专利名称：利用金属结合蛋白制备金属纳米颗粒的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用重金属结合蛋白制备来制备重金属纳米颗粒的方法， 特别涉及一种制备重金属结构的方法，该方法包括在含重金属离子的培养基中 对转化有重金属结合蛋白编码基因的微生物进行培养，从而在微生物中产生重 金属结构，并收集所产生的重金属结构以及通过所述方法所产生的重金属结构 的纳米颗粒。
背景技术：
量子点是纳米级的半导体颗粒，当它们被诸如光线等能量所激发时会发光， 并且所发出光的颜色取决于颗粒的尺寸。也就是说，如果颗粒尺寸减小从而减 小了颗粒维数时，电子云密度及其能量发生改变，由此该颗粒的特征会基于其 维数而发生改变。例如，在二维系统中发现量子霍尔效应，但该效应并不出现 在三维系统中。在本文中，术语"减小的维数"严格意义上意指电子被束缚在 比德布罗意波长还小的区域中。零尺寸的量子点不是没有面积的点，而是指具 有小于德布罗意波长的三维尺寸。在量子力学中，所有具备动量的物质颗粒的 波即德布罗意波长会基于物质的不同而有所不同，并且对半导体材料而言大约
为IO腿。
如图1所示，量子点总体上是由核和壳所构成的球形，除图1所示的Zn、 S及Cd之外还包括其它各种重金属。
量子点的制备方法大体上能够分为两种利用诸如激光等光源的平版法； 以及化学合成法。通过化学方法合成量子点的优点在它能够利用比平版相对简 单的系统来生产量子点，但是该方法仍有许多技术问题有待解决以便以高成本 效益方式生产大量的量子点。同样地，与利用现有的批量方法所制备的量子点 相比，利用分子化学技术所制备的量子点具有优良的光学稳定性，并且它们的光学特性能够被控制从而基于纳米材料的尺寸大小、形状及成分发出各种不同 波长的光线。有鉴于此，把基于量子点的纳米材料应用于生物领域成为可能。 这表明基于量子点的纳米材料不仅能够广泛地用于生物传感器还能够用于体
外光学成像的造影剂，这些可能性近来已经为多项研究所证实(Jovin, Nat.Biotechnol" 21:32, 2003; Wu " a/" Nat.Biotechnol" 21:41, 2003; Alivisatos, Nat.Biotechno22: 47， 2004; Gao " a/" Nat.Biotechno.,22:969,2004; Lidke W a/.Nat.Biotechno1, 22:198,2004)。
作为该可能性的典型例子，开发了一种能够体外示踪活细胞信号传导的技 术，该技术的一个例子是HER2/neu途径的方法。这克服了已有有机荧光团的 缺陷，因为荧光团容易失去其光学活性从而无法对连续的细胞变化进行示踪 (Wu et al" Nat. Biotechnol"21:41,2003; Lidke et al.， Nat. Biotechnol"22:198,2004)。 同样地，为了对活细胞体内由erbB/HER受体介导的信号传导进行示踪，给上 皮细胞生长因子(EGF)结合上量子点并通过把它结合到上皮细胞生长因子受 体上(EGFR)从而使其激活。然后对量子点耦合的EGFR耦合物结合入细胞 的过程得到了示踪(Lidke e"/" Nat. Biotechnol.， 22:198, 2004)。该方法使得对 活细胞内的生物过程进行实时观测成为可能。
进一步地，为了克服体内穿透性不足这一缺陷，开发了能够利用近红外范 围内波长的半导体纳米晶体，从而使体内图像收集成为可能(Gao W "/.， Nat. Biotechnol., 22:969,2004)。在该方法中，为了有效地使量子点溶解并且同时有 效地把量子点传递到体内，给量子点(ZnS-包覆CdSe)包被了多嵌段共聚物， 并把单克隆抗体结合到包被共聚物的反应基团上。
此外，为了克服光学成像体内穿透性低这一缺陷，具有近红外波长的量子 点被用于对大鼠腋窝下的前哨淋巴结进行光学成像(Kim et al., Nat. Biotechnol.， 22:93,2004)。该纳米材料表现出不同于通过已有方法获得量子点所 表现出的物理性质，并且由此具备应用于核磁共振成像的前景。
同时，处理环境中重金属的方法大体上包括化学，物理和生物处理方法。 生物处理方法利用了微生物自身的生物机制以及由微生物所引起的机制，包括 生物吸附和生物聚集、氧化和还原、金属有机复合物和不溶性复合物的形成，
6为恢复被重金属污染的环境奠定了重要技术基础(Vails and de Lorenzo, FEMS Microbiol. Rev., 26:327, 2002)。此外，随着分子生物学的发展，近期在开发具 备改善的结合重金属的性质方面的尝试表明对现有生物处理方法进行改善是 可能的。微生物合成重金属结合蛋白以通过生物聚集来去除体内外的重金属， 并且这些蛋白质涉及到胞外金属离子的储存或浓度的调节。
近来，发现名为植物螯合肽的肽可以通过把真菌和植物暴露在重金属中的 方法来产生，所述肽天然就能结合诸如铅、汞及镉等有害元素从而除去这些元 素。植物螯合肽具有(y-Glu-Cys) n-Gly(n^2-7)结构并通过形成肽-金属的结合 来聚集金属离子(Cobbett, Curr.Opin. Plant Biol.3:211,2000)。此外，作为其它 种类的重金属结合蛋白，名为金属硫蛋白的低分子量蛋白质已经得到了很多研 究，并且这些蛋白质具有丰富的半胱氨酸并能结合镉、锌、镍、铜等等(Hamer, Annu. Rev. Biochem.， 55:913， 1986; Wu and Lin， Biosens. Bioelectron., 20:864,2004)。
同时，涉及量子点制备的专利文献包括韩国专利号10-0540801,名为"(利 用金属粉末帝廿备量子点的方法)Method of preparing quantum dots using metal powder";韩国专利号10-0526828,名为"(通过激光照射磁性膜或半导体膜制 备均匀分布量子点的方法)Method of preparing quantum dots having uniform distribution by irradiating magnetic membrane or semiconductor membrane with laser";韩国专利10-0541516，名为"(半导体材料量子点的形成方法)method for forming quantum dots of semiconductor material";以及卓争国专禾U 10-0279739, 名为"(纳米尺寸硅量子点的形成方法)Method for forming nanometer-size silicon dots"。然而，这些方法都是通过金属材料的物理结合来制备量子点的方 法。
本发明人己经注意到量子点成分通过镉(Cd)、硒(Se)、锌(Zn)以及碲 (Te)的常规组合来合成，在此利用生物工程方法对重金属结合蛋白进行了表 达。结果，本发明人发现在体内经济地合成量子点是可能的，并且也利用了上 述生物系统来制备光学性能稳定的量子点，由此完成了本发明。
发明内容
因此本发明的目的在于提供一种具有生产重金属结构能力的重组微生物， 以及制备重金属结构纳米颗粒的方法，该方法包括在含培养基的重金属环境中 培养重组微生物。
本发明的另一目的在于提供改善纳米颗粒的方法，该方法包括把该纳米颗 粒结合至选自下列物质中的至少一种化学物质、配基、金属、DNAs以及蛋白质。
为了实现上述目的，本发明提供了制备重金属结构纳米颗粒的方法，该方
法包括步骤在含重金属离子的培养基中培养微生物，该微生物转化有一个编 码一个或多个重金属结合蛋白的基因，从而在微生物中产生重金属结构；以及
收集所产生的重金属结构。
本发明也提供了重金属结构的纳米颗粒，其通过所述的方法制得，直径
5-120nm，且呈球形。
本发明也提供了具有生产重金属结构能力的重组微生物，该微生物中转化 有含重金属结合蛋白编码基因或其一部分的表达载体。
本发明也提供了一种改善纳米颗粒的方法，该方法包括把纳米颗粒结合到 选自下列物质中的至少一种化学材料、配基、金属、DNAs以及蛋白质。
本发明也提供了改善纳米颗粒的方法，该方法包括把蛋白质结合到纳米颗 粒上，并用可识别标记在该结合蛋白上的材料的蛋白质、结合目标蛋白的经标 记配基或者特异性结合至目标蛋白的抗体来处理该结合蛋白。
本发明也提供了改善纳米颗粒的方法，该方法包括步骤(a)用生物素包 被纳米颗粒的表面；(b)把链霉亲和素包被在包被了生物素的表面上；(c)用
至少一种选择下列组中的化学残基氨基、醛基和羧基对上述链霉亲和素包被 的表面进行修饰；并且(d)用金或银包被该经修饰的表面。
本发明的其它特点和实施方式将在下面的"具体实施方式
"以及所附"权利
要求"中作更清楚地阐述。
图1显示了量子点的结构。
8图2为本发明所述pTJl-AtPCS表达载体的基因谱图。
图3为本发明所述pTJl-PpMT表达载体的基因谱图。
图4表示在含重金属诸如镉、锌及硒离子的培养基中表达植物螯合肽合成 酶的五.co"的荧光扫描图。
图5表示聚集在表达植物螯合肽合成酶的细胞内重金属结构的激光 共聚焦扫描显微图。在图5中，"a": ￡. //细胞显示出与42011111发射光谱相对 应的蓝色荧光；"b，，: Eco/Z细胞显示出700nm发色光谱的黄色荧光;"c，，:实 时图像；以及"d": "a"和"b"的结合图。同样地，图中所有的刻度条都表示5^m。
图6表示在本发明所述表达植物螯合肽合成酶的E.coli中聚集的重金属结 构的电子显微(TEM)图。在图6中，"a":不表达植物螯合肽合成酶的控制
组；b-d:在本发明所述表达植物螯合肽合成酶的￡.^//中聚集的不同放大倍数
的重金属结构TEM图。
图7表示根据本发明所述，当表达植物螯合肽合成酶的五xo/Z在含镉(Cd)、 锌(Zn)及铯(Cs)离子的培养基中进行培养时，聚集在细胞中的重金属结构 的能谱X射线图(EDS)和TEM分析结果。
图8表示根据本发明所述的，当表达植物螯合肽合成酶的￡.co//在含镉 (Cd)、锌(Zn)及硒(Se)离子的培养基中进行培养时，聚集在细胞中的重 金属结构的能谱EDS和TEM分析结果。
图9表示根据本发明所述地，当表达植物螯合肽合成酶的E.coli在含镉 (Cd)、锌(Zn)及碲(Te)离子的培养基中进行培养时，聚集在细胞中的重 金属结构的能谱EDS和TEM分析结果。
具体实施例方式
在本发明中，为了把重金属结合蛋白基因引入五."//并在其中表达，然后 依赖于由￡.^//细胞中的金属结合蛋白的表达所产生的重金属吸附和聚集来合 成量子点，构建了可单独表达或组合表达植物螯合肽合成酶及金属硫蛋白的编 码基因的质粒，所述编码基因编码重金属结合蛋白。然后，用该质粒转化五.co// 并进行培养以在细胞中产生重金属结合蛋白，该细胞随后在含各种重金属离子 的培养基中进行培养，并通过质量分析和荧光分析检测在细胞中所合成的重金属结构是否是量子点。
一方面，本发明涉及制备重金属结构纳米颗粒的方法，该方法包括步骤在 含重金属离子的培养基中培养微生物，该微生物转化有重金属结合蛋白编码基 因，从而在微生物中产生重金属结构；以及收集所产生的重金属结构，通过所
述方法所获得的重金属结构纳米颗粒的直径为5-120nm并呈球形。
在本发明中，该重金属结构优选纳米颗粒，并且该纳米颗粒优选是量子点。 在本发明中，该重金属结合蛋白能够选自下列组中智人(//omo^; /e朋入
拟南芥64raZ)/(iop57.s ^"//"""入观赏烟草(^97-wa附ewto/ 小家鼠^Mws
mMsra/M y> 、酉良？酉酵母 f Sacc/zflrcw_yces cerev/w'fle J 、 粟酒裂歹直酵母 6S"c/n.zo加cc/^ra附7CM/ o附6e入 恶臭假单胞菌r7^ewfifo附ow似/^,/t/fl J及大肠
杆菌(&c/^r/c/2/aco/Z义但本发明并不仅限于此。
在本发明中，植物螯合肽合成酶以及金属硫蛋白被解释为重金属结合蛋白，
但本领域技术人员容易想到其它具备等同或类似于所述蛋白性质的蛋白或肽
也可以用于本发明中。
在另一方面，本发明涉及具备生产重金属结构能力的微生物，该微生物转 化有含重金属结合蛋白编码基因或其一部分的表达载体。
在本发明中，重金属结合蛋白优选植物螯合肽合成酶或金属硫蛋白，并且 所述植物螯合肽合成酶编码基因的一部分优选具有序列号5的碱基序列。
本发明所述方法包括对转化有重组载体的五.co//进行培养的步骤以便在 五.co//细胞中表达重金属结合蛋白，该Eco//可单独或组合表达拟南芥来源的 植物螯合肽合成酶以及恶臭假单胞菌来源的金属硫蛋白。在本发明中，重金属 结合蛋白优选融合于所述蛋白的C末端或者N末端。
用于本发明的重金属的特定实施例包括镉(Cd)、锌(Zn)、硒(Se)、碲 (Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、氯(Cl)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、荥(Hg)、 钴(Co)及铬(Cr)。
重组质粒pTJl-AtPCS，其被用于本发明来转化￡.co//从而表达植物螯合肽 合成酶，包括植物螯合肽合成酶编码基因、青霉素抗性基因以及用于诱导表达 的trc启动子。为了在Exoli中表达植物螯合肽合成酶，植物螯合肽合成酶蛋
10白编码基因通过合成两个来自与拟南芥染色体DNA互补的碱基序列(cDNA) 的引物并利用该引物进行PCR而得以构建。同样地，利用GenBank中所储存 的碱基序列通过PCR法从恶臭假单胞菌的染色体DNA中获取金属硫蛋白的重 金属结合基因，并把该基因进行部分重叠PCR，从而获得植物螯合肽合成酶与 金属硫蛋白的融合基因。氨苄青霉素抗性基因则能够用于菌株的筛选。
从菌株中获得的植物螯合肽合成酶和金属硫蛋白可以单独或组合表达，含 有表达于其中的蛋白的细胞置于含重金属的培养基中培养并对各个生长阶段 以及各种重金属浓度下进行观察。结果，发现重金属被吸收并聚集在细胞中形 成了具有规则排列的量子点。体内量子点经过简单的细胞破碎工序并通过具有 几百纳米孔尺寸的膜滤除破碎的细胞，由此容易地收集到量子点。
本领域技术人员容易想到不仅上述重金属结合蛋白而且包括蛋白、DNAs、 媒介物以及代谢物在内的所有重金属所能结合的胞内成分都能够被应用于本 发明，而并不仅限于本发明的实施例。从较高等的生物体到微生物中都发现有 重金属结合蛋白，该重金属结合蛋白首次发现于马的肾脏细胞中(Margoshe and Vallee,J.Am.Chem.Soc.,79:4813,1957)。目前己知在现有知识中典型的种包括智 人(//o膨e似入拟南芥 64ra6油戸S Afl//""aJ、 观赏烟草 fO"纖ewto/ fo6occo人 小家鼠 ^Mws mwscM/us人酉良酒酵母 (TSacc/zaromyces cerev/sz'ae人 粟酒裂殖酵母"cA/^wa"A"厂頻戸s / 譜6e入 恶臭假单胞菌仍e油腳""s /n/f/JaJ及大肠杆菌(&c/2er/c/z/a co/Z人因此，本领技术人员容易想到各种金 属结合区域都能够用于本发明中。
在本发明中，微生物优选从格兰氏阳性菌、格兰氏阴性菌、放线菌、酵母 菌及真菌中选择。在本发明中，重组微生物优选Eco//。
在本发明中，微生物优选经过如此修饰其不产生使所表达蛋白发生降解 的胞内和胞外蛋白酶，从而有利于重金属结合蛋白的胞外表达。
在本发明中，含重金属结合蛋白编码基因或其一部分的表达载体在该重金 属结合蛋白的部分氨基酸序列中有缺失或位点特异性突变，从而该重金属结合 蛋白有利于重金属结合。
在本发明中，该含重金属结合蛋白编码基因或其片段表达载体优选具有图
112所示酶切图谱的pTJl-AtPCS。同样地，该含有重金属结合蛋白编码基因或其 一部分的表达载体优选具有图3所示酶切图谱的pTJl-PpMT。
根据本发明的重金属结构纳米颗粒容易结合到各种化学材料或生物材料 上，并由此能够用于各种目的的改造。因此，在另一方面，本发明涉及改善纳 米颗粒的方法，其包括把该纳米颗粒结合到选自化学材料、配基、金属、DNAs 及蛋白中的至少一种。
在一个实施例中，根据本发明的纳米颗粒能够通过如下方法得以改善把 蛋白质结合到该纳米颗粒上并用具有识别标记在该结合蛋白上的物质的蛋白 质、结合在该目标蛋白上的标记配体或者特异性结合该目标蛋白的抗体来处理 该结合蛋白。
在另一实施例中，根据本发明的纳米颗粒能够通过包括如下步骤的方法进
行改善(a)用生物素包被纳米颗粒的表面；(b)把链霉亲和素包被在包被了 生物素的表面上；(C)用至少一种选择下列组中的化学残基氨基、醛基和羧 基对上述链霉亲和素包被的表面进行修饰；并且(d)用金或银包被该经修饰
的表面。
实施例
下文参考实施例对本发明作进一步具体描述。然而本领域技术人员容易想 到提供这些实施例是为了对本发明作更充分的描述，本发明的范围并不仅限于 此。
实施例l:重金属结合蛋白表达载体的制备
(1)植物螯合肽合成酶表达载体的制备
为了获得合成植物螯合肽合成酶的AtPCS基因(NCBI登录号AF461180)， 利用由碱基序列号5的序列(拟南芥植物螯合肽合成酶)所代表的拟南芥互 补DNA (cDNA)作为模板并利用序列号1与序列号2的引物进行PCR。 该PCR反应以下列条件进行在94'C下预变性7min;在94 。C下变性lmin， 循环30次；在55'C下退火lmin;在72°C下延伸1 min;然后最终在72。C下延 伸7min。
序列号h 5' -GGAATTCATGGCTATGGCGAGTTTAT-3'序列号2: 5' -CCCAAGCTTATTAATAGGCAGGAGCAGCGAG-3'
利用琼脂糖凝胶电泳法分离由PCR反应所获得的1.5-kb DNA片段，并用 2种限制性酶￡"7 /和///"必//酶切。同时，用两种限制性酶五coi /和历m//// 对具有强诱导tac启动子的pTac99A质粒进行酶切(Park and Lee， J.Bacteriol.,185:5391，2003)。然后，该质粒通过T4 DNA连接酶组装并连接到 DNA片段上，并且该连接的质粒通过电穿孔转化入E.coliDH5a。该转化菌株 在含抗生素氨苄青霉素(100ug/L)的LB平板培养基中进行筛选，由此获得 pTJl-AtPCS重组质粒(图2)。在所制备的重组质粒pTJl-AtPCS中，被用作重 金属结合蛋白的AtPCS基因可通过强诱导tac启动子而得以表达。 (2)金属硫蛋白表达载体的制备 为了获得合成金属硫蛋白的PpMT基因(NCBI登录号NC一002947 REGION:3696753..3696977 )，利用由碱基序列序列号6 (恶臭假单胞菌 KT2440金属硫蛋白)的序列所代表的恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA作 为模板并以序列号3与序列号4的引物进行PCR。该PCR反应以下列条件 进行在94"C下预变性7min;在94 °C下变性lmin，循环30次；在55卩下退 火lmin;在72'C下延伸1 min;然后最终在72。C下延伸7min。 序列号3: 5'-GGAATTCATGAACGATCAACGCTGCGC-3' 序列号4: 5'-AACTGCAGTTAGGGCGAGATCGGATCACT-3' 利用琼脂糖凝胶电泳法分离由PCR反应所获得的230bp DNA片段，并用 2种限制性酶&oi /和尸M酶切。同时，用两种限制性酶&oi I和尸Wl对具有 强诱导tac启动子的pTac99A质粒进行酶切。然后，该质粒通过T4DNA连接 酶组装并连接到DNA片段上，并且该连接的质粒通过电穿孔转化入 DH5a。该转化菌株在含抗生素氨苄青霉素(100ug/L)的LB平板培养基中进 行筛选，由此获得pTJl-PpMT重组质粒(图3)。在所制备的重组质粒pTJl-PpMT中，被用作重金属结合蛋白的PpMT基因可通过强诱导tac启动子而得 以表达。
作为用于表达重组蛋白宿主细胞，诸如E.coli和Bacillus subtillis等能够在 短时间内进行高浓度培养、容易进行基因改造并具备良好生理特性的原核细胞
13已经被广泛地使用。然而，为了解决包括转录后修饰、分泌、三维活性结构以 及蛋白质激活等各种问题，包括单细胞真核细胞、酵母菌(尸/W/" /^Wor&、 Sflcc/wrawyces cerev,w'ae、 //awe朋/fl/ 0/，0/7 /2a等等)、丝状真菌、昆虫纟田胞、 植物细胞、以及哺乳动物细胞在内的从微生物到高等生物体各种生物体近来都 被用作生产蛋白质的宿主细胞。因此，不仅可以利用实施例中所述的￡.^//细 胞而且也可以利用其它宿主细胞，这对本领域技术人员而言是显而易见的。 实施例2:表达重组质粒pTJl-AtPCS的E.coli的荧光分析 通过培养具有强诱导tac启动子的转化重组质粒pTJl-AtPCSd的E.coli DH5a制备了植物螯合肽合成酶。基于该目的，该转化的E.coli被接种于含 100mLLB液体培养基的500mL摇瓶中，其中所述液体培养基中含有重金属离 子(5mMCdCl2.2.5H20、 ZnCl2、 Se02、 TeCI^CsCl2)并且在37。C下培养。 该pTJl-AtPCS重组质粒具有tac启动子，并且加入IPTG来诱导基因表达。为 此，用分光光度计在600nm波长下对培养基进行检测，当其光密度达到0.6时， 加入ImM IPTG以诱导基因表达。诱导表达4小时后，该培养基在4。C下以 6000rpm离心5min。然后，弃上清，用10mLPBS缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀 一次，在4。C下以6000rpm再次离心5min，然后悬浮于10mL PBS缓冲液中。 把100uL悬浮液样品加到96孔板的各孔中并利用荧光光度计(Molecular Devices, USA)在360-700nm的发射光谱下进行分析(图4)。如图4所示， 可以看到在320nm UV激发光下出现强烈的发射光谱峰值约为420nm的荧光信 号。这显示了具有特征性荧光信号的由量子点产生的材料进入到了 Exoli菌株 中。
同样地，用蒸馏水洗涤该表达植物螯合肽合成酶的E.coli菌株，并固定于 聚L-赖氨酸包被的玻片上并用盖玻片覆盖。随后，利用激光共聚焦扫描显微镜 (LSM510， CarlZeiss， Germany)对聚集在细胞内的重金属荧光图像进行分 析(图5)。结果，如图5所示，可以在五.co/Z细胞中观察到图4中对应于约 420nm发射波长的蓝色荧光(a)以及发射波长约为700nm的黄色荧光(b)。 因此，诸如量子点等纳米颗粒的特征性荧光也可在本发明的胞外重金属结构中 观察到。图5中，(c)为实时图，(d)表示图(a)和(b)的合并图。同样地，
14图中所有刻度条都代表5iim。
实施例3:在表达重组质粒pTJl-AtPCS的E.coli所合成的体内重金属的 特征
为了确证通过IPTG所表达的植物螯合肽合成酶是否能在转化有带诱导tac 启动子的重组质粒pTJl-AtPCS的E.coli DH5a中产生重金属结构，用蒸馏水洗 涤实施例2中的E.coli并在冷冻干燥器中于真空状态下干燥一天，并用TEM (TehnaiG2， FEI， the Netherlands)对聚集在细胞中的重金属进行分析。结果， 发现重金属结构的大小和形状是一致的(图6)。此外可以观察到，不出现在未 表达植物螯合肽合成酶的控制组(a)中的重金属结构在表达植物螯合肽合成 酶的Eco/Z中(b)出现了 (图6b、 6c及6d)。
用图中的刻度条可以确定细胞中所合成的重金属颗粒的大小约为 5-120nm，当然本发明的范围并不仅限于该大小而是有可能制备各种大小重金 属颗粒。同样地，可以发现在￡.^//细胞中形成了作为重金属颗粒特异性结构 的格子状结构(图6c及6d)。
进一步地，利用TEM对由表达植物螯合肽合成酶的Eco/Z所吸收的重金属 结构进行EDS分析(Technai G2, FEI, the Netherlands)。在此，对显微图中作 标记部分的重金属结构作了分析，结果，在培养基中所添加成分中清除了镉 (Cd)、锌(Zn)及铯(Cs)(图7)。
图7显示了，根据本发明当具有表达于其中的植物螯合肽合成酶的Eco// 在含镉(Cd)、锌(Zn)及铯(Cs)各5mM的培养基中培养后，聚集在细胞 中的重金属结构的EDS和TEM分析结果。如图7所示，可以发现除了可能出 现于生物体Eco//中的碳(C)和氧(O)、以及通常存在于五.co/Z细胞中的钠 (Na)和氯(Cl)之外，锌(Zn)、镉(Cd)及铯(Cs)为细胞中重金属纳米 颗粒的成分。
图8显示了，根据本发明当具有表达于其中的植物螯合肽合成酶的Eco" 在含镉(Cd)、锌(Zn)及硒(Se)各5mM的培养基中培养后，聚集在细胞 中的重金属结构的EDS和TEM分析结果。特别地，对电子显微图中所标记的 重金属结构的一部分作了分析，结果发现该结构含有锌(Zn)和硒(Se)并且
15硒(Se)的浓度高。
图9显示了，根据本发明当具有表达于其中的植物螯合肽合成酶的￡.co// 在含镉(Cd)、锌(Zn)及碲(Te)各5mM的培养基中培养后，聚集在细胞 中的重金属结构的EDS和TEM分析结果。对电子显微图中所标记的重金属结 构的一部分作了分析，结果，重金属结构含有少量锌(Zn)、硒(Se)及镉(Cd) 并还具有高浓度的碲(Te)。
图7-图9中EDS所用胞外重金属的尺寸约为30-50nm。此外，通过TEM 可观察到具有从约5nm-约120nm各种尺寸的重金属颗粒都出现在细胞中。
工业实用性
如上所述和所证实的，本发明提供一种利用重金属结合蛋白制备的重金属 结构的方法、根据所述方法制备的纳米颗粒作为量子点、以及具有生产重金属 结构能力的重组微生物，该重组微生物转化有含金属结合蛋白编码基因或其一 部分的表达载体。和通过物理结合金属材料来制备量子点的现有方法不同，本 发明所提供的作为纳米颗粒的体内量子点通过体内所表达酶的活性来合成。根 据本发明，能够通过简单的方法以高效且经济的方式来大量生产量子点。此外， 由于该量子点能够解决有机荧光团的缺陷即光学稳定性问题，因而该量子点是 有用的。
虽然已经参考细节特征对本发明作了具体描述，但是该描述仅为优选实施 方式而并非限制本发明的范围，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，通 过所附权利要求及其等同物来限定本发明的实质范围。
权利要求
1. 一种用于制备重金属结构纳米颗粒的方法，该方法包括步骤在含重金属离子的培养基中培养转化有重金属结合蛋白编码基因的微生物，以在该微生物中生产重金属结构；以及收集所产生的重金属结构。
2. 如权利要求1所述的制备重金属结构纳米颗粒的方法，其特征在 于，该重金属结合蛋白为植物螯合肽合成酶或金属硫蛋白。
3. 如权利要求1所述的制备重金属结构纳米颗粒的方法，其特征在 于，该重金属结合蛋白源自下组中的任一种智人、拟南芥、观赏烟草、 小家鼠、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、恶臭假单胞菌及大肠杆菌。
4. 如权利要求1所述的制备重金属结构纳米颗粒的方法，其特征在 于，所述微生物从革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、酵母菌及真 菌种选择。
5. 如权利要求1所述的制备重金属结构纳米颗粒的方法，其特征在 于，所述微生物经过修饰使其不会产生使所表达蛋白发生降解的胞内和 胞外蛋白酶，从而有利于重金属结合蛋白的胞内表达。
6. 如权利要求1所述的制备重金属结构纳米颗粒的方法，其特征在 于，所述微生物为E.C0li。
7. 如权利要求1所述的制备重金属结构纳米颗粒的方法，其特征在于，该重金属为从如下物质中的一种或多种镉、锌、硒、碲、铯、铜、 氯、铅、镍、锰、汞、钴及铬。
8. 如权利要求1所述的制备重金属结构纳米颗粒的方法，其特征在 于，所述重金属结构是纳米颗粒。
9. 如权利要求8所述的制备重金属结构纳米颗粒的方法，其特征在于，所述纳米颗粒是量子点。
10. 重金属纳米颗粒，其特征在于，其通过权利要求8所述方法制得，直径为5-120nm且呈球形。
11. 一种具有产生重金属结构能力的重组微生物，其特征在于，所述 微生物转化有含重金属结合蛋白编码基因或其一部分的表达载体。
12. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物，其特征在于，所述重金属是如下物质中的一种或多种镉、锌、硒、碲、铯、铜、氯、铅、镍、锰、汞、钴及铬。
13. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物， 其特征在于，所述重金属结合蛋白是植物螯合肽合成酶或金属硫蛋白。
14. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物，其特征在于，编码所述植物螯合肽合成酶的基因部分具有序列号5的碱基序列。
15. —种根据权利要求11所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物，其特征在于，所述重金属结合蛋白源自下列组中的任一种智人、拟南芥、观赏烟草、小家鼠、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、恶臭假单胞菌及大肠杆菌。
16. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物，其特征在于，所述微生物从革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、酵 母菌及真菌种选择。
17. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物， 其特征在于，所述微生物是E. co/Z。
18. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物， 其特征在于，所述微生物经过修饰使其不会产生使所表达蛋白发生降解 的胞内和胞外蛋白酶，从而有利于重金属结合蛋白的胞内表达。
19. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物， 其特征在于，所述含有重金属结合蛋白表达基因或其一部分的表达载体 在该重金属结合蛋白的氨基酸序列的一部分有缺失或位点特异性突变，从而该重金属结合蛋白有利于重金属结合。
20. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物， 其特征在于，该含重金属结合蛋白编码基因或其一部分的表达载体为具有图2所示酶切图谱的pTJl-AtPCS 。
21. 根据权利要求ll所述的具有产生重金属结构能力的重组微生物， 其特征在于，该含重金属结合蛋白编码基因或其一部分的表达载体为具 有图3所示酶切图谱的pTJl-PpMT。
22. —种改善纳米颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括把根据权 利要求IO所述纳米颗粒结合到化学材料、配基、金属、DNAs及蛋白中 的至少一种上。
23. —种改善纳米颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括把蛋白结 合到根据权利要求IO所述纳米颗粒上，并用具有识别标记在该结合蛋白 上的物质的蛋白质以及结合在该目标蛋白上的标记配体、或者特异性结 合该目标蛋白的抗体来处理该结合蛋白。
24. —种用于改善纳米颗粒的方法，其特征在于，该方法包括步骤(a) 把生物包被在根据权利要求IO所述纳米颗粒的表面上；(b) 把链霉亲和素包被在上述由生物素包被的表面上；(c) 用氨基、醛及及羰基中的至少一种化学基团对上述链霉亲和素包 被的表面进行修饰;以及(d) 用金或银对上述经修饰的表面进行包被。
全文摘要
本发明涉及一种利用重金属结合蛋白制备重金属纳米颗粒的方法。特别涉及一种用于制备重金属结构的方法，其包括步骤在含重金属离子的培养基中培养转化有重金属结合蛋白编码基因的微生物，从而在该微生物中生产重金属结构；以及收集所产生的重金属结构以及根据所述方法产生的重金属结构的纳米颗粒。与通过物理结合金属材料的方式制备重金属结构现有方法不同，本文所公开的量子点能够通过在细胞表达重金属结合蛋白来生产。此外，由于该量子点能够解决有机荧光团的缺陷即光学稳定性问题，因而该量子点是有用的。
文档编号C12N15/70GK101454454SQ200780019089
公开日2009年6月10日 申请日期2007年4月17日 优先权日2006年5月22日
发明者朴泰正, 李相烨 申请人:韩国科学技术院