寡核苷酸探针组以及与其相关的方法和用途的制作方法

专利名称：寡核苷酸探针组以及与其相关的方法和用途的制作方法
寡核苷酸探针组以及与其相关的方法和用途在第一个方面，本发明涉及寡核苷酸探针组，其包含针对感兴趣的基因组目标序列的至少100种不同的单链寡核苷酸探针，其中每个单独的寡核苷酸包含至少一种标记物。在进一步的方面中，本发明涉及所述寡核苷酸探针组用于检测基因组目标序列的用途。 在另一个方面，本发明涉及检测感兴趣的基因组目标序列的方法，所述方法包括在有助于寡核苷酸探针组与感兴趣的基因组目标序列结合的条件下孵育根据本发明的寡核苷酸探针组和样品，并检测寡核苷酸探针与基因组目标序列的结合的步骤。在进一步的方面中，本发明提供了产生针对感兴趣的基因组目标序列的寡核苷酸探针组的方法，所述方法包括设计与感兴趣的基因组目标序列的至少100个不同区域互补的寡核苷酸探针组并合成所述寡核苷酸探针组的步骤。在又进一步的方面中，本发明涉及试剂盒，其包含根据本发明的寡核苷酸探针组，此外，包含选自以下构成的组的进一步的成分去石蜡化试剂、预处理试剂、 洗涤试剂、检测试剂以及产品单。原位杂交(ISH)已经成为研究和临床诊断学的多个领域中不可缺少的工具。原位杂交(ISH)是一种独特的技术，其中组合了分子生物学和组织化学技术来研究组织切片或细胞学制品中的基因表达，因为它容许在特定细胞中DNA和RNA两者的检测和定位。ISH分析在1969年首次描述，涉及标记的核苷酸探针与互补DNA或RNA之间的杂交反应，其杂交物可以取决于所包括的标记物的性质通过多种操作来检测。在70年代后期非放射性的探针标记和检测系统的引入使得原位杂交分析在诊断病理实验室中作为分子诊断工具成为可能。ISH原位地定位基因序列，使得基因表达的产物可视化，同时保持异质组织内的细胞完整性。ISH方法的主要优点是它对异质组织或细胞群体中单独靶点的特异性，以及在细胞或染色体作图中检测低拷贝基因表达方面的敏感性。ISH由多个步骤组成，包括探针制备和标记、组织制备、杂交以及信号检测(综述参见，例如，Jin et al. ,2001, Morphology Methods :Cell and Molecular Biology Techniques :27-46)。Southern和slot印迹是在乳腺癌样本中使用的第一种基于基因的HER-2检测方法。FISH(荧光原位杂交)技术，其是形态学驱动的并且可以被自动化，如IHC，优点是更为客观的记分系统以及存在内建的内部对照，所述内部对照由样本中所有非赘生性细胞中存在的两种HER-2基因信号组成。FISH测试的缺点包括每次测试的高成本、玻片计分所需的较长的时间、荧光显微镜的需求、不能保存玻片用于保存和复查，以及有时在鉴定侵入性的肿瘤细胞方面。迄今为止，FDA批准了两个版本的ISH分析Ventana hform 测试，其仅测量HER-2基因拷贝，以及Abbott-Vysis Pathvysion 测试，其包括双色形式的染色体17 探测，这两种都被描述为是高度相关的(综述参见，例如Ross et al. , 2004, Molecular and Cellular Proteomics 3. 4 :379-398)。产色的原位杂交方法(也称为CISH技术)特征在于免疫组织化学(即，常规显微镜，低成本)和FISH( S卩，内建的内部对照、客观记分、更高效的DNA靶向)两者的优点。 例如，FISH和CISH方法两者在两个机构的实验室所进行的测试中被用于比较浸润性乳腺癌的31个病例，在沈例(84% )中两种方法得到了相同的结果(Gupta et al.，2003， Am. J. Clin. Pathol. ,119 :381-387)。CISH和IHC检测方法可以组合来提供基因拷贝数和蛋白质表达的同时评估，但是这样的方法尚未在临床实践中采用。对于原位杂交可以使用三种原理类型的探针，包括(i)双链互补DNA探针，(ii)单链反义RNA探针，和(iii)合成的寡核苷酸探针。如其他的杂交技术一样，探针设计、合成和标记对于原位杂交在特异性和敏感性方面的成功起到关键的作用。标准标记过程一般包括酶催化方法的应用。双链DNA探针可以由酶切口翻译或随机引物方法来标记，反义RNA 探针通常是合成的，通过体外转录方法来标记。然而，这些方法引起非限定的探针的产生， 其中标记物的位置和数量不是限定的，对于医师是不知道的。此外，酶标记需要更有实验技巧的人来进行这样的标记，因为掺入的标记物的量取决于一系列的变量，包括，例如酶活性和/或存在的标记物的量。最后，对于掺入的标记物的确切位置和量，每种标记可能具有不同的结果，因为标记反应是随机过程的结果。然而，寡核苷酸探针通常通过5'或3'末端标记方法来标记，包括，例如，通过掺入相对少量的标记的核苷酸的探针的“尾化”。由于每个探针的有限数量的标记物，末端标记的探针的敏感性是相当低的。用于原位杂交的寡核苷酸探针的长度大多数是短的，与更长的cDNA或反义RNA探针相比通常敏感较低。因此，迄今为止，寡核苷酸探针大多数被用于检测高丰度和/或重复的基因靶点，或用于脑部特定基因家族表达的作图(参见，例如Wisden and Morris, 2002, International Review of Neurobiology, Vol. 47，Chapter 1)。利用寡核苷酸探针通过原位杂交操作来分析的基因靶点进一步包括，例如，丰富的mRNA转录产物，例如β -肌动蛋白(Perlette and Tan, 2001, Anal Chem 73 :5M4_5550)，在具有分泌颗粒的神经内分泌细胞和肿瘤中丰富地表达的基因的mRNA转录产物(Lloyd，R.，1995，Diagnostic Molecular Pathology 4(2) :143-151)，禾口核糖体 rRNA(Behrens et al. ,2004, Systematic and Applied Microbiology,27, 565-572 ；Silverman and Kool,2007, Advances in Clinical Chemistry, Vol. 43 :79-115)，以及高度重复的目标序列，例如，人染色体的着丝粒区域(参见,例如 W096/00234)。然而，通过杂交方法的常规的和高通量的应用，寡核苷酸探针用于检测和/或分析仅以低程度存在的基因，包括例如低丰度的肿瘤标志物基因的用途将是现代医学、诊断和癌症治疗中特别感兴趣的，因为寡核苷酸探针可以高量和低成本容易地合成。因而，需要利用寡核苷酸探针的敏感的检测方法。因此，本发明的一个目的是提供用于检测基因，特别是需要敏感检测方法的低丰度目标序列的可选择的方法。在本发明的上下文中，已经发现的是，利用与目标分子的不同区域互补的至少100 种不同的单链寡核苷酸探针的“混合物(cocktail)，，的方法特别适合于检测低丰度基因。 特别地，已经发现的是这样的混合物特别适合于检测处于降低时段(参见附

图1)的感兴趣的基因组目标序列，与本领域已知的和描述的检测方法(参见，例如Weiss et al. ,1990, American Journal of Pathology, Vol. 137, No. 4 :979-988 ；Lloyd, R. ,1995, Diagnostic Molecular Pathology 4(2) :143-151)相比需要降低量的探针(参见附图2)，以及具有更高特异性(参见附图1-3)。因而，明显的是这样的方法优于本领域已知的和描述的那些，在于它们是更快、更便宜、更敏感和/或更为可预测的。因而，在第一个发明中，本发明提供了寡核苷酸探针组，其包含针对感兴趣的基因组目标序列的至少100种不同的单链寡核苷酸探针，其中每一个单独的寡核苷酸探针包含至少一个标记物。单链寡核苷酸探针对于检测感兴趣的基因组序列是特别有益的，因为(i)不需要加热步骤以确保二级结构的解体，以及(ii)省略了探针的互补链的再退火。如在此使用的术语“寡核苷酸探针”一般是指被合成以匹配感兴趣的核苷酸序列的任何类型的核苷酸分子，其可以用于在分子水平上检测、分析和/或显现所述核苷酸序列。根据本发明的寡核苷酸探针一般是指一种分子，其包含(i)几个核苷酸，一般地至少10 个、更优选的至少15个，以及最优选的至少20个核苷酸，和(ii)至少一个标记物。任选的， 寡核苷酸探针还可以包含任何适合的非核苷酸单位和/或连接试剂，所述连接试剂适合于掺入标记物。对技术人员明显的是，寡核苷酸探针具有适合于提供所需的特异性的长度。 一般地，探针可以是DNA寡核苷酸探针或RNA寡核苷酸探针，优选DNA寡核苷酸探针。相应的，核苷酸包括由核碱基(即，含氮碱基)、五碳糖以及磷酸基组成的所有类型的结构，所述五碳糖可以是核糖、2'-脱氧核糖或其任何衍生物。核碱基和糖构成了称为核苷的单位。 磷酸基可以与2、3或5-碳形成键，特别是糖的3和5碳。在本发明的上下文中，术语“核苷酸”同样是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核糖核苷酸含有核糖作为糖部分，而脱氧核糖核苷酸含有脱氧核糖作为糖部分。核苷酸可以含有嘌呤或者嘧啶碱基。因而，本发明的寡核苷酸探针可以由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、或由其任何组合构成，并且可以进一步包括一种或更多种修饰的核苷酸。任选的，寡核苷酸探针可以进一步仅包含修饰的核苷酸。 修饰的核苷酸的核糖-或脱氧形式可以例如包括，但不限于，5-丙炔基-尿嘧啶核苷、5-丙炔基-胞嘧啶核苷、5-甲基-胞嘧啶核苷、2-氨基-腺苷、4-硫尿核苷、5-碘尿核苷、N6-甲基-腺苷、5-氟尿核苷、肌苷、7-丙炔基-8-氮杂-7-脱氮杂嘌呤和7-卤素-8-氮杂-7-脱氮杂嘌呤核苷。本发明的寡核苷酸探针可以进一步包含主干修饰，例如，如2' -0-甲基 (2 ‘ -OMe) RNA,2 ‘-氟 O ‘ -F) DNA、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。2 ‘ -OMe RNA 是特别适合的主干修饰，因为它比DNA更强烈地杂交，并且不同于天然的RNA，是对RNases和DNases 极其稳定的。LNA是一类构象限制的寡核苷酸类似物，其中核糖核苷与2' -0和4' -C之间的亚甲基连接。它在碱基对和双螺旋形成方面类似于天然核酸，但是LNA双螺旋与相应的 DNA或RNA双螺旋相比是更为热稳定的(Silverman and Kool，2007，Advances in Clinical Chemistry, Vol. 43 :79-115)。任选地，本发明的寡核苷酸探针可以进一步包含在磷酸主干上的一个或更多个修饰，例如，硫代磷酸酯或膦酸甲酯，其提高对核酸酶的稳定性。根据本发明的寡核苷酸探针组是指至少100种不同的寡核苷酸的库。这些寡核苷酸可以相互在一个或更多个核苷酸位置上不同，或可以在它们的完整序列上相互不同。 优选地，本发明的寡核苷酸探针组包含超过100种不同的寡核苷酸，特别地至少150、200、 250、300、350、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、或 1000 种不同的寡核苷酸。更优选的，所述寡核苷酸探针组包含至少1000种不同的寡核苷酸探针，特别是至少 1500、2000、2500、3000、；3500、4000、4500 或 5000 种不同的寡核苷酸探针。因而，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组包含至少200、300或400种不同的寡核苷酸探针，特别是至少500种不同的寡核苷酸探针，更特别地至少1000种不同的寡核苷酸探针。随着不同的寡核苷酸探针的数目的提高，检测方法的敏感性和特异性提高(参见附图3)。
此外，根据本发明的寡核苷酸探针组进一步特征在于每个寡核苷酸探针具有限定的长度。这种长度由限定数量的核苷酸构成，任选地进一步包括限定数量的非核苷酸连接试剂。具有限定长度的寡核苷酸探针的产生提供了相比本领域已知的方法的优点，本领域已知的方法采用了片段化步骤，因而导致随机长度分布的寡核苷酸探针产生。优选地，本发明的寡核苷酸探针组特征在于每个寡核苷酸探针具有20到200个核苷酸、或40到175个核苷酸、或60到150个核苷酸、或80到120个核苷酸的限定的长度。然而，对技术人员明显的是，上述上限和下限还可以组合以实现不同的范围。因而，寡核苷酸探针还可以具有20 到150、60到120、或80到150、或30到180的长度。本发明的寡核苷酸探针组可以包括具有全部相同长度的寡核苷酸探针，或如果认为合适，可以包含不同长度的寡核苷酸探针。因而，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组特征在于每个寡核苷酸探针具有20到200个核苷酸、优选的40到175个核苷酸、更优选的60到150个核苷酸、特别是80个到120个核苷酸的长度。具有约80到120个核苷酸的长度的寡核苷酸探针已经被认为特别适合于检测根据本发明的基因组目标序列。作为获得本发明的上下文中描述的结果的先决条件，寡核苷酸探针组必需进一步包含最小总量的掺入的标记物。也就是说，寡核苷酸探针的长度越短，每个寡核苷酸越多的标记物必需被掺入、附着、轭合或连接到每个单独的分子，或者应当使用更多的寡核苷酸探针以提供一组寡核苷酸，其适合于在其中描述的条件下检测感兴趣的基因组目标序列。为了控制标记物的掺入，本发明的寡核苷酸探针优选地通过化学合成来产生。化学合成相对于应用酶学方法的优点是快速的和成本效率的探针产生过程，以及精确片段长度、序列、标记物的数量和位置的控制。例如，在本发明的上下文中，发现的是，如果寡核苷酸探针包含在存在约80到90个核苷酸的情况下的至少五个标记物是特别有利的。优选地，寡核苷酸探针包含在存在约80到90个核苷酸的情况下至少八个或更多个标记物。根据本发明的包含限定数量的掺入标记物的寡核苷酸在例如附图5中说明了。因而，在另一个优选的实施方式中，寡核苷酸探针组的特征在于每个寡核苷酸探针包含至少两个或三个标记物，特别是至少五个标记物，更特别地至少10个标记物，最特别地至少15个标记物。如在本发明的上下文中找到的，随着标记物掺入的提高，寡核苷酸探针显示了提高的敏感性。然而，必需小心的是，然而，过多标记物的存在不能影响成功的杂交，因而不影响功能性。因此，发现每寡核苷酸存在5到15个标记物(取决于单个分子的长度)建立了最佳的结果。最优选的，本发明的寡核苷酸探针组特征在于(i)每个寡核苷酸探针具有20到 200个核苷酸、优选的40到175个核苷酸、更优选的60到150个核苷酸、特别是80个到150 个核苷酸的长度，以及(ii)每个寡核苷酸探针包含至少两个或三个标记物，特别是至少五个标记物，更特别地至少10个标记物，最特别地至少15个标记物。特别地，每个寡核苷酸探针包含至少五个标记物，并具有20到200个核苷酸、优选的40到175个核苷酸、更优选的60到150个核苷酸、特别是80个到150个核苷酸的长度。更优选的，每个寡核苷酸探针包含至少10个标记物，并具有20到200个核苷酸、 优选的40到175个核苷酸、更优选的60到150个核苷酸、特别是80个到150个核苷酸的长度。更加优选的，每个寡核苷酸探针包含至少15个标记物，并具有20到200个核苷酸、优选的40到175个核苷酸、更加优选的60到150个核苷酸、特别是80个到150个核苷
酸的长度。做为选择，每个寡核苷酸探针具有60到150个核苷酸的长度，并包含至少两个或三个标记物，特别地至少五个标记物，更特别地至少10个标记物，最特别地至少15个标记物。更优选的，每个寡核苷酸探针具有80到150个核苷酸的长度，并包含至少两个或三个标记物，特别地至少五个标记物，更特别地至少10个标记物，最特别地至少15个标记物。在本发明的上下文中提及的术语“针对”一般是指本发明的寡核苷酸探针可以通过互补碱基对的方式结合感兴趣的目标序列。互补碱基对是在相互互补的两个核苷酸分子(任选的包括修饰)之间形成的。在本发明的上下文中，在寡核苷酸探针和目标序列之间形成的互补碱基对可以包括所有类型的典型的或非典型的碱基对，包括但不限于， Watson-Crick A-U、Wat son-Crick A-T、Wat son-Crick G-C、G-U Wobble 碱基对、A-U 和 A-C 反向Hoogsteen碱基对，或嘌呤-嘌呤以及嘧啶-嘧啶碱基对，例如，剪切的G-A碱基对或 G-A亚氨基碱基对。如在此使用的术语“基因组目标序列”一般是指真核生物体的基因组的特定区域。 在本发明的上下文中，基因组目标序列优选地是指人类基因组的限定的区域。单倍体人类基因组由总数超过三十亿个DNA碱基对构成，含有估计约30，000个蛋白质编码序列。也就是说，仅约1.5%的基因组编码蛋白质，而其余部分含有数千RNA基因，例如，编码tRNA、核糖体RNA、micr0RNA、或其他非编码RNA、调节序列、内含子或重复序列的基因。人类基因组的重复序列包括，但不限于，着丝点、端粒、串联重复，例如，卫星DNA、迷你卫星DNA、微卫星 DNA以及散布的重复，例如SINE (短散布核元件)和LINE (长散布核元件)。因而，本发明的基因组目标序列可以包括，但不限于，特定基因的序列或其部分，可以进一步包括调节序列、非编码序列、重复或非重复序列。优选地，本发明的基因组目标序列是指包含特定基因的限定的基因座。一般地，基因是跨越生物体的基因组不规则地分布的，即，跨越不同的染色体。也就是说，本发明的基因组目标序列可以指可变长度的区域，和/或指一种区域，其散布于一个染色体的不同区域，和/或甚至散布于不同染色体。特别地，基因组目标序列可以指一个或更多个单独的区域。优选地，本发明的基因组目标序列是指基因座，即，是指基因所位于的染色体中的特定区域。本发明的基因组目标序列可以包括可变大小的区域，包括但不限于，具有最多达1MB的大小的区域。然而，要理解的是，寡核苷酸探针针对不同的目标序列，S卩，针对本发明的基因组目标序列内的不同区域。也就是说，当包含至少100种不同的单个寡核苷酸探针的寡核苷酸探针组总起来针对基因组目标序列时，所述基因组目标序列优选地包含特定基因座，每个单独的寡核苷酸探针针对位于这个区域之内的特定子序列。如在此使用的术语“标记物”一般是指任何类型的物质或试剂，其可以被掺入和/ 或附着于本发明的寡核苷酸探针，并且当寡核苷酸探针结合它的目标序列时，其可以用于显现、检测、分析和/或定量寡核苷酸探针。根据本发明的标记物可包括但不限于，放射性同位素，例如严硫(35 J2磷(32P)、33磷(33P)、3H或WC，可通过荧光分析的方式被检测或显现的任何荧光分子或荧光团，例如，荧光素染料，包括但不限于，羧基荧光素(FAM)、6_羧基-4'，5' -二氯-2' 7' -二甲氧基荧光素(JOE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、四氯荧光素 (TET)和六氯荧光素，罗丹明染料，例如，羧基-X-罗丹明(ROX)、Texas Red和四甲基罗丹明(TAMRA)，花青染料，例如吡喃锚,花青染料、OT548、Quasar 570或Cy3、Cy5、Alexa 568，等等。荧光标记物的选择一般由它的光谱性质和成像设备的可用性来决定。荧光标记物可从各个供应商商业上获得，包括，例如，Invitrogen (USA)。本发明的标记物还可以是半抗原， 例如洋地黄毒苷(DIG)、生物素，或2，4_ 二硝基苯基(DNP)。这些标记物以及它们的检测策略是本领域的技术人员公知的，例如，在Jin et al.，2001 (Morphology Methods =Cell and Molecular Biology Techniques，27-48)、Krick，2002 (Ann.Clin. Biochem. 39 :114-12)或 Grzybowski et al.，1993 (Nucleic Acids Research，Vol. 21，No. 8 :1705-1712)中描述了。此外，本发明的标记物可以通过化学轭合于核苷酸或非核苷酸连接试剂(即直接标记)、或通过核苷酸或非核苷酸连接试剂与可以结合标记物的分子的化学轭合(即，间接标记)来附着到寡核苷酸探针。在间接标记中，直接附着于寡核苷酸探针的分子一般是半抗原，例如2，4-二硝基苯基(DNP)、洋地黄毒苷(DIG)或生物素。在直接标记中，附着于寡核苷酸探针的分子一般是荧光染料。根据本发明的不同的标记物的检测策略在下文进一步详述。本发明的标记物可以进一步附着到寡核苷酸探针的5'-末端和/或3'-末端，或它可以通过与一个或更多个修饰的核苷酸或磷酸的连键内部地掺入到寡核苷酸探针中。做为选择，本发明的标记物还可以通过与一个或更多个非核苷酸连接试剂的连键掺入到寡核苷酸探针中。任选的，标记物可以在2-步骤过程中掺入到寡核苷酸探针中，例如， 通过引入反应基团如胺、叠氮化物或炔烃基团到寡核苷酸探针中，和通过通过酰胺键形成或点击化学(click chemistry)在第二个步骤中偶联标记物。如在此使用的术语“点击化学”一般是指任何生物正交(bioorthogonal)反应，其允许在高度复杂的化学环境内特定产物的高效的形成。特别地，它是指一种化学反应，其容许一个或更多个反应性标签在生物分子靶点上的掺入，以及随后在复杂的生物样品内标签衍生化方面的高度选择性。点击化学的原理是本领域的技术人员已知的，例如，在Best，M.D. (Biochemistry 2009,48(28) 6571-6584)中描述了。引入本发明的标记物的另一种途径是，例如，通过在基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成的氧化步骤期间偶联标记物，例如，在W02007/059816中描述的。可以设计本发明的寡核苷酸探针组，从而每个单独的寡核苷酸以一个或更多个拷贝，优选地以多个拷贝存在。优选地，设计寡核苷酸探针组，从而每个单独的寡核苷酸探针以等摩尔的量和/或以相似的浓度存在。计算核酸分子的浓度和/或摩尔浓度的方法是本领域的技术人员的标准知识。此外，优选地设计寡核苷酸探针组，从而一个单独的寡核苷酸探针的每个拷贝具有相同的序列，并含有处于相同位置的一个或更多个标记物。以单拷贝或多拷贝存在的单个寡核苷酸探针的每一种构成了寡核苷酸探针的一个子集。因而，在另一个优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组包含寡核苷酸探针的一个或更多个子集合，其中每个子集合由具有处于相同位置的标记物、具有相同序列的寡核苷酸探针组成。
如在本发明的上下文中发现的，具有相同序列并具有相同位置处的标记物的寡核苷酸探针的子集合是特别有益的，因为它们的生物化学性质是实验者已知的，可以选择掺入标记物的最有利位置的结果，此外，可以防止不利的位置，例如，将引起荧光信号的不利猝灭的位置。本发明的寡核苷酸探针可以进一步特征在于在寡核苷酸的化学合成期间将标记物插入到限定的位置。也就是说，限定数量的标记物可以掺入到分子中，通过在标记物要附着、连接和/或轭合的限定位置掺入修饰的核苷酸，或通过掺入充当标记物附着的平台的非核苷酸连接试剂。在限定位置处标记物的插入还包括在基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成的氧化步骤期间掺入标记物的操作(参见，例如，W02007/059816)。优选地，标记物的掺入是这样，从而标记物是在寡核苷酸探针上均勻分布的。更优选的，设计寡核苷酸探针，从而标记物被插入到分子中相互等距离的位置，特别是相互至少5、10、15或20或更多个核苷酸的间隔距离的位置。这种间隔距离可以是寡核苷酸探针的一个子集合与另一个子集合之间不同的，还可以取决于单个寡核苷酸探针的总长度，即，单个标记物之间的间隔距离可以根据寡核苷酸探针的总长度而提高。因而，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针包含处在大约相等间隔的位置的标记物，特别是至少5、10、15、或20个核苷酸的间隔距离。在另一个优选的实施方式中，寡核苷酸探针可以包含处在预定位置的标记物，任选地，处在相互以预定距离定位的位置上。以特定的间隔距离定位标记物的优点是，可以避免标记物相互太过靠近可能出现的任何副作用(例如，如果使用荧光标记物，干扰和/或猝灭)。此外，通过控制标记物掺入，可以进一步避免在影响杂交效率的某些位置引入过多的标记物。如在此使用的术语“预定的”一般是指，当设计单个的寡核苷酸探针时，标记物被掺入、附着、轭合或连接的位置可以被限定。也就是说，术语“预定的”是指，标记物不是随机地分布的和/或掺入的，例如，像酶学标记方法中的那样。识别和/或测定预定的标记物位置的一种可能性是，如果标记物在一个分子内的分布遵循一定模式。此外，当分析一个子集合内标记物的分布时，例如，如果一个或更多个子集合的每个寡核苷酸探针显示了掺入的标记物的相同的模式，预定的位置也可以是明显的。如上文详述的，标记物可以直接或间接地掺入、附着、轭合或连接到单个寡核苷酸探针。因此，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组特征在于，标记物直接地或通过接头间接地附着到核苷酸的碱基、糖、或磷酸部分。通过将标记物附着到碱基、糖或磷酸部分，⑴互补碱基配对对目标序列的可能的破坏和/或损伤被降低到最小，以及(ii)短寡核苷酸探针可以用于实现高效的结合亲和性。例如，2，4- 二硝基苯基(DNP)标记物可以直接连接到胞嘧啶核苷的N4位置。做为选择，核苷酸可以被修饰以容许和/或简化标记物的连接。也就是说，例如，吡喃锡青染料可以共价连接到5-氨基烷基-修饰的嘧啶核苷酸。标记物对探针的直接附着优选地不直接修饰通常涉及互补碱基配对的氢键键合相互作用的嘌呤或嘧啶碱基上的位点。在此提及的术语“接头”一般是指任何化学结构，其可以用来偶联、轭合、共价结合或附着标签到核苷酸的核碱基、糖或磷酸部分上。优选地，根据本发明的接头可以包括，但不限于，柔性的或刚性的结构，例如，乙二醇接头、六乙二醇接头、炔丙基氨基接头、氨基烷基接头、环己基接头、芳基接头、乙二醇乙炔基和乙氧基乙基氨基接头，或烷基胺接头。一般地，标记物可以通过活化的酯附着到接头。在又一个优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组的特征在于，标记物附着到非核苷酸单位。将标记物附着到非核苷酸单位的一个优点是，单独的寡核苷酸探针的设计和合成是序列独立性的。也就是说，可以设计所有寡核苷酸探针，从而它们含有相同位置处的标记物。此外，与本领域一般接受的相反，在本发明的情境中令人惊讶地发现的是，当将标记物附着到非核苷酸单位时，与目标序列的结合效力仍然是最佳的。如在此使用的，术语“非核苷酸单位” 一般是指任何试剂或分子，其可以方便地容许单个或多个部分，例如，标记物或嵌入剂在其任何特定的预先选择的位置连接到核苷酸探针。根据本发明非核苷酸单位优选地是单体单位，其可以与来自核苷酸试剂的特定核苷酸单体单位合成地偶联以产生具有主干的限定序列聚合物，所述主干包含核苷酸单体单位和非核苷酸单体单位。也就是说，本发明的非核苷酸单位可以置于核苷酸的主干序列内的任何期望的位置。本发明的非核苷酸单位可以包含配体，所述配体是带有标记物的接头-臂部分，或一旦接头-臂被脱保护可以参与轭合反应。本发明的非核苷酸单位可以进一步含有适合于点击化学的叠氮化物或炔烃部分(Best，M.D.，Biochemistry 2009,48(28) 6571-6584)。可用于在聚合物的形成期间保护接头臂官能团的适合的保护基团是本领域已知的。根据本发明非核苷酸单位可以进一步包含两个偶联基团，以容许它的逐步式包括到核苷酸和非核苷酸单体单位的聚合物中，其中这种偶联基团之一被限定，从而它可以有效地偶联到单体单位的生长链的末端，第二偶联基团能够进一步以逐步的方式延伸混合的核苷酸和非核苷酸单体的生长链。根据本发明的非核苷酸单位是本领域公知的，例如，在 EP0313219 中描述了。在进一步优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针包含适合于通过显色反应的方式、通过金相的反应的方式、或通过直接或间接荧光分析的方式来检测的标记物。如在此使用的术语“显色反应”包括但不限于，引起酶活性位点处发色团形成的本领域已知的所有标准方法。也就是说，在简单的单步骤或多步骤显色反应中，无色的底物可以被酶学转化为有色的产物。在本发明的情境中，显色反应包括显示可通过目视检查来研究、测定和/或分析的，酶活性的不连续的区域、点或条带的任何反应或反应的集合。例如，生物素化的寡核苷酸探针的检测通常采用比色的或化学发光的可视化，通过轭合到报告物酶如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶(HRP)的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。例如，4-硝基蓝四唑镨氯化物(NBT)和5-溴-4-氟-3-吲哚-磷酸(BCIP)是本领域公知的对于碱性磷酸酶的有效产色底物，其被转变为蓝色的产物。例如，通过化学发光可视化的检测可以包括任何增强的化学发光(ECL)反应，其涉及在辣根过氧化物酶(HRP)-和过氧化氢-催化的鲁米诺氧化期间的光线发射。发射的光可以捕获在膜上或由CCD照相机捕获， 可以用于定性的或半定量的分析。这样的检测系统是本领域常规使用的，例如，可以购自GE Healthcare(USA)。
在此提及的术语“金相的反应”一般是指任何类型的酶学或非酶学反应，其中在存在合适的金属来源和活化试剂的情况下，金属被选择性地沉积以得到黑色的、高度局部化的染色。也就是说，金相的反应是指酶催化的或金属催化的金属自溶液中的沉积。优选地， 根据本发明的酶的金相反应包括使用抗体偶联的辣根过氧化物酶(HRP)和溶液中的银(I) 离子。做为选择，金属微粒，例如金颗粒，可以在存在适合的还原剂的情况下从合适的银盐溶液中集结高度特异性的银沉积。优选地，根据本发明的非酶的金相反应包括用金颗粒和银(I)离子溶液直接或间接地标记的寡核苷酸探针的运用。这样的金相反应已经被证明对于原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHC)检测方法是高度敏感的，其中它容易地使单个基因的内源拷贝可视化。由于它被用于常规的明视野显微镜中，对于用户而言，它不需要荧光光学设备或暗适应。信号是永久的，不具有与荧光染料相关的光漂白问题。这样的检测系统(例如，EnzMet , NanoGold )是本领域中常规使用的，可以商业上购自各种供应商，包括，例如，Nanoprobes Inc. (USA)。如在此使用的术语“荧光分析” 一般是指本领域已知的、适合于显现、检测、分析和 /或定量荧光信号的所有类型的成象方法。特别地，根据本发明的荧光分析包括，但不限于， 重叠和共焦荧光显微镜术的所有已知的方法，包括，例如，多荧光探针显微术。寡核苷酸探针可以用荧光染料直接标记，并用荧光显微镜显现(直接荧光分析)，或者寡核苷酸探针可以用半抗原标记并用针对所述半抗原的荧光标记的抗体检测，然后用荧光显微镜显现(间接荧光分析)。间接荧光分析还包括与荧光标记的次级抗体组合使用非轭合的抗体。因此，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组的特征在于，所述标记物是荧光标记物或半抗原，特别是荧光素染料、罗丹明染料或花青染料，或生物素、洋地黄毒苷或2，4-二硝基苯基部分。取决于每个单独的寡核苷酸探针中存在的标记物的数量，寡核苷酸探针组包含可变总数的标记物。例如，如实施例3中例示的，当寡核苷酸探针组包含至少1000到2000的标记物总数，优选的至少4000到8000的标记物总数时，获得了最佳的结果。因而，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组包含至少1000、优选的至少 2000、更优选的至少4000和最优选的至少8000的标记物总数。通过提供包含总计高数量的标记物的寡核苷酸探针组，每个单独的寡核苷酸探针中掺入的标记物的数量可以降低，结果每个标记物可以以最佳的方式位于分子内。也就是说，通过仅掺入有限数量的标记物，例如，在荧光标记物的情况下，非期望的猝灭效应可以被避免，或者可以放置半抗原从而随后的检测由于最优的抗体结合而被优化。迄今为止，寡核苷酸探针被成功地用于高丰度目标序列的检测，例如，丰富地表达的mRNA或重复基因组序列，包括，例如，着丝粒序列，然而寡核苷酸探针用于检测低丰度序列的用途被描述为不利的(参见,例如Jin et al. ,2001 ；Morphology Methods =Cell and Molecular Biology Techniques :27-46)。然而在本发明的情境中，寡核苷酸探针被成功地用于检测非重复的基因组序列。 因而，针对非重复区域的寡核苷酸探针最适合于检测感兴趣的基因组目标序列。因而，在优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸探针组互补于基因组目标序列的非重复的区域。使用与基因组目标序列的非重复区域互补的寡核苷酸探针组的优点之一是，低丰度基因可以以高敏感性来检测和/或显现。在此使用的术语“非重复区域”一般是指感兴趣的基因组中重复DNA元件以外的任何序列。特别地，根据本发明的非重复区域是指基因组(例如，人类基因组)的重复序列以外的任何区域，所述重复序列包括但不限于，着丝点、端粒、串联重复(例如，卫星DNA、迷你卫星DNA和微卫星DNA)，以及散布重复元件，例如，SINE (短散布核元件)和LINE (长散布核元件)。重复元件已经在被分析的大部分真核基因组中发现，大部分以多拷贝存在，并且不编码蛋白质或RNA。散布的重复元件通常作为单个的拷贝存在，在整个基因组中广泛地分布。在进一步优选的实施方式中，寡核苷酸探针组可以互补于基因组目标序列的有义或反义链。通过使用互补于基因组目标序列的有义或反义链的寡核苷酸探针，由于探针不能再退火，确保了最佳的杂交。如在此使用的术语“有义”是指，寡核苷酸探针的序列与目标序列是相同的，例如， 与基因组序列的编码链是相同的。相比之下，术语“反义”是指相对链的序列。在本发明的情境中，已经发现的是，互补于基因组目标序列的有义或反义链的寡核苷酸探针可以用于检测感兴趣的基因组目标序列。人类表皮生长因子受体(HER-幻癌基因是表皮生长因子受体或erb基因家族的成员，编码跨膜的酪氨酸激酶受体，其逐渐成为侵入性乳腺癌的主要分类物和癌症治疗的靶点。HER-2 (C-erbB-2)基因位于染色体17q上。HER-2已经与患有晚期的转移性乳腺癌的患者中对抗-HER-2-人源化单克隆抗体(trastuzumab)的治疗的预后和响应联系起来。还测试了 HER-2状态预测乳腺癌对其他治疗，包括激素治疗、拓扑异构酶抑制物和蒽环类的响应的能力。基于形态学的和基于分子的技术都已经用于测量乳腺癌临床样品中的HER-2状态。迄今为止，免疫组织化学的(IHC)染色成为使用的主要方法。然而，不同于大多数IHC 分析，HER-2状态的评估是定量的，而不是定性的，因为HER-2在所有乳腺上皮细胞中表达。 研究显示，当对被小心地固定、处理和包埋的样本进行标准的IHC分析时，在基因拷贝状态和蛋白质表达水平之间存在极好的相关性。在本发明的情境中，令人惊讶地发现的是，本发明的寡核苷酸探针组特别适合于检测人类表皮生长因子受体2(人HER-幻基因座。人表皮生长因子受体2 (HEM)在大约 30%的乳腺癌症患者中高度表达，大量证据支持了 HER2过量表达与不良的总体存活之间的关系。因而，总是需要一种检测正常的或异常的人HER-2基因表达的改进的方法。例如， 在实施例1到3中例示了根据本发明的人表皮生长因子受体2基因座的检测。在本发明的情境中进一步发现的是，当寡核苷酸探针组针对感兴趣的目标序列的聚簇的区域时，基因组目标序列的金相的检测是特别有利的。如在此使用的术语“聚簇的” 是指，不同的寡核苷酸探针针对可能相互紧密接近的单独目标序列。这种紧密接近可能包括，但不限于，约50到500个核苷酸的距离。寡核苷酸探针的聚簇进一步是指，这些区域在感兴趣的基因组目标序列上不是平均分布的，但是寡核苷酸探针可以是不平均地分布的， 从而覆盖基因座之内紧密接近的区域(即，簇)以及位于更远距离的区域。根据本发明的寡核苷酸探针的聚簇在附图3中例示(参见，例如，库2和4)。因而，在另一个优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组的特征在于所述寡核苷酸探针是在基因组目标序列内聚簇的。在本发明的情境中，令人惊讶地发现的是，当使用聚簇的寡核苷酸探针和金相检测过程时，基因组目标序列的分析和/或可视化是特别敏感的。在另一个优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸探针组的特征在于寡核苷酸探针针对基因组目标序列，其中基因组目标序列包含人表皮生长因子受体2 (人HER-幻基因座。在此提及的术语“人表皮生长因子受体2 (人HER-幻基因座” 一般包括构成编码人表皮生长因子受体2 (HEM)的基因的全基因组序列和/或基因组区域。这些序列对于基因表达可以或可以不是必需的。构成人表皮生长因子受体2(人HER-幻基因座的序列是本领域的技术人员已知的，例如，可以通过数据库检索来鉴定，包括但不限于NCBI (国家生物技术信息中心)GenBank数据库。在本发明的情境中，令人惊讶地发现的是，当应用金相的检测方法时，寡核苷酸探针的聚簇是特别有利的。也就是说，寡核苷酸探针的聚簇容许基因序列的高灵敏度的检测， 因为假定的是，金属的酶介导的沉积被标记物相互的紧密接近所加速。在本发明的情境中，已经展现的是，包含至少100种不同的寡核苷酸探针的寡核苷酸探针组可以成功地用于检测基因组目标序列，特别是包含HER-2基因座的基因组目标序列。例如，根据本发明的基因组目标序列，特别是包含HER-2基因座的目标序列的检测在附图1到4中例举了。因而，在另一个方面，本发明提供了本发明的寡核苷酸探针组用于检测基因组目标序列的用途。在本发明的情境中，术语“检测” 一般是指显现、分析和/或定量寡核苷酸探针与其目标序列的结合。根据本发明的检测包括但不限于，探测的样品的目视检查，包括使用标准显微镜技术以及任何类型的荧光分析。特别地，样品的目视检查在寡核苷酸探针与它的目标序列杂交之后进行。对于放射性标记来说，检测是指使探测的样品暴露于X射线底片， 包括放射自显影图的产生。优选地，根据本发明的检测通过显色反应、金相反应的方式，或通过直接或间接的荧光分析的方式来进行。在本发明的情境中，令人惊讶地发现的是，包含至少100种不同的寡核苷酸探针的寡核苷酸探针组容许了一种检测方法，其提供了相比现有技术的多种优点。也就是说，使用根据本发明的寡核苷酸探针组，与现有技术已知的和可获得的方法相比，感兴趣的基因组目标序列可以⑴以降低数量的探针，( )在降低的杂交时间之后，和/或(iii)用降低的背景来检测。用于检测基因组目标序列的已知的标准方法采用了，例如，产色的原位杂交 (CISH)和免疫组织化学(EHC)技术(Ventana Inform , Ventana Medical Systems Inc.， USA ；SpotLight , Zymed Laboratories Inc. , CA, USA)。因而在进一步的方面中，本发明提供了检测感兴趣的基因组目标序列的方法，所述方法包括步骤a)在有助于寡核苷酸探针组与感兴趣的基因组目标序列结合的条件下孵育根据本发明的寡核苷酸探针组和样品；和b)检测寡核苷酸探针与基因组目标序列的结合。上文限定的所有方面和实施方式还涉及检测感兴趣的基因组目标序列的方法。术语“在有助于结合的条件下” 一般是指一些条件，在所述条件下本发明的标记的寡核苷酸探针可以与它的目标序列杂交，即，寡核苷酸探针可以结合它的目标序列的条件。 特别地，在本发明的上下文中，有助于结合的条件是指寡核苷酸探针和目标序列之间互补碱基对的形成。寡核苷酸探针和目标序列之间的杂交以及因而互补碱基对的形成由处于平衡中的氢键键合和疏水性相互作用来限定。也就是说，两个互补链的退火和分离取决于多种因素，包括温度、盐浓度、PH值、探针和目标分子的性质，以及杂交和洗涤溶液的组成。杂交的最适温度优选地处于低于1值15-251的范围内，Tm值限定了杂交物的熔解温度(Tm)， 艮口，50%的双链核酸链分离所处的温度。计算Tm值的各种公式是本领域技术人员已知的。 RNA-RNA杂交物一般比DNA-DNA或DNA-RNA杂交物更稳定10_15°C，因而杂交和洗涤需要更严格的条件。根据本发明有助于结合的条件还包括使用含有试剂的杂交缓冲液来最大化双螺旋的形成以及抑制探针与组织或细胞的非特异性结合。探针的浓度必需对每种探针和对每种组织来优化。有助于结合的条件还指孵育探针和目标序列足够的时间，以容许最佳的杂交，包括通过应用一个或更多个洗涤步骤的未结合的探针的去除。特别地，在本发明的情境中，根据本发明的有助于结合的条件指杂交条件，在所述条件中寡核苷酸探针与溶液中的目标样品孵育。也就是说，有助于结合的条件不是指寡核苷酸探针与被固定的目标样品孵育的任意条件，例如，在DNA阵列的情境中的条件。例如， 在实施例3中描述了根据本发明的有助于结合的条件。基因表达的分析对于疾病的存在、对于评估疾病的不同阶段、或对于治疗处置的成功或失败可以是指示性的。例如，HER-2基因过量表达已经被描述为与导管癌的高级别和广泛形式相关，而HER-2基因扩增已经与侵入性小叶癌的不良结局相联系。此夕卜，HER-2基因扩增和蛋白质过量表达已经一致地与高肿瘤级别、DNA非整倍性、高细胞增殖率、雌激素和黄体酮的核内蛋白受体的阴性分析、P53突变、拓扑异构酶IIa扩增、 以及乳腺癌侵入性和转移的多种其他的分子生物标记物的改变相关联(参见，例如， Ross et al.，2004)。HER-2基因表达的状态进一步与使用抗-HER-2-人源化单克隆抗体 trastuzumab ( Herceptin ，Genentech，CA, USA)治疗的预后和响应相联系。因而，在优选的实施方式中，根据本发明检测基因组目标序列的方法进一步特征在于，所述检测是用于诊断目的，特别是用于人类疾病和/或用于患者中治疗处置的有效性。用于诊断目的以及用于评估医学处置的敏感的检测方法的可靠性是特别重要的。在另一个优选的实施方式中，本发明或本发明的方法的用途的特征在于，所述检测是通过原位杂交的方式进行的。原位杂交是标准方法，因而是特别重要的。如在本发明的情境中使用的，术语“原位杂交”一般是指任何类型的核酸杂交分析，在其中标记的寡核苷酸探针被用于在组织(原位)、细胞的部分或切片，或如果组织是足够小的(例如，植物种子或果蝇胚)在整个生物体中定位特定的DNA或RNA序列。因而， 根据本发明的原位杂交是指在形态保存的组织切片或细胞制品中，通过使核苷酸探针的互补链与感兴趣的序列杂交来定位和检测特定核苷酸序列的任何方法。一般有两种类型的标记的探针可以用于原位杂交方法，S卩，直接地或间接地标记的寡核苷酸。寡核苷酸可以通过将它轭合到分子来间接地标记，所述分子可以通过第二分子或抗体，例如，生物素来检测。生物素标记的寡核苷酸经常用于原位杂交技术，例如，可以
15通过将荧光色素轭合的抗生物素蛋白结合到生物素标记的和杂交的探针来检测。另一种类型的间接标记的寡核苷酸可以包括轭合到洋地黄毒苷或二硝基苯基的那些。例如，这些标记物可以通过荧光色素轭合的抗洋地黄毒苷或抗二硝基苯基抗体来检测。其他寡核苷酸可以通过将荧光色素共价地附着到限定位置处的单个核苷酸或非核苷酸连接试剂来直接标记，这消除了使用第二检测分子的必要。在DNA合成之后寡核苷酸探针的标记常常比在合成期间掺入标记的核苷酸更容易。相反地，直接标记的探针的检测是较少费时的，因为可以省略第二检测分子的使用。因此，直接和间接标记的探针都存在清楚的优点和缺点。优选地，本发明的寡核苷酸探针用二硝基苯基标记，并通过使用抗二硝基苯基抗体来检测。用于原位杂交的寡核苷酸探针可以是DNA或RNA或是两者的组合，可以或可以不是荧光标记的。因而，本发明的原位杂交包括荧光原位杂交(FISH)以及产色的原位杂交 (CISH)技术的所有已知方法两种，例如，其可以用于医学诊断来评估染色体完整性。原位杂交还可以通过使用半抗原或放射性标记的寡核苷酸探针来进行，例如，其中检测通过使用荧光团标记的抗体、抗生物素蛋白或X射线曝光来进行。原位杂交方法是本领域的技术人员公知的，例如，在 Silverman 和 Kool，2007，Advances in Clinical Chemistry, Vol. 43 79-115中描述了。根据本发明的原位杂交进一步包括多通道或多色原位杂交的所有已知的操作， 即，其中使用具有不同颜色的荧光标记物的寡核苷酸探针，或其中使用具有不同半抗原的寡核苷酸探针和不同的酶/底物系统的所有操作。这些多标记物可以同时地或在一系列检测步骤中检测。这样的方法是本领域的技术人员已知的，例如，在Wiegant et al., 1993 (Cytogenet Cell Genet 63 :73-76)中描述了。例如在本发明的实施例1中举例说明的，以降低的时间，即，在显著小于4小时的杂交时间之后，成功地实现了基因组目标序列的检测。此外，与本领域已知的方法相比(例如，Ventana hform 检测方法)，甚至在1小时或30分钟的杂交时间后获得了改善的结^ ο因而，在优选的实施方式中，本发明的方法进一步特征在于，步骤b)的检测是通过显色反应的方式、通过金相反应的方式、或通过直接或间接荧光分析的方式；和/或步骤 a)的孵育是在最多4小时、3小时或2小时之后，特别地在最多1小时或30分钟之后完成。如在本发明的情境中令人惊讶地发现的，与本领域已知的标准检测方法相比，基因组目标序列的检测可以在更短的杂交时间内实现(参见，例如，附图2)。例如，在附图4 中例举了通过间接荧光分析的方式的基因组目标序列的检测。在此提及的术语“完成”不能被理解为步骤a)的孵育基本上结束。它是指孵育时间的增加不会引起信号的显著改善或提高。相比之下，术语“完成”是指寡核苷酸探针与感兴趣的目标序列的杂交完成，从而可以获得可检测的结果。例如在实施例3中举例说明的，在本发明的情境中进一步观察到的是，不同的寡核苷酸探针子集合的选择，产生各种寡核苷酸探针“混合物”组合物，容许与本领域已知的方法(例如，Ventana Inform )相比改善的检测。在进一步的方面中，本发明提供了产生针对感兴趣的基因组目标序列的寡核苷酸探针组的方法，所述方法包括步骤
a)设计与感兴趣的基因组目标序列的至少100个不同的区域互补的寡核苷酸探针组，特别地其中所述区域包含非重复序列；和b)合成根据本发明的寡核苷酸探针组。上文限定的所有方面和实施方式还涉及产生针对感兴趣的基因组目标序列的寡核苷酸探针组的方法。本发明的优点之一是，寡核苷酸探针可以以高度可重复的方式来产生。此外，寡核苷酸探针的设计可以适合于各种不同的基因序列。如在此使用的术语“设计”是指与寡核苷酸探针互补的不同的目标序列的鉴定。 如上文详述的，可以设计本发明的寡核苷酸探针，从而它们可以与目标序列的有义或反义链互补。优选地，设计寡核苷酸探针，从而它们不与人类基因组的任何重复区域互补。设计进一步是指，寡核苷酸探针可以与感兴趣的目标序列形成任何类型的互补碱基对，包括但不限于，典型的和非典型的碱基对和碱基错配。也就是说，本发明的寡核苷酸探针优选地可以，但不必然地被设计为显示与目标序列100%的互补性。如果认为合适，还可以设计寡核苷酸探针以显示与目标序列低于100%的互补性。然而，寡核苷酸探针与感兴趣的目标序列之间的互补性必需足够以提供对感兴趣的目标序列的结合，因而提供感兴趣的目标序列的检测。随着克隆的基因的数量提高，寡核苷酸探针可以根据任何公开的CDNA序列和/或基因库条目来容易地设计。来自各种生物体的基因组序列的数据库是本领域的技术人员已知的，包括，例如，来自NCBI (国家生物信息中心，USA)的全部公众数据库。如在此使用的术语“合成”优选地是指，通过化学合成的方式，包括但不限于使用自动化的DNA和/或RNA合成仪和亚磷酰胺化学作用，产生寡核苷酸探针。自动化DNA或 RNA合成仪是本领域的技术人员常规地使用的，可从各种供应商商业上获得，例如Applied Biosystems (Darmstadt, Germany)、Biolytic (Newark，CA, USA)或 BioAutomation (Piano， TX，USA)。优选地，本发明的寡核苷酸探针在一个或更多个96孔平板中合成，因而提供了快速和高效的高通量合成。以96孔平板形式的寡核苷酸探针化学合成不仅允许各种不同的寡核苷酸的快速合成，还容许不同的寡核苷酸子集合的高效率和组合的选择。如上文已经详述的，根据本发明的检测感兴趣的基因组目标序列的方法可以进一步通过在多个96孔形式合成所产生的寡核苷酸的大库中至少100种不同寡核苷酸子集合的单独的和组合的选择来优化，所述子集合然后可以用于构建根据本发明的寡核苷酸探针组。例如，在实施例 3中举例说明了根据本发明的不同的寡核苷酸探针子集合的组合选择。这种优化过程可以进一步通过实验的读出来评估。任选的，所述寡核苷酸探针可以进一步通过本领域可用和已知的任何类型的标准方法来纯化。这样的方法包括但不限于，层析方法，例如，高效液相层析法(HPLC)。任选的、纯化所述寡核苷酸探针是经由一个或更多个附着保护基团例如、例如，DMT(二甲氧基三苯甲基)来进行。DMT基团被广泛地用于寡核苷酸合成中核苷的保护。原则上，每个寡核苷酸探针可以分别地和/或单独地纯化。优选地，本发明的寡核苷酸探针作为组或作为不同子集合的库来纯化。例如，由96个粗制寡核苷酸组成的MWP探针库的等分量可以在RP 18HPLC柱(Hypersil，8x240mm)上使用0. IM三乙基乙酸铵pH7/乙腈梯度来纯化。在峰上的DMT可以被采集、通过透析脱盐、蒸发并溶于IOmM Tris pH8.0中。可以通过UV检测来测定0拟60nm。
在优选的实施方式中，本发明的方法进一步特征在于，步骤b)的合成包括至少一种标记物的掺入i)通过亚磷酰胺修饰的构建块，或ii)通过在基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成期间的氧化步骤。如在此使用的，术语“亚磷酰胺修饰的构建块”一般是指包含亚磷酰胺或亚磷酰胺衍生物的任何化学结构，其可以用于将一个或更多个标记物导入到寡核苷酸分子中。特别地，亚磷酰胺修饰的构建块可以用于直接在自动化合成仪上，通过与标准合成相同的操作，通过将构建块共价附着到生长的合成寡核苷酸上，来成功地和常规地制备单标记或多标记的寡核苷酸。优选地，本发明的亚磷酰胺修饰的构建块是指脱氧核苷亚磷酰胺，例如， N4-氨基烷基-2'-脱氧-胞嘧啶核苷，或C-5取代的嘧啶。脱氧核苷亚磷酰胺可以在嘧啶的C-5位置或在C-4位置处、脱氧腺苷或脱氧鸟苷的C-8位置处、或7-脱氮杂嘌呤的C-7 位置处带有N-保护的氨基烷基基团。做为选择，脱氧核苷亚磷酰胺可以带有适合于标记物的基于点击化学的掺入的叠氮化物或炔烃部分。特别地，本发明的亚磷酰胺修饰的构建块进一步包含非核苷部分。任选的，亚磷酰胺修饰的构建块可以在它掺入到寡核苷酸之前被标记。可以附着于本发明的亚磷酰胺构建块的标记物包括但不限于，荧光团、生物素和 2，4_ 二硝基苯基(DNP)。荧光标记的亚磷酰胺修饰的构建块的实例包括，但不限于，荧光素-dT亚磷酰胺、cx-FAM亚磷酰胺和Quasar 570-dT亚磷酰胺。这些化合物是本领域的技术人员已知的，例如，可以购自各个供应商，例如，hvitrogen (Carlsbad, CA, USA)、Biosearch Technologies(Novato, CA, USA)、 Biogenex Laboratories(San Ramon, CA, USA)或 Glen Research (Sterling, CA, USA)。在特别优选的实施方式中，亚磷酰胺修饰的构建块是2，4_ 二硝基苯基(DNP)-亚磷酰胺。2,4- 二硝基苯基(DNP)-亚磷酰胺是连接到2，4_ 二硝基苯基(DNP)的亚磷酰胺。 2，4_ 二硝基苯基(DNP)是便宜的小标记物，其可以通过使用单克隆IgG抗DNP抗体来免疫原性地检测。2，4_ 二硝基苯基可以在固相合成期间掺入到与亚磷酰胺连接的寡核苷酸中。 本领域中描述了 DNP亚磷酰胺的各种结构(参见，例如，Grzybowski et al.，1993，Nucleic Acid Research,Vol. 21,No. 8 :1705-1712)。为了获得抗体检测中的最大敏感性，DNP部分优选地通过具有可变大小的接头附着到亚磷酰胺构建块。含有多个2，4_ 二硝基苯基报告基团的寡核苷酸的合成和抗体介导的检测是本领域的技术人员公知的，例如，在Grzybowski et al.，1993 中描述了。本发明的标记物可以进一步通过基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成期间的氧化步骤掺入到寡核苷酸探针中。在基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成期间的氧化的过程是本领域的技术人员已知的过程，例如，在W02007/059816中描述了。在又一个方面中，本发明提供了试剂盒，其包含根据本发明的寡核苷酸探针组，此夕卜，包含选自以下构成的组的至少一种进一步的成分去石蜡化试剂、预处理试剂、洗涤试齐U、检测试剂以及产品单。对本领域的技术人员而言明显的是，本发明的试剂盒可以包含多种标准成分，例如，缓冲液、抗体和/或停止特定的反应的试剂。技术人员将能够将试剂盒的组成调整到主要预期的用途，例如，其取决于检测系统、检查的细胞或组织、目标序列、标记物、检查的样品，等等。特别地，以下说明了一些成分。如在此使用的术语“去石蜡化试剂” 一般是指任何类型的物质，其适合于从蜡包埋的生物样品中除去蜡。根据本发明的去石蜡化试剂可以包含一种或更多种石蜡增溶有机溶剂、一种或更多种极性有机溶剂、一种或更多种表面活性剂，并且可以进一步任选地包含水。如在此使用的术语“预处理试剂” 一般是指任何类型的试剂或物质，当在将寡核苷酸探针添加到杂交缓冲液中之前与样品孵育时，其可以用于阻断溶液中的非特异性结合位点，或适合于改善寡核苷酸探针与目标序列的结合。术语“洗涤试剂”一般是指任何类型的液体组合物，其可以用于在杂交之后移除未结合的寡核苷酸探针。例如，本发明的洗涤试剂可以含有单价或二价盐，例如，NaCl，缓冲盐，例如柠檬酸钠，和/或各种浓度的甲酰胺。在这点上，更高的甲酰胺浓度和更低的NaCl 浓度通常用于更高的严格度。根据本发明的洗涤试剂是本领域已知的，例如，在W093/06245 中描述了。在此提及的术语“检测试剂”一般是指任何物质或试剂，其对于在与目标序列杂交之后标记的寡核苷酸探针集的检测是必需的或相关的。本发明的检测试剂可以包括，但不限于，荧光或非荧光标记的抗体、酶反应的底物，例如，辣根过氧化酶或碱性磷酸酶的产色底物，或物质如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。以下附图和实施例意图说明本发明的各种实施方式。因而，所讨论的特定的修饰不被看作是对本发明的范围的限制。对本领域的技术人员明显的是，可以产生各种等价物、 改变和修饰而不背离本发明的范围，因而要理解的是，这样的等价的实施方式被包括在此。附图附图1显示了在来自Calu3、ZR-75_l和MCF7细胞的异种移植物中HER-2基因组基因扩增的可视化，是通过使用各种浓度的DNP标记的寡核苷酸探针的原位杂交来研究的。 ㈧无基因扩增。左侧画面使用Ventana hform 检测系统的HER-2基因组基因序列的检测(Cat. No. 780-001, Ventana Medical Systems Inc. , USA) ；Ventana HER-2/neu 探针 10 μ g/ml的浓度；右侧画面使用4 μ g/ml浓度的1440种不同的寡核苷酸探针组的HER-2 基因组基因序列的检测。每个寡核苷酸探针分别包含81个核苷酸和6个标记物。标记物的总数8640。(B)低基因扩增。左侧画面Ventana hform 检测系统；Ventana HER-2/neu 探针浓度10 μ g/ml ；右侧画面参见(A)，右侧画面。(C)高基因扩增。左侧画面=Ventana hform 检测系统；Ventana HER-2/neu探针浓度10 μ g/ml ；右侧画面如(A)，右侧画面。附图2显示了在来自ZR-75-1细胞的异种移植物中HER-2基因组基因序列的可视化，是通过用DNP标记的寡核苷酸探针的原位杂交、在各种杂交时间之后使用酶金相检测来研究的。(A)杂交时间32分钟；左侧画面使用Ventana hform 检测系统的HER-2基因组基因序列的检测(Cat. no. 780-001 ；Ventana Medical Systems Inc. ,USA)；右侧画面 使用1440种不同的寡核苷酸探针组的HER-2基因组基因序列的检测，每个寡核苷酸探针包含81个核苷酸和6个标记物。标记物的总数8640。(B)杂交时间1小时；左侧画面使用Ventanalnform 检测系统的HER-2基因检测；右侧画面参见(A)，右侧画面。(C)杂交时间2小时；左侧画面使用Ventana hform 检测系统的HER-2基因检测；右侧画面参见(A)，右侧画面。
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附图3显示了在来自ZR-75-1细胞的异种移植物中HER-2基因组基因序列的可视化，是通过用包含各种总数的掺入标记物的、不同的DNP标记的寡核苷酸探针组的原位杂交来研究的。原位杂交如附图2中描述的进行。(A)用于HER-2基因检测的寡核苷酸探针组合物的不同组的示意图。寡核苷酸探针不同子集合通过组合来自不同96孔平板的各种寡核苷酸探针来产生。每个框表示包含96种不同的寡核苷酸探针的96孔平板。(B)使用包含大约15000个标记物的Ventana Inform 检测系统的原位杂交(左上画面)，与用根据本发明的不同的寡核苷酸探针组获得的结果比较。本发明的寡核苷酸探针以96孔平板形式产生(总共15个平板)，通过组合不同的平板产生不同的寡核苷酸探针组(例如，不同的库)。库1 平板1到15的组合；标记物总数8640 ；库2 平板1到4和12到15的组合；标记物总数:4608 ；库4 平板1、3、5、7、9、11、13和15的组合；标记物总数4608。附图4显示了在来自MCF7和Calu细胞的异种移植物中HER2基因扩增的可视化， 是通过利用间接荧光检测、用DNP标记的寡核苷酸探针的原位杂交来研究的。与HER2基因座杂交的探针利用Cy5滤光器(Cy5滤光器)来显现，复染色通过DAPI滤光器(DAPI)来显现。覆盖Cy5和DAPI滤光器。(A)无基因扩增。在来自MCF7细胞的异种移植物中，利用 DyLight 649轭合的抗兔IgG的HER2基因组序列的检测。(B)高基因扩增。在来自Calu 细胞的异种移植物中，利用DyLight 649轭合的抗兔IgG的HER2基因组序列的检测。附图5显示了用于原位杂交的示范性的标记的寡核苷酸探针的示意图。(A)针对人HER-2基因座的五种不同的87mer DNA寡核苷酸探针的一级序列和设计，每个包含81个核苷酸和6个DNP亚磷酰胺标记物(1个在5'末端，5个是内部掺入的)。每个标记物的位置用“X”标出，其中X表示2，4-二硝基苯基(DNP)。按照从3'末端开始计数，DNP位于位置2、19、36、53、70和87，16nts的间隔。(B)与2，4- 二硝基苯基(X)连接的亚磷酰胺修饰的构建块的化学结构。DMP表示二甲氧基三苯甲基。
实施例探针合成用6DNP标记的87mer寡核苷酸的15X96孔平板DNA探针合成在Biolytic Dr. Oligo 192MWP DNA合成仪上，利用标准的亚磷酰胺化学作用和Biolytic ‘ s合成循环在50nmol的尺度下进行。合成以DMT开模式(DMT on mode)进行。2000A CPG dT支持物(Glen Research , cat. no. 20-2032)加载到微孔合成平板(Orochem filter plate 96well,cat.no. OF 1100)的所有反应孔中。基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成所需的所有其他标准试剂购自Proligo 或Glen Research ，乙腈购自Baker 。寡核苷酸合成的质量经常地通过释放的DMT阳离子的颜色检测来检查。在合成完成之后，寡核苷酸用氨裂解和脱保护QO小时，40°C )，然后在speed vac浓缩器中蒸发，重悬浮在600 μ 1 IOmM Tris ρΗ8. 0 中。此后，通过0拟60nm测量来测定浓度。产量7-160拟60nm。这种粗质量用于构成不同的探针库。原位杂交使用用于去石蜡化、预处理、洗涤和严格洗涤的Ventana 试剂，在Ventana Discovery XT系统(Cat. no. 750-701)上进行原位杂交分析。样品与根据本发明的探针组合物或 Ventana INFORM HER2DNA Probe (Ventana, cat. no. 780-4332)杂交。除非另有说明，根据本发明的寡核苷酸探针组由1440个寡核苷酸探针组成，每个包含81个核苷酸并带有相互距离16个核苷酸、处在相同位置的6个非核苷酸的DNP标记物。这种探针中标记物的总数是8640。通过酶金相检测，通过产色检测或通过间接荧光检测来检测探针。根据本发明的探针组合物在杂交缓冲液(含有处于Tris缓冲液中的甲酰胺、硫酸葡聚糖、氯化钠、柠檬酸钠)中稀释到4μ g/ml的终浓度。作为10μ g/ml终浓度的杂交缓冲液中的备用溶液， Ventana INFORM HER2DNA Probe (Ventana, cat. no. 780-4332)由厂家提供。样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的HER23合1异种移植物对照载玻片(Ventana，cat. no. 783-4332)。 每个载玻片带有分别来自Calu3 (高HER2基因扩增)、ZR-75-1 (中间HER2基因扩增)和 MCF7 (无HER2基因扩增)细胞的异种移植物的3个组织切片。玻片使用EZ Prep (Ventana, cat. no. 950-102)在 65°C 20 分钟，随后在 75°C 4 次 4分钟来去石蜡化。玻片用反应缓冲液(Ventana，cat. no. 950-300)在90°C预处理3X8分钟，然后用蛋白酶3 (Ventana，cat. no. 760-2020)在37°C消化20分钟。除非另有说明，探针在52°C杂交2小时。严格洗涤使用SSC(Ventana , cat. no. 950-110)在78°C进行3X8 分钟。玻片然后与兔抗DNP抗体(Ventana , cat. no. 780-4335)在37°C孵育20分钟。对于附图2中显示的实验，修改如上所述的方案，从而杂交时间分别是32分钟㈧、1小时(B) 和2小时(C)。酶金相检测探针的酶金相检测使用ultra View SISH Detection Kit (Ventana, cat. no. 780-001)进行，从在 37 °C 与 ultra View SISH-HRP(Ventana ultra View SISH Detection Kit ，cat. no. 780-001)孵育 16 分钟开始。玻片然后与ultra View SISH Silver 发色团 A、ultra View SISH Silver 发色团 B 和 ultra View SISH Silver 发色团 C 在 37°C 孵育 12 分钟(Ventana ultra View SISH Detection Kit , cat. no. 780-001)。玻片用苏木精 II (Ventana，cat. no. 790-2208)在 37°C 4 分钟，随后用 Bluing 试剂(Ventana，cat. no. 760-2037)在37°C 4分钟来复染色。玻片然后在温和洗涤溶液中洗涤2 X，在一系列醇稀释物(70^^96^^100%)中脱水，最后在二甲苯中两次洗涤，然后用Permount (Fisher Scientific , cat. no. SP15-100)固定。产色检测探针的产色检测用Ventana BlueMap 试剂(Ventana，cat. no. 760-120)进行。玻片与碱性磷酸酶轭合的UltraMap抗兔IgG (Ventana cat. no. 760-4314)在37°C孵育12分钟，随后与 Activator、BlueMapl 和 BlueMap2 (Ventana，cat. no. 760-120)在 50°C孵育 20 分钟。玻片然后在温和洗涤溶液中洗涤2X，在一系列醇稀释物(70^^96^^100%)中脱水，最后在二甲苯中两次洗涤，然后用Permount (Fisher Scientif ic, cat. no. SP15-100)固定。荧光分析探针的间接荧光检测使用DyLight 649轭合的抗兔IgG在37°C 20分钟来进行。 玻片用DAPI (Ventana, cat. no. 760-4196)在室温下复染色8分钟。玻片然后在温和洗涤溶液中洗涤2X，在一系列醇稀释物(70^^96^^100%)中脱水，最后在二甲苯中两次洗涤， 然后用Permount (Fisher Scientific, cat. no. SP15-100)固定。荧光显微镜检查用荧光显微镜(Leica DM5500)进行，使用卤素荧光灯(Leica EL6000)和Cy5荧光滤光器立方(激发620nm，二色镜660mn，抑制700nm)用于HER2基因序列信号的可视化，DAPI荧光滤光器立方(激发360nm，二色镜400nm，抑制470歷)用于复染色的可视化。图像使用60 X物镜用 CCD 照相机(Leica DFC 350FX)采集。实施例1附图1中显示的实验展现了，在2小时的杂交时间下，当与Ventana INFORM HER2DNA Probe (Ventana Medical Systems Inc. ,USA)比较时，根据本发明的寡核苷酸探针组在更低的探针浓度下g/ml对比10μ g/ml)产生了相似的信号强度。实施例2使用根据本发明的寡核苷酸探针组，在更低浓度下g/ml对比10μ g/ml)与 Ventana INFORM HER2DNA Probe 相比，在杂交32分钟之后或1小时之后，观察到更强烈的染色信号。虽然在仅32分钟的杂交时间之后根据本发明的寡核苷酸探针组产生了最佳的染色，使用INFORM HER2DNA Probe的最佳染色仅在2小时之后实现，亚最佳的染色在1 小时之后实现(参见附图2)。实施例3附图3中列出的实验显示了，当使用金相检测时，与在整个目标基因座上寡核苷酸探针子集合的平均分布相比，在目标基因座的两个末端寡核苷酸探针子集合的聚簇(留下目标基因座的中间部分未标记)得到更强烈的染色(参见附图3，库2对比库4)。注意的是，然而标记物的总数在两种库中是相等的。这明显地说明了，本发明的寡核苷酸探针组的优点在于，它提供了设计寡核苷酸子集合的最佳组合的可能性，以获得最佳的信号强度， 同时最小化必需的寡核苷酸探针子集合的数量。实施例4附图4中显示的实验揭示了，根据本发明的寡核苷酸探针组可以使用间接荧光检测来显现。
权利要求
1.寡核苷酸探针组，其包含针对感兴趣的基因组目标序列的至少100种不同的单链寡核苷酸探针，其中每一个单独的寡核苷酸包含至少一个标记物。
2.权利要求1的寡核苷酸探针组，其中所述组包含至少200、300或400种不同的寡核苷酸探针，特别地至少500种不同的寡核苷酸探针，更特别地至少1000种不同的寡核苷酸探针。
3.权利要求1或2的寡核苷酸探针组，i)其中每个寡核苷酸探针具有20到200个核苷酸、优选的40到175个核苷酸、更优选的60到150个核苷酸、特别是80到120个核苷酸的长度，和/或 )其中每个寡核苷酸探针包含至少两个或三个标记物，特别是至少五个标记物，更特别地至少10个标记物，最特别地至少15个标记物。
4.权利要求1的3的任一项的寡核苷酸探针组，i)其中所述寡核苷酸探针组包含寡核苷酸探针的一个或更多个子集合，其中每个子集合由具有处于相同位置的标记物、具有相同序列的寡核苷酸探针组成，或 )其中所述寡核苷酸探针包含处在大约相等间隔的位置的标记物，特别是至少5、 10、15、或20个核苷酸的间隔距离，或iii)其中所述寡核苷酸探针包含处在预定位置的标记物，任选地，处在相互以预定距离定位的位置上。
5.权利要求1到4的任一项的寡核苷酸探针组，其中所述标记物是 i)直接地或通过接头间接地附着到核苷酸的碱基、糖、或磷酸部分，或 )附着于非核苷酸单位，特别地其中所述标记物适合于通过显色反应的方式、通过金相反应的方式或通过直接或间接荧光分析的方式来检测。
6.权利要求1到5的任一项的寡核苷酸探针组，其中所述标记物是荧光标记物或半抗原，特别是荧光素染料、罗丹明染料或花青染料，或生物素、洋地黄毒苷或2，4_ 二硝基苯基部分。
7.前述权利要求的任一项的寡核苷酸探针组，其中所述寡核苷酸探针组包含至少 1000、优选的至少2000、更优选的至少4000和最优选的至少8000的标记物总数。
8.前述权利要求的任一项的寡核苷酸探针组，i)其中所述寡核苷酸探针互补于基因组目标序列的非重复区域，或 )其中所述组的寡核苷酸探针互补于基因组目标序列的有义或反义链。
9.前述权利要求的任一项的寡核苷酸探针组，i)其中所述寡核苷酸探针在基因组目标序列内聚簇，或 )其中所述基因组目标序列包含人表皮生长因子受体2(人HER-幻基因座。
10.根据权利要求1到9的任一项的寡核苷酸探针组用于检测基因组目标序列的用途。
11.一种检测感兴趣的基因组目标序列的方法，所述方法包括步骤a)在有助于寡核苷酸探针组与感兴趣的基因组目标序列结合的条件下孵育权利要求 1到9的任一项的寡核苷酸探针组和样品；和b)检测寡核苷酸探针与基因组目标序列的结合。
12.权利要求11的方法，其中所述检测是用于诊断目的，特别是用于人类疾病，和/或用于患者中治疗处置的有效性。
13.权利要求10的用途，或权利要求11或12的方法，其中所述检测是通过原位杂交的方式进行的。
14.权利要求11到13的任一项的方法，其中(i)步骤b)的检测是通过显色反应的方式、通过金相反应的方式，或通过直接或间接的荧光分析的方式；和/或( )步骤a)的孵育在最多4小时、3小时或2小时之后，特别地在最多1小时或30分钟之后完成。
15.一种产生针对感兴趣的基因组目标序列的寡核苷酸探针组的方法，所述方法包括步骤a)设计与感兴趣的基因组目标序列的至少100个不同的区域互补的寡核苷酸探针组， 特别地其中所述区域包含非重复序列；和b)合成根据权利要求1到9的任一项的寡核苷酸探针组。
16.权利要求15的方法，其中步骤b)的合成包括至少一种标记物的掺入，其 i)通过亚磷酰胺修饰的构建块，或 )通过在基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成期间的氧化步骤。
17.—种试剂盒，其包含根据权利要求1到10的任一项的寡核苷酸探针组，和此外，包含至少一种选自以下构成的组的进一步的成分去石蜡化试剂、预处理试剂、洗涤试剂、检测试剂以及产品单。
全文摘要
本发明涉及包含针对感兴趣的基因组目标序列的至少100种不同的单链寡核苷酸探针的寡核苷酸探针组，利用寡核苷酸探针组检测感兴趣的基因组目标序列的方法，产生寡核苷酸探针组的方法，以及包含寡核苷酸探针组和至少一种进一步的成分的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102482714SQ201080036226
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月26日 优先权日2009年7月30日
发明者F·伯格曼, H·冯德埃尔茨, T·菲舍尔, W·埃伯勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司