利用金属结合蛋白制备金属纳米颗粒的方法
【专利说明】
[0001] 本申请是2007年4月17日递交的中国发明专利申请200780019089. 4的分案申 请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种利用重金属结合蛋白来制备重金属纳米颗粒的方法，特别涉及一 种制备重金属结构体的方法，该方法包括在含重金属离子的培养基中对转化有重金属结合 蛋白编码基因的微生物进行培养，从而在微生物中产生重金属结构，并收集所产生的重金 属结构体以及根据所述方法产生的重金属结构体的纳米颗粒。
【背景技术】
[0003] 量子点是纳米级的半导体颗粒，当它们被诸如光线等能量激发时会发光，并且所 发出光的颜色取决于颗粒的尺寸。也就是说，如果颗粒尺寸减小从而减小了颗粒维数时，电 子云密度及其能量发生改变，由此该颗粒的特征会基于其维数而发生改变。例如，在二维系 统中发现量子霍尔效应，但该效应并不出现在三维系统中。在本文中，术语"减小的维数"严 格意义上意指电子被束缚在比德布罗意波长还小的区域中。零尺寸的量子点不是没有面积 的点，而是指具有小于德布罗意波长的三维尺寸。在量子力学中，所有具备动量的物质颗粒 的波即德布罗意波长会基于物质的不同而有所不同，并且对半导体材料而言大约为l〇nm。
[0004] 如图1所示，量子点总体上是由核和壳所构成的球形，除图1所示的Zn、S及Cd之 外还包括其它各种重金属。
[0005] 量子点的制备方法大体上能够分为两种：利用诸如激光等光源的平版法；以及 化学合成法。通过化学方法合成量子点的优点在它能够利用比平版相对简单的系统来生 产量子点，但是该方法仍有许多技术问题有待解决以便以高成本效益方式生产大量的量 子点。同样地，与利用现有的批量方法所制备的量子点相比，利用分子化学技术所制备的 量子点具有优良的光学稳定性，并且它们的光学特性能够被控制从而基于纳米材料的尺 寸大小、形状及成分发出各种不同波长的光线。有鉴于此，把基于量子点的纳米材料应用 于生物领域成为可能。这表明基于量子点的纳米材料不仅能够广泛地用于生物传感器还 能够用于体外光学成像的造影剂，这些可能性近来已经为多项研究所证实（Jovin，Nat. Biotechnol.，21:32, 2003 ;Wu et al.，Nat. Biotechnol.，21:41，2003 ;Alivisatos，Nat. Biotechno22 :47,2004 ;Gao et al.，Nat.Biotechno.，22:969, 2004 ;Lidke et al. Nat. Biotechnol，22:198, 2004)〇
[0006] 作为该可能性的典型例子，开发了一种能够体外示踪活细胞信号传导的技术， 该技术的一个例子是ffiR2/neu途径的方法。这克服了已有的有机荧光团的缺陷，因 为荧光团容易失去其光学活性从而无法对连续的细胞变化进行示踪（Wu et al.，Nat. Biotechnol.，21:41，2003 ;Lidke et al.，Nat. Biotechnol.，22:198, 2004)。同样地，为了 对活细胞体内由erbB/HER受体介导的信号传导进行示踪，将上皮细胞生长因子（EGF)结合 量子点并通过将它结合到上皮细胞生长因子受体上（EGFR)使其激活。然后对量子点耦合的 EGFR耦合物结合入细胞的过程进行示踪（Lidke et al.，Nat. Biotechnol.，22:198, 2004)。 该方法使得对活细胞内的生物过程进行实时观测成为可能。
[0007] 进一步地，为了克服体内穿透性不足这一缺陷，开发了能够利用近红外 范围内波长的半导体纳米晶体，从而使体内图像收集成为可能（Gao et al.，Nat. Biotechnol.，22:969, 2004)。在该方法中，为了有效地使量子点溶解并且同时有效地将量 子点传递到体内，为量子点（ZnS-包覆CdSe)包被多嵌段共聚物，并把单克隆抗体结合到包 被共聚物的反应基团上。
[0008] 此外，为了克服光学成像体内穿透性低这一缺陷，具有近红外波长的 量子点被用于对大鼠腋窝下的前哨淋巴结进行光学成像（Kim et al.，Nat. Biotechnol.，22:93, 2004)。该纳米材料表现出不同于通过已有方法获得量子点所表现出 的物理性质，并且由此具备应用于核磁共振成像的前景。
[0009] 同时，处理环境中重金属的方法大体上包括化学、物理和生物处理方法。生物处理 方法利用了微生物自身的生物机制以及由微生物引起的机制，包括生物吸附和生物聚集、 氧化和还原、金属有机复合物和不溶性复合物的形成，为恢复被重金属污染的环境奠定了 重要技术基础（Vails and de Lorenzo, FEMS Microbiol. Rev.，26:327, 2002)。此外，随着 分子生物学的发展，近期在开发具备改善的结合重金属性质方面的尝试表明对现有生物处 理方法进行改善是可能的。微生物合成重金属结合蛋白以通过生物聚集来去除体内外的重 金属，并且这些蛋白质涉及到胞外金属离子的储存或浓度的调节。
[0010] 近来，发现名为植物螯合肽的肽可以通过将真菌和植物暴露在重金属中的方法 来产生，所述肽天然就能结合诸如铅、汞及镉等有害元素从而除去这些元素。植物螯合 肽具有（y-Glu-Cys)n-Gly(n = 2-7)结构并通过形成肽-金属的结合来聚集金属离子 (Cobbett, Curr. Opin. Plant Biol. 3:211，2000)。此外，作为其它种类的重金属结合蛋 白，名为金属硫蛋白的低分子量蛋白质已经得到了很多研究，并且这些蛋白质具有丰富的 半月光氨酸并能结合锦、锌、银、铜等等（Hamer, Annu. Rev. Biochem.，55:913, 1986 ;Wu and Lin,Biosens. Bioelectron. , 20:864, 2004) 〇
[0011] 同时，涉及量子点制备的专利文献包括：韩国专利号10-0540801，名为"Method of preparing quantum dots using metal powder"；韩国专利号 10-0526828,名为 "Method of preparing quantum dots having uniform distribution by irradiating magnetic membrane or semiconductor membrane with laser'，;卓?国专利 10-0541516,名为"method for forming quantum dots of semiconductor material"；以及韩国专利 10-0279739,名 为"Method for forming nanometer-size silicon dots"。然而，这些方法都是通过金属 材料的物理结合来制备量子点的方法。
[0012] 本发明人已经注意到量子点成分是通过镉（Cd)、硒（Se)、锌（Zn)以及碲（Te)的 常规组合来合成，在此利用生物工程方法对重金属结合蛋白进行了表达。结果，本发明人发 现在体内经济地合成量子点是可能的，并且也利用了上述生物系统来制备光学性能稳定的 量子点，由此完成了本发明。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于提供一种具有生产重金属结构体能力的重组微生物，以及制备 重金属结构体纳米颗粒的方法，该方法包括在含培养基的重金属环境中培养重组微生物。
[0014] 本发明的另一目的在于提供改善纳米颗粒的方法，该方法包括把该纳米颗粒结合 至选自下列物质中的至少一种：化学物质、配体、金属、DNA以及蛋白质。
[0015] 为了实现上述目的，本发明提供了制备重金属结构体纳米颗粒的方法，该方法包 括步骤：在含重金属离子的培养基中培养微生物，该微生物转化有一个编码一个或多个重 金属结合蛋白的基因，从而在微生物中产生重金属结构体；以及收集所产生的重金属结构 体。
[0016] 本发明也提供了重金属结构体的纳米颗粒，其通过所述的方法制得，直径 5_120nm，且呈球形。
[0017] 本发明也提供了具有生产重金属结构体能力的重组微生物，该微生物中转化有含 重金属结合蛋白编码基因或其一部分的表达载体。
[0018] 本发明也提供了一种改善纳米颗粒的方法，该方法包括将纳米颗粒结合选自下列 物质中的至少一种：化学材料、配体、金属、DNA以及蛋白质。
[0019] 本发明也提供了改善纳米颗粒的方法，该方法包括将蛋白质结合纳米颗粒，并用 可识别标记结合蛋白的材料的蛋白质、结合目标蛋白的经标记配体或者特异性