能，因此宿主细胞只通过异源引入的MEV途径产生IPP。通过使基因表达失能或者灭活一种或多种DXP途径酶的功能，可以使DXP途径在功能上失能。G化合物本发明的Cs化合物通常由IPP或DMAPP衍生。这些化合物也被称为半萜，因为它们来自于一个异戊二烯单元(IPP或DMAPP)。异戊二烯异戊二烯，其结构为在多种植物中发现。异戊二歸通过异戊二烯合成酶由IPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AB198190;银白杨("/z"))和(AJ294819;银白杨)。C^化合物本发明的d。化合物通常来源于由IPP与DMAPP缩合生成的香叶基焦磷酸(GPP)。已知催化该步骤的一种酶是，例如，香叶基焦磷酸合成酶。这些C10化合物也^C称为单辟，因为它们来源于两个异戊二烯单元。图2示意地显示了IPP和DMAPP如何生成GPP，GPP可进一步加工为单辟。香叶基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AF513111;北美冷杉(庙^g認dis))、(AF513112;北美冷杉)、(AF513113;北美冷杉)、(AY534686;金鱼草"滤7r/n,"謹m咖))、(AY534687;金鱼草)、(Y17376;拟南芥)、(AE016877，基因座AP11092;蜡状芽孢杆菌(Sa"7/wcwew);ATCC14579)、(AJ243739;甜橙(C"，W"画^))、(AY534745;C/arAr^6re鄉n')、(AY953508;扭—)、(DQ286930;番(丄戶p簡.画e廳/e幽m))、(AF182828;辣薄荷(脸《*xp—n',a))、(AF182827;辣薄荷)、(MPI249453;辣薄荷)、(PZE431697、基因座CAD24425;Pa厂flcoccwszea乂aw^z/m/"dew匀、(AY866498;-卩度古月黄连(i^,crar/n'加Awrao(3))、(AY351862;葡萄(Wm/era))和(AF203881,基因座AAF12843;运动发酵单胞菌(Z少momowwmo6///^))。GPP然后被转化为多种Cm化合物。do化合物的说明性例子包括但不限于蒈烯蒈烯，其结构为在许多树(特别是松树)的树脂中发现。蒈烯通过蒈烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AF461460,REGION43..1926;欧洲云杉(PZcea))和(AF527416,REGION:78..1871;Sa/WflWewop/i_y//a)。香叶醇香叶醇(也被称为rhodnol),其结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>是玫瑰油和掌玫油的主要成分。它也存在于天竺葵、柠檬和香茅中。香叶醇通过香叶醇合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AJ457070;C/朋a歸聽m麵/p/Z謂)、(AY362553;罗勒(Oc,7mm^m///cmw))、(DQ234300;白苏(尸eW〃a/h^e"'e似)1864抹)、(DQ234299;尸eW〃a1861才朱)、(DQ234298;尸er,〃"">Zodora4935抹)和(DQ088667;尸eh〃a芳樟醇芳樟醇，其结构为在许多花和香料植物如胡荽子中发现。芳樟醇通过芳樟醇合成酶由GPP生成。合适的核普酸序列的说明性例子包括但不限于(AF497485;拟南芥)、(AC002294，基因座AAB71482;拟南芥)、(AY059757;拟南芥)、(NM_104793;拟南芥)、(AF154124;黄花蒿(」故脂:"'"a朋冊))、(AF067603;CYm"A:/a6re，"')、(AF067602;C/fl/^/"c"'w7")、(AF067601;C7a油'a^wvve〃〕、(U58314;C7arh'a^ewen〕、(AY840091;番茄)、(DQ263741;薰衣草(""gwW,/o//a))、(AY083653;柠檬留兰香(Afe"Aac"ra,e))、(AY693647;罗勒)、(XM—463918;水稻(C^zasa"va))、(AP0(M078,基因座BADOMO5;水稻)、(XM—463918、基因座XP—463918;水稻)、(AY917193;Pe函、(AF271259;白苏)、(AY473623;欧洲云杉)、(DQ195274;西特喀云杉(尸,'ceaw7'c/ze腦^))和(AF444798;回回苏(尸wz.〃",wtoceravar.crispa)栽培变种79号)。芋烯')';烯，其结构为23在柑桔类水果和薄荷的外皮中发现。苧烯通过苧烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(+)-苧烯合成酶(AF514287,REGION:47..1867;柠檬(C/環//歸"))和(AY055214，REGION:48..1889;藿香(^g"Wac/zen/gwa))和(-)-苧烯合成酶(DQ195275，REGION:1..1905;西特喀云杉)、(AF006193,REGION:73..1986;北美冷杉)和(MHC4SLSP，REGION:29..1828;留兰香(MeW'/za—ca似))。月桂烯月桂烯，其结构为在多种植物(包括月桂树、马鞭草和由其得名的月桂)的精油中发现。月桂烯通过月桂烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(U87908;北美冷杉)、(AY195609;金鱼草)、(AY195608;金鱼草)、(NM一127982;拟南芥TPSIO)、(NM一113485;拟南芥ATTPS-CIN)、(NM—113483;拟南芥ATTPS-CIN)、(AF271259;白苏)、(AY473626;欧洲云杉)、(AF369919;欧洲云杉)和(AJ304839;罗勒烯a-和P-罗勒烯，其结构分别为在多种植物和水果(包括罗勒)中发现，并且是通过罗勒烯合成酶由GPP生成的。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于:(AY195607;金鱼草)、(AY195609;金鱼草)、(AY195608;金鱼草)、(AK221024;拟南芥)、(NM一U3485;拟南芥ATTPS-CIN)、(NM一113483;拟南芥ATTPS-CIN)、(NM—117775;拟南芥ATTPS03)、(NM—001036574;拟南芥ATTPS03)、(NM—127982;拟南芥TPS10)、(ABU0642;C,./簡騰/z/wCitMTSL4)和(AY575970;百脉才艮(丄o似scorm'cM/a/7^")y.o/om'cM5"变种)。24在松树和桉树中发现。a-蒗烯通过a-蒎烯合成酶由GPP生成。合适的核香酸序列的说明性例子包括但不限于(+)a-蒎烯合成酶(AF543530，REGION:1..1887;火炬*>(乃'm"to^/a))、(-)a-蒎烯合成酶(AF543527,REGION:32..1921;火炬松)和(+)/(-)a-蒎烯合成酶(AGU87909,REGION:6111892;北美冷杉)。P-蒗烯P-蒗烯，其结构为在松树、迷迭香、欧芽、蒔萝、罗勒和玫瑰中发现。(3-蒎烯通过P-蒗烯合成酶由GPP生成。合适的核普酸序列的说明性例子包括但不限于(_)(3-落烯合成酶(AF276072,REGION:1..1749;黄花蒿)和(AF514288,REGION:26..1834;柠檬)。检辟桧辟，其结构为在黑胡椒、胡萝卜子、鼠尾草和茶树中发现。桧萜通过桧萜合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自药用鼠尾草(5Vz/Wao，腦fo)的AF051901，REGION:26..1798。是柑桔类水果的精油的一种成分。在生物化学上，Y-萜品烯通过Y-辟品烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括(来自柠檬的AF514286,REGION:30..1832)和(来自C"ra5w"5/n'w的AB110640,REGION1..1803)。薛品油歸薛品油烯，其结构为在黑醋栗、柏树、番石榴、荔枝、番木瓜、松树和茶中发现。萜品油烯通过辟品油烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自花旗片公(mewz/as1//)的AY906866,REGION:10..1887。C^化合物本发明的C15化合物通常来源于通过两分子IPP与一分子DMAPP缩合生成的法尼基焦磷酸(FPP)。已知催化该步骤的一种酶是，例如，法尼基焦磷酸合成酶。这些ds化合物也被称为倍半萜，因为它们来源于三个异戊二烯单元。图2示意地显示了IPP和DMAPP如何组合生成FPP,其可以进一步加工成倍半辟。法尼基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于:(ATU80605;拟南芥)、(ATHFPS2R;拟南芥)、(AAU36376;黄花蒿)、(AF461050;黄牛(/mm^))、(D00694;大肠杆菌K-12)、(AE009951,基因座AAL95523;具核梭杆菌具核亚种(F^o^cten'wm26"wc/^"冊皿c/e^wm)ATCC25586)、(GFFPPSGEN;藤仓赤霉(GA&"〃a/"乂汰wroZ))、(CP000009,基因座AAW60034;氧化葡糖杆菌(G/wco/^6a"wox少(ia朋)621H)、(AF019892;向日葵(i^/^m^ms))、(HUMFAPS;人(//omo5"甲'ews))、(KLPFPSQCR;乳酸克鲁维酵母)、(LAU15777;白羽扇豆(Zw;/"^a肠))、(LAU20771;白松(丄—脂a肠))、(AF309508;小鼠(AT^mw"w/M))、(NCFPPSGEN;粗糙脉孢菌)、(PAFPS1;银胶菊(~"謂.應a厂炉她m))、(PAFPS2;银胶菊)、(RATFAPS;大鼠(7a故"即n^gz'c^))、(YSCFPP;酿酒酵母)、(D89104;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、(CP000003,基因座AAT87386;酉良脓链球菌(^re;^ococct^;yogew^))、(CP000017,基因座AAZ51849;酿脓链球菌)、(NC—008022,基因座YP—598856;酿脓链J求菌MGAS10270)、(NC一008023，基因座YP—600845;酉良脓链球菌MGAS2096)、(NC一008024，基因座YP一602832;酿脓链球菌MGAS10750)和(MZEFPS;玉米(Zea))。可替代地，FPP也可以通过将IPP添加至GPP生成。编码能够进行该反应的酶的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于(AE000657,基因座AAC06913;y^w/exaeo"ct^VF5)、(NM—202836;拟南芥)、(D84432，基因座BAA12575;枯草杆菌(5腦7/附w磁s))、(U12678基因座AAC28894;大豆十曼生才艮瘤菌(5ra^yr/^加&wmy"/om'cwm)USDA110)、(BACFDPS;Ge(9Zacz7/i"We"厂oAerwo//n7w^)、(NC—002940,基因座NP—873754;杜氏嗜血菌(Haem印/n7wdwcrej^)35000HP)、(L42023，基因座AAC23087;流感嗜血菌(//^mop/H7"s)RdKW20)、(J05262;人)、(YP—395294;丄acto/"c/〃^.vdW23K)、(NC—005823,基因座YP_000273;肾脏钩端螺旋体血清型(丄一o—raz'"/^mga似serorar)Co戸"/agem.5/r:T^ocrwzLl-130)、(AB003187;藤黄樣￡3求菌(Tl^'crococcw5/w"^))、(NC—002946,基因座YP—208768;淋病奈瑟氏球菌(A^ier/aFA1090)、(U00090,基因座AAB91752;根瘤菌属的种(肠.油'簡；)NGR234)、(J05091;酿酒酵母)、(CP000031,基因座AAV93568;^Hte厂po匿—DSS-3)、(AE008481,基因座AAK99890;月市炎链球菌(5Vr一ococcws戸e讓om'ae)R6)和(NC—004556,基因座NP779706;苛养木杆菌(A^/e〃G/a幼Wa^)FPP然后被转化为多种ds化合物。ds化合物的说明性例子包括但不限于紫穗槐二烯紫穗槐二烯，其结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>是^r^脂;y^a"脂产生的青蒿素的前体。紫穗槐二烯通过紫穗槐二烯合成酶由FPP生成。合适的核苷酸序列的一个说明性例子是美国专利7,192,751的SEQIDNO.37。a-法尼烯a-法尼烯，其结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>在包括但不限于蚂蚁杜氏腺的多种生物来源和苹果和梨皮的外层中发现。a-法尼烯通过a-法尼烯合成酶由FPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自西洋梨(尸,wscowmwm'5)t/W"乂ow栽培变种的DQ309034(梨；基因名称AFS1)和来自Ma/t"dome^ca的AY182241(苹果；基因AFS1)。Pechouus等人，尸/""^219(1):84-94(2004)。(GenBank登录号AF051901REGION:26..1798)作为模板。编码P-蒗烯、桧烯和(3-水芽烯合成酶的核苷酸序列的侧翼为前导A777"/限制酶切位点和末端J^a/限制酶切位点，编码芳樟醇和蒈烯合成酶的核苷酸序列的侧翼为前导Wco/限制酶切位点和末端Zma/限制酶切位点，编码芋烯合成酶的核苷酸序列的侧翼为前导Wco/限制酶切位点和末端尸W/限制酶切位点。DNA合成构建体用JTm"/和Zk/(用于f3-蒎烯、桧烯和(3-水芽烯合成酶构建体)、#co/和Xm"/限制酶(用于芳樟醇和蒈烯合成酶构建体)或A7)a/和尸W/限制酶(用于竽烯合成酶构建体)消化完全。反应混合物通过凝胶电泳分离，凝胶提取大约1.7-1.9kbDNA片段，将分离的I)NA片段连接到pTrc99A载体的义w"/限制酶切位点(用于p-蒗烯、桧烯和p-水芽烯合成酶插入片段)、iVco/Xwa/限制酶切位点(用于芳樟醇和蒈烯合成酶插入片段)或1/^/尸^/限制酶切位点(用于宇烯合成酶插入片段)内，产生表达质粒pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS和pTrc99A画SS(质粒图见图6)。实施例6该实施例描述了在本发明中有用的大肠杆菌宿主菌株的产生。如表1所述，通过用一种或多种实施例1至5的表达质粒转化化学感受态大肠杆菌亲本细胞产生宿主菌抹。表1.大肠杆菌宿主菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>在含有如表1详述的抗生素的LuriaBertoni(LB)琼脂上筛选宿主细胞转化体。将单菌落从LB琼脂转移到含有5mLLB液体培养基和抗生素的培养管中。B003、B617、B618、B619、B650、B651、B652和B653宿主细胞转化体在30。C下在250rpm旋转摇床上温育30小时。所有其它宿主细胞转化体在37°C下在250rpm旋转摇床上温育，直到生长达到稳定期。通过用含有0.8%葡萄糖和抗生素的M9-MOPS培养基(M9-MOPS培养基的组成见表2)将细胞连续传代4-5轮，使细胞适应基本培养基。将细胞以由400uL无菌50%甘油和600uL液体培养物组成的1mL储备液等份在冷冻管中贮存在-80。C下。表2-M9-MOPS培养基的组成成分量(每L)Na2HP047H2012.8gKH2P043gNaCl0.5gNH4C1lgMgS042mmolCaC120.1mmol硫胺0.1ugMOPS緩冲液pH7.4100mmol(NH3)6Mo70244H20"ugH3B0425ugCoC127,1ugCuS042.4ugMnC1216ugZnS042.9ugFeS040.28mg实施例7该实施例证实了在不含抗生素的条件下表达质粒在携带包含RK2质粒复制、隔离和保持系统的表达质粒的大肠杆菌宿主菌林中的稳定性。通过将菌抹的储备液等份添加到含有40mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜，建立宿主菌抹B255的种子培养物。在初始OD,为大约0.05时，用种子培养物接种两个各自含有40mLM9-MOPS培养基、2%葡萄糖和0.5%酵母提取物的250mL摇瓶。1号培养物还含有100ug/mL羧苄青霉素和34ug/mL氯霉素。2号培养物不接受任何抗生素。两种培养物都在37°C下在250rpm旋转摇床上温育，直到它们达到大约0.2的OD6。。，此时通过向培养基中加入40uL1MIPTG在宿主细胞中诱导紫穗槐-4,ll-二烯的产生。诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖层，以捕获紫穗槐-4,ll-二烯。在总共72小时的时间内定时采样。2个培养物中宿主菌抹产生紫穂槐-4,11-二烯如实施例10所述通过GC/MS证实。为了评价质粒在两种细胞培养物中的稳定性，在72小时时取每种培养物的样品，在LB琼脂平板(不含抗生素)上划线。在37。C下过夜温育后，将来自每个培养物的50个菌落复制接种到LB琼脂+抗生素(34ug/mL氯霉素、100ug/mL羧千青霉素)平板上和LB琼脂减抗生素(不含抗生素)平板上。在37。C下再过夜温育后，LB琼脂+抗生素和LB琼脂减抗生素平板均发现含有大约50个菌落，表明在培养基中存在和不存在抗生素的情况下，质粒保留均接近100%。实施例8该实施例证实了在大肠杆菌宿主菌4朱中粪肠J求菌HMGR比酿酒酵母tHMGR提高的比活性和稳定性。宿主菌抹B61和B62的种子培养物如下建立将每个菌株的储备液等份加入到含有20mLM9-MOPS培养基、0.8%葡萄糖和如表5所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且使培养物生长至饱和。种子培养物以1:100稀释到500mL烧瓶中的140mL新鲜培养基中，再生长到0055。大约为0.1,此时向每个培养物中加入140uL1MIPTG诱导紫穗槐-4,ll-二烯的产生。在诱导后4、12、20、28、36和49小时，从每个培养物中采样，离心沉淀细胞。细胞沉淀物在干冰上骤冻，然后贝'±存在—80。C。为了进行酶测定，在冰上融化细胞沉淀物，然后用含有蛋白酶抑70制齐'h'昆合物弁3(Calbiochem，SanDiego，CA)、benzonase(20fiLoer5mLbugbuster;Novagen,Madison,WI)和溶菌酶(30ug/mL)的Bugbuster(Novagen,Madison,WI)裂解。酿酒酵母tHMGR的酶活性在50mMTrisHCl(pH7.5)、0.2mMNADPH(Sigma,St,Louis,MO)和0.3mMDL-3-羟基-3-曱基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)钠盐(Sigma，St.Louis,MO)中测定。通过加入细胞裂解液开始测定，才艮据340nM处的吸光度监测NADPH的消失。为了说明NADPH的非特异性消失，从试验样品中获得的结果中减去缺乏HMG-CoA的对照试验中获得的结果。类似地测定粪肠^t菌HMGR的酶活性，不同之处在于测定M^冲液含有100mM磷酸钾緩沖液(pH6.5)、0.4mMNADPH、1.0mMEDTA和100mMKCl。蛋白质测定利用Bradford((1976)J腦/历oc/^m.72:248-254)的方法进行。比活性计算为AnmolNADPH/min/mg蛋白质。如图8所示，与酿酒酵母tHMGR相比，粪肠5求菌HMGR显示较高的比活性和提高的稳定性。实施例9该实施例描述了用细胞干重("DCW")对OD,的校正。为了获得DCW和OD600之间的关系，代表性菌4朱B32在类似于实施例10-14中所述的高细胞密度过程中生长。在整个运行期间采样，测定每个样品的OD6oo和DCW。为了确定DCW,将细胞沉淀并弃去上清液。细胞沉淀物用水洗一次，然后在80。C烤箱中干燥至少3天。将含有细胞沉淀物的试管称重，从称得的重量中减去试管的重量，剩余的重量除以每个样品的初始体积(0.0015L),得到DCW。图9显示在这些实验中测量的DCW和OD60()之间的关系。实施例10该实施例证实了紫穗槐-4,11-二烯在表达金黄色葡萄球菌HMGR和HMGS的大肠杆菌宿主菌4朱中比在表达酿酒酵母tHMGR和HMGS的宿主菌抹中的产量增加。通过将每个菌4朱的储备液等卩分加入到含有25mLM9-MOPS培养基、0.8%葡萄糖和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜，由此建立宿主菌抹B32、B153、B210、B282、B292、B86、B255和B256的种子培养物。在初始OD,大约为0.05时用种子培养物接种单独的含有40mLM9-MOPS培养基、2%葡萄糖和抗生素的250mL摇瓶。培养物在30°C下在250rpm旋转摇床上温育，直到它们达到大约0.2的OD6(K),此时通过向培养基中加入40uL1MIPTG在宿主细胞中诱导紫穗槐-4,ll-二烯的产生。在培养物上覆盖8mL的有机覆盖层(例如，十二烷、油酸曱酯或肉豆蔻酸异丙酯)。有机覆盖层和培养液的样品每天采样一次，共72小时。利用培养液样品测量OD6QQ。通过将5uL有机覆盖层转移到含有500uL掺有作为内标的P-或反式丁香烯的乙酸乙酯的干净玻璃瓶中，测定紫穗槐-4,11-二烯的浓度。有机覆盖物/乙酸乙酯样品在Hewlett-Packard6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上分析，只扫描两种离子分子离子(204m/z)和189m/z离子，^口Martin等人.(2001)B^^c/mo/,5Zoe"g.75:497-503,斤述。为了加快运行时间，改变温度程序和柱基质以达到最佳峰值分辨率和最短的总运行时间。利用DB-XLB柱(获自AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto，CA)和氦载气在GC上分离1|dL样品。用于分析的温度程序如下100°C0.75分钟，以60。C/分钟升高温度至300。C，于300°C保持0.5分钟。解析的样品用监测离子189和204m/z的Hewlett-Packard5973型质量选择检测器分析。以前的质谱证实紫穗槐-4,11-二烯合成酶的产物是紫穗槐-4,11-二烯，使用该GC方案，紫穗槐-4,11-二烯的保留时间为3.7分钟。使用P-或反式丁香烯作为定量的内标。基于纯化的紫穗槐-4,ll-二烯(0.63-10mg/LKJF17-109-3)在加有丁香烯的乙酸乙酯中的定量校准曲线，利用内标与紫穗;隗-4,11-二烯峰面积的比例，计算紫穂槐-4,11-二烯的滴度。如图10A和10B所示，与表达酿酒酵母tHMGR和HMGS的B32、B210、B255、B256和B292抹相比，表达金黄色葡萄球菌HMGR和HMGS的B153和B282菌林产生水平升高的紫穗槐-4,11-二实施例11该实施例证实了在亚最佳温度下生长的大肠杆菌宿主菌抹产生紫穗槐-4，ll-二烯增多。将菌抹的0.5mL储备液等份加入到含有50mLM9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且使培养物在37。C下在250rpm旋转摇床上生长过夜。由此建立宿主菌4朱B32的种子培养在初始OD6。。大约为0.05时用种子培养物4妻种4个250mL摇瓶，每个均含有40mL发酵分批培养基(培养基组成见表6)、100mMMOPS緩冲液pH7.1和抗生素。培养物在30。C或37。C下在250rpm旋转摇床上温育，直到它们达到0.18-0.22的OD6Qo,此时通过向培养基中加入40uL1MIPTG在宿主细胞中诱导紫穗槐-4,11-二烯的产生。在诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物，以捕获紫穗槐-4,11-二烯。每天采样一次，如实施例10所述分析。如图IIA和IIB所示，30°C的发酵不影响细胞生长，但是导致大肠杆菌宿主菌林产生紫穗槐-4,11-二烯的比产率增长接近50%。实施例12该实施例证实了在限制碳源条件下生长的大肠杆菌宿主菌抹产生紫穗槐—4，11-二烯增多。用于发酵运行050608-1和050629-1的宿主菌4朱B32的种子培养物如下建立将0.25uL菌抹储备液等份加入到含有50mLM9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且将培养物在37。C下在250rpm旋转摇床上温育，直到00600达到1-2。用于发酵运行060403-3的宿主菌^朱B32的种子培养物如下建立将菌抹的储备液等份加入到含有50mLM9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且将培养物在37。C下在250rpm旋转摇床上温育过夜。在初始OD6。。约为1时用种子培养物接种含有50mLM9-MOPS培养基和抗生素的250mL摇瓶，培养物再次73在37。C下在250rpm旋转摇床上温育，直到OD6。o达到3-5。对于所有发酵过程，KH2P04,K2HP043H20、EDTA、柠4蒙酸和(NEU)2S04都在生物反应器(2LApplikonBioconsoleADI1025s,具有ADI1010控制器，ApplikonBiotechnology,FosterCity,CA)中力口热灭菌。将其余的培养基成分过滤除菌作为储备溶液，并且通过磁头板注射。表3显示了用于发酵运行050608-1和050629-1的最终的培养基组成。表4显示了用于发酵运行060403-3的最终的培养基组成。运行050608-1的开始体积为0.8L,050629-1的开始体积为1.2L，060403-3的开始体积为1L。所有运行都通过经》兹头板注射50mL种子培养物进行接种。表3-用于发酵运行050608-1和050629-1的发酵培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>表4-用于发酵运行060403-3的发酵培养基的组成成分分批培养基(每L)料液(每L)葡萄糖15g副gKH2P04—K2HP043H2015.7g一柠檬酸1.7g一(NH4)2S042g一MgS047H201.2g12gEDTA8.4mg13mgCoCl26H202.5mg4mgMnCl24H2015mg23.5mgCuCl22H201.5mg2.5mgH3B043mg5mgNa2Mo042H202.5mg4mgZn(CH3COO)22H2013mg16mg水合柠檬酸Fe(III)100mg40mg硫胺HC14.5mg-羧苄青霉素100ug100ug四环素5ug5ug氯霉素34ug34ug对于发酵运行050608-1(过量的碳)，在诱导时开始进料，手动调节进料速度，以提供图12C所示浓度的葡萄糖。对于发酵运行050629-1(碳限制)，根据表5所示的方案将物料运送到发酵罐中。对于发酵运行060403-3(最少的碳)，当初始葡萄糖丸(15g)耗尽并且溶解氧达到峰值时，自动开始进料。可达27.6g/hr的最大值，根据以下方程计算进料速度其中/。是初始葡萄糖被消耗的时间。在达到最大速率时，葡萄糖进料限制为9.5g/hr的速率，并且在剩余的运行中保持恒定在该速率。表5-发酵运行050629-1的进料方案运行时间(小时)葡萄糖进料速度(g/hr)0070.37100.74121.11141.48162.22182.96203.69224.80245.91317.39335.54473.69运行050608-1和050629-1在37°C下进行。生物反应器中的气流设置为1-2L/min;使用氢氧化铵和/或氢氧化钠将pH保持在7;开始的4觉拌为500-600rpm;用止泡剂B(Sigma-Aldich,St.Louis，MO)控制泡沫；利用搅拌级联使溶解氧水平保持高于30%。培养5-6小时后，通过向运行050608-1加入0.8mL1MIPTG,以及向050629-1运行加76入1.2mLIPTG，诱导宿主细胞产生紫穗槐-4,ll-二烯。诱导时，培养温度降至30。C。运行060403-3在30°C下进行。生物反应器中的气流设置为1-2L/min;使用氢氧化铵将pH保持在7。利用搅拌级联和氧富集使溶解氧水平保持高于30%。在OD,接近28时(接种19小时后)，通过加入1mL1MIPTG诱导宿主细胞产生紫穗槐-4,ll-二烯。按照两个不同的方案捕获和提取紫穗槐-4，11-二烯。对于运行050608-1和050629-1，使废气通过含有200mL庚醇的气体洗涤器排出，由此捕获废气中存在的挥发性的紫穗槐-4,11-二歸。然后将庚醇稀释到乙酸乙酯中，直到样品中紫穗槐-4,ll-二烯的浓度介于0.63mg/L和20mg/L之间。对于运行060403-3,在诱导时向发酵罐中加入200mL有机覆盖物在生物反应器中捕获紫穗槐-4，11-二烯。产物浓度如下测定合并25uL培养液加有才几覆盖物和975uL乙腈，在FisherVortexGenie2TM'/'昆合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振摇样品至少3分钟，通过离心从样品中除去细胞，用乙酸乙酯稀释乙腈溶液，直到样品中紫穗槐-4，11-二烯的浓度介于0.63和20mg/L之间。如实施例10所述通过GC/MS分析乙酸乙酯样口C。如图12A和12B所示，发酵运行050608-1(过量的碳)分别导致低最大细胞密度和低紫穗槐-4，ll-二烯产量，这至少部分与乙酸水平的相对快速增长有关(图12D)。相比而言，发酵运行050629-1(碳限制)导致紫穗槐-4,11-二烯产量提高(图12B)和乙酸产生的出现延迟。这些结果符合过量葡萄糖进料导致快速乙酸产生和早期细胞死亡的假说。发酵运行060403-3(最低碳)达到的进一步的葡萄糖限制导致超过100小时的低乙酸产生(图12D),和显著较高的最大细胞密度和紫穗槐-4,ll-二烯产量(图12A和12B)。实施例13该实施例证实了在限制碳源条件下和亚最佳温度下生长的大肠杆菌宿主菌林产生紫穗槐-4,11-二烯增多。宿主菌抹B153的种子培养物如下建立将菌林储备液等份加入到含有50mLM9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且将培养物在37。C下在250rpm旋转摇床上温育，直到OD,达到3.5-4.5。建立2升的生物反应器(BiocontrollerADI1010，具有BioconsoleADI1025,ApplikonBiotechnology,FosterCity，CA),对于运行060403-3，除了菌4朱和诱导时间不同以外，以与实施例12所述相同的方式运4亍。通过向培养基中加入1mL1MIPTG诱导宿主细胞中紫穗斗鬼-4,11-二烯的产生。在图13A所示的发酵运行中，在OD6加接近2时诱导紫穗槐_4,11_二烯合成，而发酵罐仍然含有过量的葡萄糖。在图13B所示的发酵运行中，在OD6。q接近33时诱导紫穗槐-4,ll-二烯合成，这在开始葡萄糖限制进料之后。按照两个不同的方案捕获和提取紫穗槐-4,11-二烯。对于图13A所示的发酵运行，使废气通过含有200mL庚醇的气体洗涤器排出，由此捕获废气中存在的挥发性的紫穗槐-4,ll-二烯。然后用乙酸乙酯稀释庚醇，直到样品中紫穗槐-4,ll-二烯的浓度介于0.63mg/L和20mg/L之间。对于图13B所示的发酵运行，通过在诱导时向发酵罐中加入200mL有机覆盖物捕获紫穗槐-4,ll-二烯。从培养基中提取紫穗槐-4,ll-二烯，包括合并25uL培养液和975uL乙月青,在FisherVortexGenie2TM)'昆合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振摇样品至少3分钟，通过离心从样品中除去细胞，用乙酸乙酯稀释乙腈溶液，直到样品中紫穗槐-4,11-二烯的浓度介于0.63和20mg/L之间。如实施例10所述通过GC/MS分析乙酸乙酯样品。对于图13A所示的发酵运行，紫穗槐-4,11-二烯的总量是通过将废气中存在的量加上培养基中存在的量并用总和除以发酵罐体积而获得的。图13A中所示的发酵达到93的最大OD60()和3.2g/L的最大紫穗槐-4,ll-二烯浓度。相反，图13B中所示的发酵达到245的最大OD600和15g/L的最大紫穂槐-4,11-二烯浓度。对于在两个培养中发现的培养生长和紫穂槐-4,11-二烯产生水平的差异，一种可能的解释是在图13A所示的发酵运行中，在消耗过量的葡萄糖之前诱导紫穗槐-4,ll-二烯产生，并且由于甲羟戊酸途径中间物的毒性水平能够积累，未限制的葡萄糖可获得性导致了细胞死亡。在图13B所示的发酵运行中，葡萄糖输送后发生的诱导受到限制，这阻止了途径中间物的积累，导致更高的细胞密度和紫穗槐-4，11-二烯产生水平。实施例14该实施例证实了在限制碳源和氮源条件下和亚最佳温度下生长的大肠杆菌宿主菌抹产生紫穗槐-4，11-二烯增多。宿主菌抹B86的种子培养物如下建立将菌抹储备液等份加入到含有50mLM9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且将培养物在37°C下在250rpm旋转摇床上温育，次日早晨在OD6oo接近1时亚培养到相同的培养基中，并在37。C和250rpm下再次生长，直到OD6。。为3-5.建立4个2L生物反应器(BiocontrollerADI1010,具有BioconsoleADI1025,ApplikonBiotechnology,FosterCity,CA)，对于运行060403-3，除了限制氮的运行在物料中不含硫酸铵以外，以与实施例12所述相同的方式运行。当开始时的葡萄糖丸(15g)耗尽并且溶解氧达到峰值时，自动启动具有6小时加倍时间的指数葡萄糖进料。最高达30.4g/hr的最大值，根据以下方程计算进料速度=0.12min—1其中p是比生长速率，A)是最初的葡萄糖丸被消耗的时间。在达到最大速率时，葡萄糖进料降为11.4g/hr的速率，并且在剩余的运行中保持恒定在该速率。在发酵运行060710-4、060724-5和060619-5(石友限制和氮限制)中，当氨限制导致培养基中葡萄糖积累时，进一步减少葡萄糖进料。发酵在降低的温度30°C下进行。生物反应器中的气流设置为1vvm;开始的4觉4半为700rpm;用止泡剂B(Sigma-Aldich,St.Louis，MO)控制泡沫；利用搅拌级联(700-1,200rpm)和富氧使溶解氧水平保持在40%。在发酵运行060327-3(碳限制)中，用20%NH4OH使pH保持在7;在发酵运行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)中，开始时使用20%NH4OH,从72小时开始使用2.5NNaOH和10NNH4OH的50/50混合物，使pH保持在7,以进一步限制通往发酵罐的氨的量。在OD6oo接近30时通过向培养基中加入1mL1MIPTG诱导宿主细胞中产生紫穗槐-4,11-二烯。通过在培养基上覆盖10%(v/v)的有机覆盖物捕获紫穗槐-4,11-二烯。然后通过合并25uL培养液和975uL曱醛，在FisherVortexGenie2TM混合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振摇样品至少15分钟，通过离心从样品中除去细胞，并向990uL含有10uL/L反式丁香烯的乙酸乙酯中加入10uL曱醇溶液，提取紫穗槐-4,11-二烯。如实施例10所述通过GC/MS分析样品。图14A-E显示来自发酵运行060327-3(碳限制)的数据。发酵产生16g/L的紫穗槐-4,11-二烯最大浓度(图14A)。宿主菌抹的最大体积生产率大于200mg/L/h(图14B)。宿主菌林的最大比生产率〉2mgZL/h/OD600(图14C)。培养基中氨的浓度在发酵运行开始时大约为30mM，在指数生长期加入料液后上升到大约76mM，运行的其余时间保持高于60mM(图14D)。达到的最大OD6。Q大约为2卯(图14D),对应于116gDCW/L。培养基中葡萄糖的浓度在不到20小时内从15g/L下降至低于1g/L,并且保持低水平(图14E)。乙酸水平在整个发酵过程中都很低(图14E)。图15A-E显示发酵运行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)的数据。发酵产生的紫穗槐-4,ll-二烯最大浓度为约20g/L至30g/L(图15A)。在所有三个发酵运行中，宿主菌4朱的最大体积生产率大于400mg/L/h(图15B)，这显著高于在不限制氮的发酵中获得的最大体积生产率(图14B)。对于所有运行，宿主菌林的最大比生产率>2mg/L/h/OD6(X),并且在整个运行中保持高水平(图15C)。在发酵运行开始时培养基中氨的浓度为大约35mM至50mM，在指数生长过程中加入料液后下降，在运行的其余时间保持低于10mM(图UD)。(氨水平低于发酵运行060327-3(图MD)是由于在料液中缺少氨，并且在用来保持pH的石威中氨减少。发酵运行060710-4和060619-5在运行结束时显示氨浓度峰值，但是峰值出现在紫穗槐-4,11-二烯大量生产之后)。达到的最大OD,为170-220(图15D)，对应于68g-88gDCW/L。培养基中葡萄糖的浓度在不到20小时内/人15g/L下降至低于1g/L,并且保持低水平(图15E)。乙酸水平在整个发酵过程中都很低(图15E)。实施例15该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌抹中通过DXP途径产生紫穗槐-4，ll-二烯。宿主菌林B003、B617、B618和B619的种子培养物如下建立将每种菌抹的储备液等份加入到含有25mLM9-M0PS培养基和如表1所详述的抗生素的单独的125mL摇并瓦中，并且使培养物生长过夜。在初始OD6o。4妻近0.05时用种子培养物4妻种单独的250mL摇瓶，每个摇瓶均含有40mLM9-MOPS培养基、45ug/mL硫胺、微量营养物、1.00E-5mol/LFeS04、0.1MMOPS、0.5%酵母提取物、20g/LD-葡萄糖和抗生素。培养物在30。C下在250rpm潮湿温育摇床上温育，直到OD,达到0.2-0.3，此时通过向培养基中加入40uL1MIPTG在宿主细胞中诱导紫穂槐-4，11-二烯的产生。在诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物，以捕获紫穗槐-4,11-二烯。在不同的时间点采样，提取紫穗槐-4,ll-二烯，并如实施例10所述通过GC/MS分析。每个宿主菌株用2个独立的克隆进行实验，结果取平均值。发现样品之间的偏差小于10%。81如图16所示，含有编码完全工程化的DXP途径酶的核苷酸序列的大肠杆菌宿主菌抹B619产生大约45mg/gDCW的紫穗槐-4,ll-二实施例16该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌林中产生3-甲基-丁-3-烯-l-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇。宿主菌抹B286、B287、B288和B291的种子培养物如下建立用每个菌林的储备液等份在含有如表1详述的抗生素的LB琼脂上划线。每个菌抹挑取三个独立的菌落，每个菌落接种到7mL含有抗生素的LB培养基中。培养物在37°C下在250rpm旋转摇床上生长过夜，直到对数晚期。然后在OD,接近0.05时将培养物接种到含有40mlM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL摇瓶中。培养物在37°C下在250rpm旋转摇床上生长过夜，直到它们达到大约0.2的OD,,此时加入40uL1MIPTG诱导。培养物在30。C下在250rpm旋转摇床上生长72小时。每天1-2次，测量每个培养物的OD6(K),取700uL样品。为了从培养液中提取3-甲基-丁-3-烯-l—醇和3-曱基-丁-2-烯-l-醇，向300uL每个取出的样品中加入600uL乙酸乙酯。然后将样品涡旋振荡15分钟，将400uL上层的乙酸乙酯相转移到干净玻璃瓶中进行分析。样品在Hewlett-Packard6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上分析。用DB-5柱(AgilentTechnologies,Inc.，PaloAlto，CA)和氦载气在GC上分离1uL样品。用于分析的温度程序如下60。C3分钟，以60。C/分钟升高温度至300°C，于300°C保持2分钟。总运行时间为9分钟。解析的样品用Hewlett-Packard5973型质量选4和险测器分析。以前的质谱证实，使用该GC方案，3-曱基-3-丁烯-l-醇和3-曱基-2-丁歸-1—醇的保留时间为2.067分钟。为了集中检测3-甲基-丁-3-烯-l-醇和3-曱基-丁-2-烯-l-醇,采用只监测3-曱基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2—烯-1—醇中的离子56和68的选4,性离子监测方法。82实施例17该实施例描述了酿酒酵母宿主菌林产生紫穗槐-4,11-二烯。宿主菌抹EPY224的产生在Ro等人.(A^wre440:940-943;2006)和PCT专利公开WO2007/005604中描述。宿主菌抹EPY224由表达质粒pRS425ADS通过在YPD培养基中生长而复原(MethodsinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual,2005ed.,ISBN0-87969-728-8)，将单菌落接种到YPD琼脂上，然后将单菌落转印(patching)到CSM-MetHis琼脂和CSM-MetLeu琼脂上。在CSM-MetHis琼脂上生长但在CSM-MetLeu琼脂上不生长的克隆复原(即，已经失去了质粒pRS425ADS)。一个这样的克隆纟皮命名为EPY300。用表达质粒pRS425-ADS-LEU2d转化EPY300,这是一种除了含有LEU2d选择性标记而不是LEU2以外与pRS425-ADS完全相同的质粒(Erhart和Hollenberg(1983)/.^"en'o/.156:625-635),产生宿主菌4朱Y185。在含有2%葡萄糖和除组氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸以外的所有氨基酸的合成确定成分培养基(CSM-葡萄糖；MPBiomedicals,Solon，OH)上筛选Y185宿主细胞转化体。宿主菌林EPY300对于亮氨酸生物合成来说是营养缺陷的(/ew2),但是Y185中的表达质粒pRS425-ADS-LEU2d恢复了亮氨酸原养型(丄五t/2)。将单菌落转印到选择性培养基上(CSM-葡萄糖-组氨酸、亮氨酸和曱硫氨酸)，生长2天。从平板上刮下细胞，并转移到冻存管中的1mL25%(v/v)甘油中。将悬浮液混合，然后贮存在-80。C。宿主菌抹Y185的种子瓶如下建立将菌株的储备液等份加入到含有25mLCSM-葡萄糖、缺少亮氨酸和曱硫氨酸的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。在初始OD6。o接近0.05时用培养物接种含有40mL缺少亮氨酸的合成确定成分培养基并且含有0.2%葡萄糖、1.8%半乳糖和1mM曱硫氨酸的250mL带有档板的摇瓶。培养物在30°C下在200rpm的旋转摇瓶上温育。由于培养基中存在葡萄糖阻止了半乳糖对04丄7启动子的诱导，紫穗槐-4,ll-二烯产生不能被诱导，直到细胞用完了培养基中的葡萄糖并且切换为使用半乳糖作为其主要碳源。在接种时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物，以捕获紫穗槐-4，11-二烯。在72小时时通过将5uL有机溶剂层转移到含有500uL乙酸乙酯的干净玻璃瓶中采样，其中含有已知浓度的(3-或反式丁香烯作为内标。如实施例IO所述，有4几覆盖物/乙酸乙酯样品在Hewlett-Packard6890气相/质语仪(GC/MS)上分析。生长72小时后，发现3个酵母培养物产生60.68、54.48和59.25mg/L的紫穗槐-4，1l-二烯。实施例18该实施例描述了酿酒酵母宿主菌抹产生紫穗槐-4,11-二烯，其中该宿主菌林包含天然曱羟戊酸途径以及处于异源调节控制之下的异源曱羟戊酸途径。酵母抹CEN.PK2-1C(Y002)(MATA;ura3-52;trpl-289;leu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SUC2)和CEN.PK2-ID(Y003)(MATalpha;ura3-52;trpl-289;leu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SUC2)(J.P.vanDijken等人，￡，膨M/cra/>Tec/mo/26,706(Jun1,2000)在标准丰富培养基(YPD)中或在缺少允许筛选整合转化体、质粒保持和减数分裂后代的适当营养物的确定成分合成培养基(.D.Rose,F.Winston,P.Heiter,Me/^ot/s&yeastge"e"c&'a/a^orafo厂少cow厂sem"wwa/.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1990)中培DNA-介导的向酿酒酵母中的转化用如R.H.Schiestl,R.D.Gietz，Cwrr16，339(Dec,1989)所述的醋酸锂法进行。所有基因石皮坏和替换都通过表型分析、菌落聚合酶链反应("PCR")和对扩增的基因组DNA进行测序来证实。质粒pAM489-pAM498用pCR2.1(Invitrogen,CarlsbadCA)构建，并且在图7A-C和表6中显示。HISMX标记序列在M.S.Longtine等人，14，953(Jul,1998)中描述。质粒DNA的扩增在大肠杆菌DH5a抹中进行。表6菌抹5，HR基因#1Crick启动子Watson启动子基因#2遗传标记3，HRpAM柳TRP1t画GRGAUGAUOERG20TRP1TRP1pAM4卯TRP1t画GRCUP1CUP1ERG20TRP1TRP1pAN491URA3t固GRGAUGAIJOERG13URA3URA3pAM492URA3IDI1CUP1CUP1tHMGRURA3URA3pAM493ADE1t画GRGAL1GAIJOIDI1ADE1URA3pAM494ADE1t固GRCUP1CUP1IDI1ADE1ADE1pAM495HIS3ERG12GAL1GAL10ERG10HISMXHIS3pAM496HIS3ERG12CUP1CUP1ERG10HISMXHIS3pAM497LEU2ERG19GAL1GAUERG8HISMXLEU2pAM498LEU2ERG19CUP1CUP1ERG8HISMXLEU2如下制备酿酒酵母抹Y002和Y003用于引入可诱导的曱羟戊酸途径基因。通过使用与天然￡7G9启动子具有45个碱基对的同源性的引物50-56-pwlOO-G(SEQIDNO:44)和50-56-pwl01-G(SEQIDNO:45)PCR扩增pAM328的KanMX-PMET3区(SEQIDNO:43)，将E尺G9启动子替换为酿酒酵母ikffiT3启动子。使用40。/。w/w聚乙二醇3350(Sigma-AldrichStLouis,MO)、100mM醋酸锂(Sigma)、10|iig鲑精DNA(Invitrogen)将10吗得到的PCR产物转化到指数生长的Y002和Y003抹中，在30。C温育30分钟，然后于42。C热休克30分钟(如Schiestl&Gietz,C紅r,16:339(1989)所述)。阳性重组子根据它们在含有0.5|ag/ml遗传霉素(InvitrogenCo，Carlsbad，CA)的丰富培养基上生长的能力进行确定，并且通过诊断PCR证实。得到的克隆命名为Y93(MATA)和Y94(MATa)。然后，将AD五7开i文阅读框替换为光滑念珠菌(C""AWag/Wra^)基因(Cg丄五"2)。使用与开放阅读框(ORF)有50个碱基对侧翼同源性的引物61-67-CPK066-G(SEQIDNO:46)和61-67-CPK067-G(SEQIDNO:47),由85光滑念珠菌基因组DNA(ATCC，Manassas,VA)扩增3.5KBCgZ￡t/2基因组基因座。将10pg得到的PCR产物转化到指数生长的如上所述的Y93和Y94内。为了在不存在亮氨酸添加的条件下生长，选择a^/-抹，并通过诊断PCR证实。得到的克隆命名为Y176(MATA)和Y177(MATa)。为了产生酿酒酵母抹Y188,分别用Pmel(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)消化2|iig来自pAM491(SEQIDNO:48)和pAM495(SEQIDNO:49)的质粒DNA过夜，并且导入指数生长的如上所述的Y176内。为了在缺乏尿嘧啶和组氨酸的培养基中生长，选择阳性重组子。向正确的基因组基因座中的整合通过诊断PCR证实。为了产生酿酒酵母抹Y189,分别用Pmel消化2pg来自pAM489(SEQIDNO:50)和pAM497(SEQIDNO:51)的质粒DNA过夜，并且导入指数生长的如上所述的Y177内。为了在缺乏色氨酸和组氨酸的培养基中生长，选择阳性重组子。向正确的基因组基因座中的整合通过诊断PCR证实。大约1X107来自Y188和Y189的细胞在室温下在YPD培养基平板上混合6小时，以允许繁殖。然后将混合的细胞培养物接种到缺乏组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培养基上，以对二倍体细胞的生长进行选择。用Pmel消化2pg来自pAM493(SEQIDNO:52)的质粒DNA过夜，并且导入指数生长的如上所述的二倍体细胞内。为了在缺乏腺噤呤的培养基中生长，选择阳性重组子。向正确的基因组基因座中的整合通过诊断PCR证实。得到的菌抹被命名为Y238。为了产生含有导入基因的完全互补体的单倍体菌抹，Y238在2%乙酸钾和0.02%棉子糖液体培养基中生成孢子。采用SingerInstrumentsMSM300系列显微操作器(SingerInstrumentCo，LTD.Somerset,UK)分离大约200个遗传四分体(四分体是生成四个孑包子的减数分裂产物)。含有所引入的遗传物质的适当互补体的独立的遗传分离株根据它们在缺乏腺。票呤、组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的条件下生长的能力来确定。所有引入的DNA的整合都通过诊断PCR来证实。得到的菌4朱^皮命名为Y210(MATA)和Y211(MATa)。将2吗来自pAM426的质粒DNA(SEQIDNO:53)导入指数生长的如上所述的Y210和Y211内，该质粒DNA含有从酿酒酵母启动子表达的酿酒酵母密码子优化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)。根据它们在不存在亮氛酸补充的条件下生长的能力筛选含有pAM426质粒的酿酒酵母抹。得到的菌抹命名为Y225(MATA)和Y227(MATa)。将2吗来自pAM322的质粒DNA(SEQIDNO:54)导入指数生长的如上所述的Y210和Y211内，该质粒DNA含有从酿酒酵母表达的酿酒酵母密码子优化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)和细胞色素P450单加氧酶(AMO)和从酿酒酵母启动子表达的细月包色素P450氧化还原酶(CPR)。根据它们在不存在亮氨酸补充的条件下生长的能力筛选含有pAM322质粒的酿酒酵母抹。得到的菌株命名为Y222(MATA)和Y224(MATa)。实施例19该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌4朱中产生a-法尼歸或(3-法尼烯。宿主菌抹B552和B592的种子培养物如下建立将每个菌抹的储备液等份加入到含有25mLM9-MOPS、0.8%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并iU吏培养物生长过在初始OD6oq接近0.05时用种子培养物接种含有40mLM9-MOPS培养基、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL摇瓶。培养物在30。C下在250rpm潮湿温育摇床上温育，直到它们达到大约0.2的OD6()o，此时通过加入40uL1MIPTG在宿主细月包中"i秀导a-法尼烯或(3-法尼烯的产生。诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物，以捕获a-法尼烯。每24小时通过将2-10uL有机溶剂层转移到含有加有作为内标的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的干净玻璃瓶中，采样一次。另外，离心培养物的1mL等份，将细胞沉淀物重悬浮在250uL无菌水中，将细胞悬浮液转移到含有掺有作为内标的反式87丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。整个培养液样品通过涡^走振荡玻璃瓶10分钟用乙酸乙酯萃取，之后将600uL乙酸乙酯萃取物转移到干净的玻璃瓶中。有机覆盖物/乙酸乙酯样品和乙酸乙酯萃取的整个培养液样品在装备有Agilent5975质谱仪的Agilent6890N气相色谱仪(GC/MS)上以全扫描模式(50-500m/z)分析。为了加快运行时间，改变温度程序和柱基质以达到最佳峰值分辨率和最短的总运行时间。利用HP-5MS柱(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA)禾口氦载气分离1iiL才羊品。用于分析的温度程序如下150。C保持3分钟，以25。C/分钟升高温度至200。C,以60。C/分钟升高温度至300。C，于300。C保持1分钟。以前的质谱证实p-法尼烯合成酶的产物是(3-法尼烯，使用该GC方案，卩-法尼烯的保留时间为4.33分钟。通过比较产生的峰面积和纯化p-法尼烯(Sigma-AldrichChemicalCompany,St.Louis,MO)在力口有反式丁香烯的乙酸乙酯中的定量校准曲线，计算法尼烯的滴度。宿主林B592在120小时时产生大约400mg/L的p-法尼烯(平均3个以上的独立克隆)，并且具有约46mg/L/OD6Q。的最大比生产率。宿主菌林B552在120小时时产生大约1.1g/L的P-法尼烯(平均3个以上的独立克隆)，并且具有约96mg/L/OD6。。的最大比生产率(1个代表克隆)。实施例20该实施例描述了大肠杆菌宿主菌株中通过DXP途径产生P-法尼宿主菌抹B650、B651、B652和B653的种子培养物如下建立将每个菌林的储备液等份加入到单独的含有25mLM9-MOPS和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。在初始OD6。。接近0.05时用种子培养物接种含有40mLM9-MOPS基本培养基、45ug/mL硫胺、微量营养物、1.00E-5mol/LFeS〇4、0.1MMOPS、0.5%酵母提取物、20g/LD-葡萄糖和抗生素的单独的250mL摇瓶。培养物在30。C下在潮湿温育摇床上250rpm88温育，直到它们的OD6oo达到0.2-0.3,此时向培养基中加入40uL1MIPTG诱导在宿主细胞中产生P-法尼烯。诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物以捕获p-法尼烯。在不同时间点通过将100uL有机覆盖上层的样品转移到干净试管中采样。离心该试管以分离出任何剩余的细胞或培养基，并将10uL有机覆盖层样品转移到千净玻璃GC瓶中的加入P-或反式丁香烯作为内标的500uL乙酸乙酯中。将混合物涡旋振荡30秒，然后如实施例18所述分析。大肠杆菌宿主菌才朱B653产生大约7mg/gDCW(3-法尼烯。实施例21该实施例描述了酿酒酵母宿主菌抹中a-法尼婦或P-法尼烯的产生。菌林EPY300的产生是通过在丰富培养基中培养而从酿酒酵母EPY224抹中除去表达质粒(Ro等人.(2006)A^wre440:940-943;PCT专利公开WO2007/005604)。然后用表达质粒pRS425-FSA或pR425-FSB转化菌4朱EPY300，分别产生宿主菌林Y166和Y164。宿主细胞转化体在含有2%葡萄糖和除亮氨酸以外的所有氨基酸的合成的确定成分培养基(SM-glu)上筛选。宿主菌林EPY300对于亮氨酸生物合成来说是营养缺陷的(7ew2)，但是表达质粒pRS425-FSA或pRS425-FSB恢复了亮氨酸原养型f^72)。将单菌落转移到含有5mL缺乏亮氨酸的液体SM-glu的培养瓶中。培养物通过在30°C振摇温育，直到生长达到稳定期。细胞以由40050%甘油和600/iL液体培养物组成的lmL冷冻等份，在冻存管中贮存于-80。C。种子培养物如下建立将储备液等份加入到含有25mL缺乏亮氨酸的SM-glu的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。在00600约为0.05时用种子培养物接种含有40mL缺乏亮氨酸的合成的确定成分培养基、0.2%葡萄糖和1.8%半乳糖的250mL带档板的摇瓶中。培养物在30。C下在200rpm的旋转摇床上温育。由于培养基中存在葡萄糖阻止了半乳糖对G"〃启动子的诱导，法尼烯的产生不能被诱导，直到细胞用完了培养基中的葡萄糖并且切换为使用半乳糖作为其主要碳源。在培养物上覆盖8mL的油酸曱酯或豆蔻酸异丙酯。每24小时通过将2-10uL有机溶剂层转移到含有500uL乙酸乙酯的干净玻璃瓶中采样，该乙酸乙酯中掺有已知浓度的(3-或反式丁香烯作为内标。另外，将整个培养液的0.5mL等份加入到含有掺有作为内标的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。整个培养液样品通过涡旋才展荡玻璃瓶10分钟用乙酸乙酯中萃取，之后将600uL乙酸乙酯萃取物转移到干净的玻璃瓶中。宿主4朱Y166在120小时时产生大约9.8mg/L的a-法尼烯(平均超过3个独立克隆)，并且具有大约3mg/L/OD6(K)的最大比生产率(1个代表性克隆)。宿主菌抹Y164在120小时时产生大约56mg/L的P-法尼烯(平均超过3个独立克隆)，并且具有大约20mg/L/OD6。o的最大比生产率(l个代表性克隆)。实施例22该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌抹中产生y-萜品烯、a-蒎烯和薛品油歸。用于产生y-萜品烯(大肠杆菌DH1-Tlr[pMevT，pMevB-Gpps，pAM445])、a-蒗烯(大肠杆菌DH1-Tlr[pMevT,pMevB-Gpps,pAM443或pAM442])或碎品油烯(大肠杆菌DH1-Tlr[pMevT,pMevB-Gpps,pAM444]的宿主菌株的种子培养物通过将每种菌抹的贮备液等份加入到单独的含有25mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所详述的抗生素的125mL摇^f瓦中，并且通过将培养物生长过夜至对数后期而建立。种子培养物用来以大约0.05的初始OD,接种含有40mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL摇瓶。在接种时，培养物上也覆盖有4mL十六烷。培养物在200-250rpm的旋转摇床上30。C温育，直到它们达到大约0.2的OD6QQ,此时添加40uL1MIPTG诱导在宿主细胞中产生目标化合物。每天通过将200uL十六烷层转移到0.6mL微量离心管中采样一次，共96小时。为进行分析，在1.8mLGC瓶中将十六烷层用掺有作为内标的反式丁香烯90的乙酸乙酯1:1或1:10稀释。另外，离心每J分1mL的培养物，将细胞沉淀物重悬浮在250uL无菌水中，并将细胞悬浮液转移到加有作为内标的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。通过涡旋振荡玻璃瓶15分钟将细胞沉淀物在乙酸乙酯中提取，之后将500uL乙酸乙酯提取物转移到干净的玻璃瓶中。十六烷/乙酸乙酯样品和乙酸乙酯提取的细胞沉淀物样品在全扫描模式(50-500m/z)的装备有Agilent5975质谱4义的Agilent6890N气相色谱仪(GC/MS)上分析。为了加快运行时间，改变温度程序和柱基质以达到最佳峰值分辨度和最短的总运行时间。分成1样品(基于样品浓度选4奪1:2至1:50的分配比)，然后用HP-5MS柱(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA)和氦载气分离。用于分析的温度程序如下75。C保持3分析，以20。C/分钟升高温度至115。C,以60。C/分钟升高溫度至300。C，于300。C保持0.5分钟。各种产物，y-萜品烯、oc-蒗烯和碎品油烯，分别在5.4、4.1、5.4和5.9分钟时观察。通过将产生的峰面积与纯化标准在加有反式丁香烯的乙酸乙酯中的定量校准曲线比较，计算滴度。实施例23该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌抹中生产芳樟醇、芋烯、P-蒗烯、P-水芽烯、蒈烯或桧烯。种子培养物如下建立将每种菌林的储备液等份加入到含有25mLM9-MOPS培养基、0.5%酵母提取物、2%葡萄糖和如表1所详述的抗生素的单独的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。在初始OD6。。接近0.05时用种子培养物接种250mL带有档板的摇瓶，每个摇瓶均含有40mLM9-MOPS培养基、0.5%酵母提取物，2%葡萄糖和抗生素。培养物在30°C下在250rpm旋转摇床上温育，直到它们达到大约0.2的OD6。。，此时通过向培养基中加入40uL1MIPTG在宿主细胞中诱导目标化合物的产生。通过溶剂-溶剂萃取从培养基中分离目标化合物，或者如果目标化合物的滴度大到足以使培养基饱和并且形成第二相，则通过沉降和滗析分离目标化合物。序列表SE(JIDNO:1MevT66操纵子AGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAACACGGATGTCGAGGGTATCGACACCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACAAGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGG92ACATGCAGCGAATCTGGTTACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAGAATCGAGGTCGGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAACCGCAAGGTGCGATGCTGGA丁CTGCTGGGSE(JIDNO:2引物4-49mvaASpelSEQIDNO:3引物4-49mvaARXbal5'-GCTTCTAGACTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAATGCG-3'SEQIDNO:4引物HMGS5'SamvaS-SSE(JIDNO:5引物HMGS.3'SanwaS-AS93SEQIDNO:6引物19-25atoBSfil-S5'-GCTAGGCCATCCTGGCCATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTG-3'SEQIDNO:7引物19-25mvaA-AsiSI-AS5'-GCTTGCGATCGCCGGCGGATTTGTCCTACTCAG-3'SE<JIDNO:8引物9-70C5'-CCACCTCGAGATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTG-3'SE(IDNO:9引物26-39B5，-TGGTGGAGCTCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG-3'SECJIDNO:10引物26-39A5'-TTCTTGAGCTCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCG-3'SEQIDNO:11引物4-40nwaEFBamHISEQIDNO:12引物4-40mvaERHindIII5'-AGCTAAGCTTTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC—3，SEQIDNO:13引物4-40mvaSFBglIISEQIDNO:14引物4-39mvaSRBamHI5'-TTTGGATCCTTAGTTTCGATAAGAGCGAACGG—3'SEQIDNO:15用于PCR扩增dxs基因的编码序列的引物67-1A-CSE(JIDNO:1694用于PCR扩增dxs基因的编码序列的引物67-1B-CSEQIDNO:17用于PCR扩增dxr基因的编码序列的引物67-1C-CSEQIDNO:18用于PCR扩增dxr基因的编码序列的引物67-1D-CSE(JIDNO:19用于PCR扩增ispD基因的编码序列的引物67-1E-CSEQIDNO:20用于PCR扩增ispD基因的编码序列的引物67-1F-C5'-TATTGTTCATATGTTATGTAT丁CTCCTGATGGATGGTTCG-3'SEgIDNO:21用于PCR扩增ispE基因的编码序列的引物67-1G-CSEQIDNO:22用于PCR扩增ispE基因的编码序列的引物67-1H-C5'-TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGC'SEQIDNO:23用于PCR扩增ispF基因的编码序列的引物67-2A-C5'-SEQIDNO:24用于PCR扩增ispF基因的编码序列的引物67-2B-C5'-TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC-3'SECIDNO:25用于PCR扩增ispG基因的编码序列的引物67-2C-CSECIDNO:26用于PCR扩增ispG基因的编码序列的引物67-2D-C95SEQIDNO:27用于PCR扩增ispH基因的编码序列的引物67-2E-CSEqIDNO:28用于PCR扩增ispH基因的编码序列的引物67-2F-CSEQIDNO:29用于PCR扩增idi基因的编码序列的引物67-2G-CSEQIDNO:30用于PCR扩增idi基因的编码序列的引物67-2H-CSE(JIDNO:31用于PCR扩增ispA基因的编码序列的引物67-2l-C5'-CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGCAACTCG-3'SEgIDNO:32用于PCR扩增ispA基因的编码序列的引物67-2J-C5'-TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGCSEQIDNO:33用于PCR扩增RK2par基因座的引物9-156A5'-ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG-3'SEQIDNO:34用于PCR扩增RK2par基因座的引物9-156B5'-TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG-3'SE(JIDNO:35引物19-137cml-pAM37-AS5'-GACGTCGATATCTGGCGAAAATG-3'SE(IDNO:36引物19-137cml-pAM37-S5，—TACTAGTGCTTGGATTCTCACC-3'SEQIDNO:37用于PCR扩增编码P-法尼烯合成醉的核苷酸序列的引物5'-CCATGGACACTCTGCCGATCTCTTCCGTAAGC-3'SE(JIDNO:38用于PCR扩增编码P-法尼烯合成酶的核苦酸序列的引物5'-GAGCTCTCATACGACCATAGGG丁GTACG-3'SEQIDNO:39用于PCR扩增编码a-法尼烯合成酶的核苷酸序列的引物5'-CCATGGACCTGGCAGTAGAAATTGC'3'SEQIDNO:40用于PCR扩增编码a-法尼烯合成醉的核苦酸序列的引物5，-GAGCTCTTACATCGGTACCGGCTCCAG-3'SEQIDNO:41atofl(opt),//A/G>S(opt),/nvI^操纵子GATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGGAATCAGACTGGCGGATTTAAAACGGTATCTTCTGAACGTATTATGATAGGTCAAATCGTCTTTGATGACGATTTTAGAGGCCATAACTGCATTTTTAAAAAATGAATCTCCACAAAGCGACATTTTAATGAGTATTSE(JIDNO:42rt'CA8(opt).谓flS(opt).，"操纵子98<formula>formulaseeoriginaldocumentpage99</formula>SEQIDNO:43pAM328-ERG9-KANMX-MET3启动子-ERG9(不包括载体骨架)CAA丁ACCGACT丁ACCATCCTATTTGCITTGCCCTTTTTCTTTTCCACTGCATGGCGGCGTTAGTATCGAAGTGAGTCTTTTCCTTACCCATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCCAACGATATGTACGTAGTGGTATAAGG:TTTTTTAGCTGCAATGCCAATTGTAATAGCTTTCCCATGTTAATTATACTTTATTCTTSE(JIDNO:44SEQIDNO:45CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGATATCACAACTGTTACGASE(JIDNO:46GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCACAGGAAACAGCTATGACCSE(JIDNO:47SE(JIDNO:48pAM491序列(不包括栽体骨架)101AAAGTTCCJGAAAUJCJAt;TA(J'丄'CJ(JUUJ'r(JTmi.(JATAC:(JA'lXJ(J'r丄'A(J丄丄AAAA(JAUirU'r丄'Ci(JA(JUALC;CAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCTTTTGGCAGCCTGCTTmTTAGCTGTCA'rn'AA'l'AUAUTAUTrn丁丄'AA.l'(J.l'AiA'JA(jrA(JUAAAA(J.l'CJAGCCGCTAAAGGCATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGGGTTTAAACSEQIDNO:49pAM492序列(不包括栽体骨架)TAAGAAGAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGGGGCGCTATACGTGCATATGTTCATGTATGTATCTGTATTTAAAACACTTTTGTATTATTTTTCCTCATA104<formula>formulaseeoriginaldocumentpage105</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage106</formula>SE(JIDNO:51pAM497序列(不包括栽体骨架)丁ATTTTAATCAAATCi—iTACiCG]'(JArrJ'AM'ATn.n.i.n.L'UCXTL'UAUA'l.(JA'JL'J'UUJUAUA-i'"UUAAUTJ'UTGCTACn.A(JCiCiUAU丄AAA(Ji(JUUCiC;ATlTU"l'lAA'llJAAUAACjAL'ICj(JAAlAlAACUAJ1AAAAU1SEQIDNO:52pAM493序列(不包括栽体骨架)ATrCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGAT109CCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGTTGATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAGACGATAAGATTAAGGGCGCTATTACTGCGGCGGTGTGGGTTTCACCAAATGATTTGAAAACTATGTTTGCTGACCCAAGTTACAAGTTTACGCCTTGGTTTAAGAAATCC'n'A(JTAATA'lXiTAAA(JTri.ATn-l'UriTAm'AUJ(JtJ(JUAU丄(JA(Ji'CrUAC丄C'riUCJUAUAUAAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGATCGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAAAGGAGAAGGGCATCATCATCGCAGACACTAAATTGTTTAAACSEQIDNO:53pAM426序列AAAGTTTATGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTTAAGCAAGGATTTTCTTAACTTCTTCGGC1TGGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTACiCiCiCiCAUAC:A.ri'ACAA'j;CiU-l'A'rA'l'(J(J'ri'UAAAiA.rATAATCAGGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGATGGGGAAAGAGAAAAGAAAAAAATTGATCTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTATTTCmrCGGGGATCGTGCTCTTCAGTTGTCGGTATGTGTCCTTCATTAGCCCATTTCGCTTCTACCATTAGATTCCTTACCATTTCTGTGTAGGTATCCATGAATAATTTGTAAATAGGCTTCATGTATTCCGGCAACGTGTCTAAGCAGATTGAACTCCAGTTTAGCTAACTTTAGCAGAGTTTTATTATGGGAGTCTTGTTGCTGATAGAAGGGTCAACTGTCTTACTTCCT丁CTTTAGATCGTTTAC丁ATTTGCTCCACACCCTGTTCAACTTGTTTCTCATAAAAGGCCATTGTTTTCTGCAGATCCGGGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGCiTTA(JTCiCX'AA'rnTr(JCT(JT丄IJA'丄AA(JC;Al'AAAACJ(JJlAU'iA1—m丄'A(JATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAG丁GG八ACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGSEQIDNO:54pAM322序列〕TTGATAAATGTATGTAGATTGCGTATATAGTTTCGTCTACCCTATGAACATATTCCATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATGAATTTCATTTATrCTTCGGC114TGGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTAGGGCiCAqAL'ATTACAATUCi'丄.ATA丄CCJ'rrUAAATATATAATAAGAAAGCAACACCTGGCAATTCCTTACCTTCCAATAATTCCAAAGAAGCACCACCACCAGTAGAGATAACAGCCATAAGTAAAGGTCTTGGGATATTCTTTGTTGTTAAATACTCTCTGTTTATGTCTTTCCAA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage116</formula>.ri'AA'lA'rAUJ丄'e;丄'ArA(jrriAAL"丄UftA"UAAjAAAAAAU^HAA(jLTJ!LCACAGGGAATTGCTTATGATATTAACAACCAGTGTGGCCGTTTTAATTGGTTGTGTGGTTGTATTGGTATTTACACAGTCCCTTATCCGATAGGAGTTGTACTCATTTAGAATTTGATATTTCCAATACTGGACTATCGATTCTATTCTTTGGTTGTCGTAATAGAAAAGTTGACTTTATATACGAAGATGAGTTAAACAACTTCGTTATGTTTGGTGAGCTAGCTAAGATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTAGGTTAGAAGAAGGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTrCCATAAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCCGCGTTTACTGATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTATATTCTATA、TTGGTCAGAAATTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAACATGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAACCATTCCATGCGGGGTATCGTATGCTTCCTTCAGCACTACCCTTTAGCTGTTCTATATGCTGCC八CTCCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTTCAATGCTATCATTTCCTTTGATATTCiCJATCATACTAAUAAACCATTAT118权利要求1.一种生产类异戊二烯的方法，包括(a)获得多个宿主细胞，该宿主细胞包含用于生成异戊烯焦磷酸的酶途径，并且其中所有的途径酶都在至少一个异源转录调节物的控制下；和(b)在与提供该宿主细胞的最大比生长速率的条件相比为亚最佳的条件下，在培养基中培养该宿主细胞。2.权利要求l的方法，其中所述途径是曱羟戊酸途径。3.权利要求l的方法，其中所述途径是DXP途径。4.权利要求1的方法，其中所述至少一种异源转录调节物是可诱导的。5.权利要求1的方法，其中所述途径酶在单个转录调节物的控制下。6.权利要求1的方法，其中所述途径酶在多个转录调节物的控制下。7.权利要求l的方法，其中所述宿主细胞是原核生物。8.权利要求7的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。9.权利要求l的方法，其中所述宿主细胞是真核生物。10.权利要求l的方法，其中所述宿主细胞是真菌。11.权利要求9的方法，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。12.权利要求2的方法，其中所述途径包括编码来自具有内源曱羟戊酸途径的原核生物的曱羟戊酸途径酶的核酸序列。13.权利要求12的方法，其中所述原核生物是选自肠球菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属的属的原核生物。14.权利要求13的方法，其中所述核酸序列选自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和曱羟戊酸激酶。15.权利要求12的方法，其中所述核酸序列编码II类HMG还原酶。16.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞在培养基中培养，其中营养物或温度或此两者的水平保持低于提供该宿主细胞的最大比生长速率的水平。17.权利要求1的方法，其中培养基的温度至少比提供最大比生长速率的温度低大约2-20。C。18.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞在至少比提供最大比生长速率的温度低大约5°C的温度下培养。19.权利要求17的方法，其中培养基的温度至少比提供最大比生长速率的温度低大约10。C。20.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源，并且碳源的量将提供最大比生长速率的大约90%或更低。21.权利要求20的方法，其中所述碳源的量将提供最大比生长速率的大约75%或更低。22.权利要求20的方法速率的大约50%或更^^。23.纟又利要求20的方法速率的大约25。/。或更j氐。24.权利要求20的方法速率的大约75%-10%。25.权利要求1的方法其中所述碳源的量将提供最大比生长其中所述碳源的量将提供最大比生长其中所述碳源的量将提供最大比生长其中所述培养基包含氮源，氮源的含量低于提供最大比生长速率的大约90%或更低的量。26.权利要求25的方法，其中所述氮源的量将提供最大比生长速率的大约75%或更低。27.权利要求25的方法，其中所述氮源的量将提供最大比生长速率的大约50%或更低。28.权利要求25的方法，其中所述氮源的量将提供最大比生长速率的大约25%或更{氐。29.权利要求25的方法，其中所述氮源的量将提供最大比生长速率的大约75%-10%。30.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯以大于大约每升培养基IO克的量产生。31.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯以高于大约每克细胞千量50mg的量产生。32.权利要求30或31任一的方法，其中所述类异戊二烯的量在不到大约150小时的时间内产生。33.权利要求30或31任一的方法，其中所述类异戊二烯的量在不到大约96小时的时间内产生。34.权利要求30或31任一的方法，其中所述类异戊二烯的量在不到大约72小时的时间内产生。35.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞在低于提供最大比生长速率的温度的温度下培养，并且其中所述宿主细胞在碳源水平保持低于提供最大比生长速率的水平的培养基中培养。36.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯选自半萜、单辟、二辟、三薛、四莊和多碎。37.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯不是类胡萝卜素。38.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯是C5-C2o类异戊39.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、a-法尼烯、(3-法尼烯、法尼醇、香叶醇、香叶基香叶醇、异戊二烯、芳樟醇、苧烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、薄荷醇、(3-蒗烯、桧薛、y-碎品烯、萜品油烯和瓦4仑烯。40.—种生产类异戊二烯的方法，包括(a)荻得多个宿主细胞，该宿主细胞包含编码来自具有内源曱羟戊酸途径的原核生物的甲羟戊酸途径酶的核酸序列；和(b)在与为宿主细胞提供最大比生长速率的条件相比为亚最佳的条件下，在培养基中培养该宿主细胞。41.一种宿主细胞，当其在含有碳源的培养基中培养时能够以大于每升培养基大约IO克的量产生类异戊二烯。42.—种宿主细胞，当其在含有碳源的培养基中培养时能够以大于每克细胞干重大约50mg的量产生类异戊二烯。43.权利要求40或41任一项的方法，其中所述类异戊二烯的量在不到大约150小时的时间内产生。全文摘要本发明提供通过一种或多种生物合成途径大量生产类异戊二烯的方法。本发明还提供用于实施所述方法的核酸、酶、表达载体和遗传修饰的宿主细胞。本发明还提供从遗传修饰的宿主细胞高产率地生产类异戊二烯的发酵方法。文档编号C12P7/40GK101484584SQ200780019353公开日2009年7月15日申请日期2007年5月25日优先权日2006年5月26日发明者C·J·帕登,J·纽曼,K·K·赖林,N·S·伦宁格,R·里根廷申请人:阿米瑞斯生物技术公司