专利名称：生物人工内脏器官的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种使用培养细胞将干细胞分化诱导成组织细胞的方法。本发明还涉及一种包含所分化诱导之组织细胞的生物人工内脏器官的制造方法，更进一步涉及包含所得之生物人工内脏器官的医疗用材料。
背景技术：
近年来，组织工程学已受到关注，在组织工程学中，对疾病或事故等原因所丧失或功能下降的内脏器官或组织，意图使其功能恢复、或使内脏器官或组织本身再生。在此组织工程学的领域中，正在对使干细胞或未分化细胞得以增殖、分化成目标细胞的培养条件或因素进行研究。一般而言，组织工程学需要细胞、生长因子及细胞赖以植入(engraft)的立足点三种要素。而且，于立足点上培养细胞并附加生长因子来构建再生组织的尝试仍在进行中。在组织工程学中，为了在形态上重建内脏器官或组织，作为细胞增殖之立足点，可使用聚合物等化学合成品，其亦称为“支架”(scaffold)。业已多次报导有下述方法通过将目标细胞播种于该支架上，并使其在活体外的适当环境下进行培养而增殖、分化成所需细胞，或将支架移植至意图使之再生的内脏器官或组织的缺损部位，在活体内使目标细胞增殖、分化成所需细胞，由此使细胞以三维构造增殖而使所需内脏器官再生(专利文献1、2)。然而，若无该支架，使细胞以三维构造增殖便极为困难。此外，使用通过化学合成制得的支架，即使能够模拟活体原本所具备之三维构造，也仍会有无法重现内脏器官或组织的缺点。现况在于即便使用支架来构建生物人工内脏器官，仍不能充分发挥内脏器官之功能，或无论有无支架，都难以构建生物人工内脏器官本身。胚胎干细胞(embryonic stem cell，以下亦仅称为“ES细胞”)是诱导自被称为“胚泡”(blastocyst)之初期胚的未分化细胞，为具有自我复制能力与分化的全能性的细胞。ES细胞能够仅通过作为活体外(in vitro)的集合块培养而分化成包括生殖细胞在内的各种细胞。当将ES细胞分化成细胞疗法等再生医疗中所必需之功能性细胞时，首先必须形成具有三维构造的胚体。作为用以使胚体形成的ES细胞培养方法，可例举悬滴法(非专利文献1)、悬浮培养(suspension culture)、采用含甲基纤维素的半固体培养基的培养及它们的组合等方法。近年来，慢性肾功能不全(慢性肾衰竭，chronic kidney failure)的患者数量与日俱增。慢性肾功能不全是由某原因而产生肾脏疾病或除肾脏外器官疾病的肾脏障碍所发展的病状，其会使正常肾脏所具有的除去血液中所含的尿毒素的功能、内分泌功能、调节功能等功能丧失。若慢性肾功能不全恶化，则由于正常肾脏的功能丧失，因此对体内的各内脏器官便会产生影响而形成尿毒症。具体而言会形成中枢神经障碍、周围神经障碍、心/心血管障碍、消化系统障碍、视力/眼睛障碍、血液凝固障碍、免疫障碍、内分泌障碍、皮肤疾病、骨/关节障碍、电解质障碍、酸碱平衡障碍等。慢性肾功能不全是进行性的(progressive)，而且无法治愈。因此，在治疗上主要着眼于延缓肾脏功能丧失速度的保守性治疗，而最终仍
4需要人工透析或肾脏移植等用于替代肾脏功能的治疗(例如专利文献3)。然而，由于可提供之肾脏数目绝对不足，肾脏移植难以实施。人工透析主要分为血液透析与腹膜透析两种，血液透析虽可除去血液中的尿毒素，却无法进行作为替代内分泌功能、调节功能等之治疗。而且，血液透析每周须进行三次左右，对患者而言负担甚大。腹膜透析由于可进行自我管理而使得患者能够减少问诊次数，但会产生例如患者容易发生代谢失调或对腹膜的负担变大等问题。关于肾脏，已公开有从大鼠肾脏分离具有高增殖能力的肾脏干细胞/前体细胞(precursor cell)，并由此取得细胞株确立(established)的 rKS(Rat Kidney Stem cellline) 56细胞株(专利文献4)。专利文献4中公开rKS56细胞株具有自我增殖能力；及在含有支持细胞(饲养细胞，feeder cell)培养液的体系中培养时，检测出血管内皮细胞标记(marker)而表明有分化成血管内皮细胞的可能性。亦公开其可分化成亨利氏环降支(descending limb of loop of Henle)细胞、近曲小管(proximal convoluted tubule,PCT)细胞、集尿管(collecting duct,⑶)细胞。然而，关于rKS56细胞，未曾有报导以不含支持细胞(饲养细胞)的体系使之分化的方法。此外，亦未有采用上述所分化之细胞来制造由三维构造构成的生物人工内脏器官的报导。此外，专利文献4 (特开2004-275079号公报)的公开内容以参照的方式并入本文。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2008-049146号公报专利文献2 日本特开2009-039401号公报专利文献3 日本特开平6-142193号公报专利文献4 日本特开2004-275079号公报非专利文献非专利文献1 J. Cell Biol. 126(3),701-711(1994)
发明内容
发明所要解决的问题本发明的目的在于提供一种将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，以及包含所得的组织细胞的生物人工内脏器官。另一目的在于提供一种包含所制造的生物人工内脏器官的医疗用材料。解决问题的方式本案发明人为解决上述问题而进行了深入的研究，结果发现通过在基本培养基含有胎牛血清、肝细胞生长因子、神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、骨形成因子7及上皮细胞生长因子的培养液中，在三维支架的存在下对干细胞进行培养，可使该干细胞分化成组织细胞，本发明由此得以完成。S卩，本发明涉及一种将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，上述分化诱导方法的特征为于基本培养基含有肝细胞生长因子(HGF)、神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、骨形成因子7(BMP7)及上皮细胞生长因子(EGF)的培养液中，在三维支架的存在下对干细胞进行三维培养。
此处，在本发明的分化诱导方法的一实施方式中，三维培养优选包含第一步骤，在含有HGF、GDNF及b-FGF的培养液中对上述干细胞进行培养；与第二步骤，从第一步骤的培养开始经过0 10天后，在含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中进行培养。此外，在本发明之分化诱导方法的一实施方式中，优选地在培养液中的HGF、GDNF、b-FGF及BMP7的浓度各独立选自100 500ng/ml、且EGF浓度选自300 700ng/ml的条件下进行培养。此外，在本发明之分化诱导方法的一实施方式中，优选在培养液中进一步含有血清。此外，本发明之分化诱导方法的干细胞优选为肾脏干细胞。本发明的分化诱导方法的一实施方式是包括以下步骤的分化诱导方法1)由所述干细胞形成三维细胞块的步骤；以及2)于含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中，在所述三维支架的存在下对上述细胞块进行三维培养的步骤。此处，上述步骤幻可含有第一步骤(步骤2A)，在三维支架的存在下于含有HGF、GDNF、b-FGF的培养液中对上述细胞块进行三维培养；与第二步骤(步骤2B)，从第一步骤的培养开始经过0 10天后，于含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中进行三维培养。此外，在上述步骤1)中，上述细胞块优选以悬滴法来形成。此外，根据本发明之另一实施方式，本发明涉及以上述分化诱导方法诱导而形成的组织细胞。此处，以本发明分化诱导方法诱导而形成的组织细胞，在一实施方式中可为肾组织细胞。此外，根据本发明之又一实施方式，本发明涉及包含上述组织细胞的生物人工内脏器官。此外，根据本发明之又一实施方式，本发明涉及包含生物人工内脏器官的医疗用材料。此外，根据本发明之又一实施方式，本发明涉及生物人工内脏器官的制造方法，上述制造方法的特征在于包含1)形成干细胞之细胞块的步骤；2)将所得细胞块播种于支架上的步骤；以及3)在支架上，于含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中对上述细胞块进行培养的步骤。此处，在一实施方式中，本发明的生物人工内脏器官可为生物人工肾脏。此外，根据本发明之又一实施方式，本发明涉及将干细胞分化诱导成具有类多囊性肾病变(polycystic kidney disease)形态的组织细胞的方法，上述分化诱导方法的特征在于包含1)由所述干细胞形成三维细胞块之步骤；以及2)于含有BMP7及EGF且未含有⑶NF、b_FGF或HGF中的至少一种的培养液中，在三维支架的存在下对由所述干细胞得到的三维细胞块进行三维培养之步骤。此外，本发明中，分化诱导成具有多囊性肾病变形态之组织细胞的方法，在一实施方式中，步骤中的培养液优选含有BMP7及EGF且未含有GDNF、b-FGF或HGF的任一者。
此外，根据本发明的又一实施方式，本发明涉及由分化诱导成具有上述类多囊性肾病变形态的组织细胞的方法诱导形成的具有类多囊性肾病变形态的组织细胞。发明效果通过本发明的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，可使未分化的细胞向组织细胞分化诱导而能够进一步构建三维构造。具体而言，通过本发明的方法可将肾脏干细胞/前体细胞分化成肾脏的远曲小管(distal convoluted tubule)细胞、肾小球(丝球体，glomerulus)细胞、近曲小管细胞等而能够进一步在活体外(in vitro)重建类肾脏构造。
图1为表示肾脏构造的示意图；图2为表示本发明分化诱导方法的示意图(实施例1)；图3为表示三维培养21天后培养形态的照片图。a为表示rKS细胞的细胞块于三维培养第21天的形态；b为表示后肾间质(metan印hric mesenchymak)干细胞于三维培养第21天的形态；c为表示输尿管芽细胞于三维培养第21天的形态(实施例1、实施例2)；图4为表示rKS细胞于三维培养21天后培养形态的照片图；A表示未辨认出管腔构造的状态；B表示未辨认出集合的类肾盏构造而具有类肾小球构造+类尿管构造的状态；C表示辨认出所有类肾小球构造、类输尿管构造、类肾盏构造的状态(实施例3)；图5为表示rKS细胞于三维培养21天后的各种形态的比例图，所述比例随制造rKS细胞块时所用的细胞数而变化；A、B及C与图4之说明相同(实施例3)；图6为表示制造rKS细胞块之际改变细胞数时，rKS细胞于三维培养第1天、第7天以及第21天的培养形态之照片图(实施例3)；图7为表示在各培养条件下rKS细胞于三维培养21天后培养形态之照片图；此外，m条件为表示三维培养4日后培养形态之照片(实施例4)；图8为表示rKS细胞于三维培养第4天之培养形态的照片图(实施例5)；图9为表示rKS细胞于三维培养第4天之培养细胞的表面标记的照片图(实施例1)；图10为表示rKS细胞于三维培养2周后之形态的照片图(实施例6)；图11为表示rKS细胞于三维培养3周后之形态的照片图(实施例6)；图12为表示rKS细胞于三维培养3周后之形态的照片图(实施例6)；图13为表示rKS细胞于三维培养3周后远曲小管之形态的显微镜照片图；图中之箭号表示初级纤毛(primary cilia)(实施例6)；图14为表示rKS细胞于三维培养3周后肾小球之形态的显微镜照片图(实施例2)；以及图15为表示rKS细胞于三维培养2周后近曲小管之形态的显微镜照片图(实施例6)。
具体实施例方式本发明涉及将干细胞分化诱导成内脏器官细胞的方法。本发明中干细胞是指具有只要受到转化成特定细胞的指示即分化成该特定细胞之能力的细胞。干细胞虽可分类成胚胎干细胞(ES细胞)、成体干细胞、胚胎生殖细胞等，但本发明的干细胞可为任何细胞。若由处理的容易度来考虑，则较适合使用成体干细胞或胚胎生殖细胞。成体干细胞(adult stem cell)是指从活体内的组织中采集的处在分化前的状态的细胞。该组织中亦包含业已分化的成熟细胞以及未分化细胞，即干细胞。成体干细胞能够复制和制造出与自身相同之细胞，也可通过分化来制造其所存在之组织内的各种个体细胞。作为可在本发明中使用的干细胞，可以使用通过以往公知方法从活体内的组织分离的干细胞或前体细胞，具体而言可举出例如专利文献4所述之肾脏干细胞/前体细胞。在本案说明书及权利要求范围中，所谓“干细胞”的表述应解释为广义上的概念，不仅为干细胞，也包括前体细胞。所述“干细胞/前体细胞”的表述适当地用于表示广义上的“干细胞”概念之含义。本发明的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法所使用的三维培养用的培养液，其特征为在基本培养基中含有胎牛血清(以下为“FCS”)、肝细胞生长因子(以下为“HGF”)、神经营养因子(以下为“GDNF”、碱性成纤维细胞生长因子(以下为“b-FGF”)、骨形成因子7(以下为“BMP7”)及上皮细胞生长因子(以下为“EGF”)。含于培养液的FCS浓度可为约10% ν/ν。此外，所含的HGF浓度可选自100 500ng/ml、优选为200 400ng/ml，更优选为250ng/ml。此外，所含GDNF浓度可选自100 500ng/ml、优选为200 400ng/ml，更优选为250ng/ml。此外，所含b_FGF浓度可选自100 500ng/ml、优选为200 400ng/ml，更优选为250ng/ml。此外，所含的BMP7浓度可选自100 500ng/ml、优选为200 400ng/ml，更优选为250ng/ml。此外，所含EGF浓度可选自300 700ng/ml、优选为400 600ng/ml，更优选为500ng/ml。如上所述，在实施方式中，本发明的分化诱导方法包含1)由所述干细胞形成三维细胞块的步骤；以及2)于含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中，在三维支架的存在下对上述细胞块进行三维培养的步骤；当在上述步骤2)包含第一步骤(步骤2A)，即在三维支架的存在下，于含有HGF、GDNF, b-FGF的培养液中对上述细胞块进行三维培养，与第二步骤(步骤2B)，即从第一步骤的培养开始经过0 10天后，于含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中进行三维培养时，例如如以下所述，可对第一步骤与第二步骤的培养液中各成分的优选浓度进行设定。亦即，为了达到上述各优选浓度，可通过组合FCS、HGF、⑶NF、b-FGF来制备第一步骤的培养液。又可在第一步骤的培养液中添加BMP7及EGF，以成为上述优选的最终浓度，由此来制备第二步骤的培养液。此处，作为培养液的基本培养基优选使用DMEM/F12培养基。然而，基本培养基并未限定于此，亦可使用本领域中所公知的基本培养基。培养液中也可视需求进一步适当添力口青霉素(penicillin)或链霉素(streptomycin)等抗生素。本发明的将干细胞分化诱导成组织细胞，可通过采用上述培养液在三维支架的存在下进行三维培养来达成。在进行三维培养之际，优选先包括由干细胞形成三维细胞块的步骤。更具体而言，依据包含以下步骤的方法1)由干细胞形成三维细胞块的步骤；以及2)于含有FCS、HGF、OTNF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中，在三维支架的存在下对所得细胞块进行三维培养的步骤。在上文中，三维细胞块的制造方法并未特别限定，但可通过例如悬滴法来制造。悬滴法可例举如以下所示方法通过利用以下所示的用于制造三维细胞块的溶液(细胞块制造溶液)而制备含有本发明干细胞的细胞悬浮液，再将该细胞悬浮液置于培养容器之盖等处，并将其翻转以使所放置的细胞悬浮液垂滴下来以进行培养。具体而言，相对于50μ 1细胞块制造溶液，可制备含1 X IO4 1 X IO6个、优选含5 X IO4 5 X IO5个、更优选含1 X IO5 2Χ IO5个细胞的细胞悬浮液。用于使细胞块形成的培养时间优选为约6 10小时左右。在培养时间短于6小时的时间内，将可能无法获得足够的细胞块，而在超过10小时的情况下，则所形成的细胞块可能会崩解，故优选在37°C下培养6 10小时。由悬滴法所制造的细胞块，在干细胞为ES细胞时可形成为胚状体(embryoid body，EB体)。此处胚状体是指用以将ES细胞分化诱导成各类组织而形成的胚胎，且EB体的形成即成为在活体外(in vitro)的ES细胞的分化诱导中的第一步骤(first step)。一般认为通过使三维细胞块形成，与细胞分化相关的细胞间的信号(signal)便产生作用，更能够使得干细胞较易于分化。在上文中，在制造三维细胞块时优选使用例如于基本培养基中含有FCS、胰岛素、转铁蛋白(transferrin)、硒、地塞米松(dexamethasone)、HGF及b_FGF的溶液。此处，基本培养基优选使用DMEM/F12培养基，但基本培养基并未限定于此，亦可使用本领域中所公知的基本培养基。此外，作为含有胰岛素、转铁蛋白与硒的溶液，可使用市售ITS-miX(GibC0公司制造)。溶液中所含的血清(例如FCS)浓度可为约10% ν/ν。此外，所含胰岛素浓度可为1 10g/ml、更优选为约5g/ml。所含转铁蛋白浓度可为1 5g/ml、更优选为约2. 75g/ml。此外，所含硒(亚硒酸钠，Sodium Selenite)浓度可为1 5ng/ml、更优选为约3. 35ng/ml。所含地塞米松浓度可为1 10X10_8M、更优选为5X1(^M。此外，所含HGF浓度可为1 100ng/ml、更优选为5ng/ml。所含b_FGF浓度则为1 100ng/ml、更优选为25ng/ml。本溶液中亦可视需求进一步适当添加青霉素或链霉素等抗生素。本发明的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法中，可于上述三维培养用培养液中、于三维支架的存在下对干细胞进行培养。更优选可使用上述三维培养用培养液对由上述干细胞所形成的三维细胞块进行培养。用以进行三维培养的培养也可在含有上述干细胞之的培养液即含FCS、HGF、⑶NF与b-FGF、BMP7以及EGF的培养液中进行培养，也可在下述条件下进行培养将三维培养分为两阶段，并预先于含有上述各浓度的FCS、HGF、GDNF及b_FGF的培养液中进行培养，经过0 10天后，进一步在含有FCS、HGF、⑶NF、b-FGF的培养液中含有上述各浓度的BMP7及EGF，在此条件下进行培养。当将三维培养分为两阶段时，可从作为第一步骤(步骤2A)的采用含有FCS、HGF、⑶NF、b-FGF的培养液的培养开始，优选经过1 8天后、更优选经过4 7天后，于除含有FCS、HGF、⑶NF、b-FGF之外还含有BMP7及EGF的培养液中进行作为第二步骤(步骤2B)的培养。通过在上述优选时间内将第一步骤的培养液变成第二步骤的培养液，可提升分化诱导率。亦可通过施加浓度梯度的方式使BMP7及EGF添加浓度缓缓持续增力口，以使BMP7及EGF最终达到上述浓度。可以举出以下方法例如在培养用双腔室(doublechamber)的下部添加含有HGF、⑶NF及b_FGF的培养液且在上部添加含有BMP7及EGF的培养液，在于下部培养液中对上述干细胞进行培养的同时，渐渐将上部中含有BMP7及EGF的培养液转移至下部，由此来制造BMP7及EGF的浓度梯度；等等。
而且，尽管本说明书中主要记载了 FCS作为将干细胞分化诱导成组织细胞的方法采用的培养液中所含的血清，但基本培养基所使用的血清并非限定于FCS，也可使用其他牛血清或人血清等可达成期望功效的本领域公知的血清。作为本发明中所采用的三维支架的材料，只要是本领域中所公知者并无特殊限定，可使用例如基于胶原蛋白的材料(collagen-based materials)、聚己内酯或聚乙醇酸等基于聚合物的材料或者其复合体。此外，关于其形态亦无特殊限定，可举出例如海绵状构造物等。此外，三维支架亦可用来自活体的试料(例如细胞外基质(matrix)或基底膜等)作为材料。具体而言可例举 Matrigel (Becton，Dickinson and Company)、type I 胶原蛋白凝胶、type IV胶原蛋白凝胶等。本发明亦延伸至通过将干细胞分化诱导成组织细胞的方法而得到的组织细胞，且亦延伸至由该组织细胞所形成的生物人工内脏器官。例如，所使用的干细胞为肾脏干细胞/前体细胞时，所得组织细胞则为肾脏细胞，由该组织细胞所形成的生物人工内脏器官便为生物人工肾脏。肾脏干细胞/前体细胞的取得方法虽无特殊限定，但可遵循例如专利文献4所述的方法。本发明亦涉及包含如此方式所制造的生物人工内脏器官的医疗用材料。实施例以下，为了深入理解本发明而示出实施例并具体说明本发明，但这些实施例不构成对本发明范围的限定。人体中的腹腔背侧存在两个肾脏，其各自具有延伸至膀胱的输尿管，为生成、分泌荷尔蒙和生成尿液的内脏器官，主要具有排泄功能、内分泌功能与调节功能。肾脏内存在约一百万个称为“肾元”(η印hron)的基本构造，并包含有将含有代谢废物的水分自血液过滤并生成原尿的肾小球。在肾小球生成的原尿通过近曲小管、亨利氏环、远曲小管、集尿管而向输尿管运送。在近曲小管(Si 分段1、S2 分段2、S3 分段幻、亨利氏环、远曲小管处，钠和水分等被再次吸收，并使促红细胞生成素(erythropoietin)或维生素D3活化。此外，在肾元的周围存在有间质细胞等。原尿向输尿管运送前被浓缩约一百倍之后，便通过输尿管而运送至膀胱，自膀胱向体外排泄(参照图1)。肾脏系从间质中胚层(intermediate mesoderm)生成，经过前肾、中肾、后肾三阶段而形成。哺乳动物中，前肾及中肾随后几乎退行变性(retrograde degeneration),主要由后肾来生成肾脏。后肾是在中肾最尾侧所产生的称为“输尿管芽”的突起的周围使间叶细胞集合而生成。然后，输尿管芽与间叶细胞互相作用，间叶细胞进行上皮形成(epithelialization)后经过称为“S字形体”的状态，由此生成肾小球、近曲小管、亨利氏环、远曲小管。此外，集尿管及输尿管上皮细胞等分化自输尿管芽。<实施例1>采用肾脏干细胞/前体细胞之三维培养以悬滴法对肾脏干细胞/前体细胞进行培养，将所得之细胞块培养于由Matrigel所构成的支架内来进行三维培养(参照图2)。1)肾脏干细胞/前体细胞通过专利文献4所述之方法从近曲小管的S3区域将其分离，并以脂质转染法(Iipofection)导入SV40基因来对所得的高增殖能力细胞进行细胞株确立，而所得的细胞株确立的细胞便为本实施例的肾脏干细胞/前体细胞，以下称为“rKS56细胞”。2)rKS56细胞之细胞块的制造
在DMEM/F12培养基中制备由FCS (最终浓度10% v/v)、ITS-mix (Gibco公司制造)QOO μ 1)、地塞米松(最终浓度5 X 10_8Μ)、HGF (最终浓度5ng/ml)与b_FGF(最终浓度25ng/ml)所构成的溶液。于上述溶液50 μ 1中制备含有约1 X IO5个rKS56细胞的细胞悬浮液，在96孔微培养板(microplate)之盖的内侧承载上述细胞悬浮液，恢复原状后进行悬滴法。在37°C下进行培养6 10小时即制造出rKS56细胞之细胞块(参见图3)。3)rKS56细胞的三维培养在将DMEM/F12 培养基及 Matrigel (Becton，Dickinson and Company)以1 : 1 混合的溶液中，制备添加有FCS (最终浓度10% v/v)、HGF (最终浓度250ng/ml)、⑶NF (最终浓度250ng/ml)、b-FGF(最终浓度250ng/ml)的培养液。最初，作为三维培养步骤的第一步骤(步骤2A)，使用含有当作支架的Matrigel 的上述培养液，在M孔Transwell (康宁(Corning)公司；Cat#3470)的每个孔中播种一个以上述2)所制造的细胞块，在37°C下培养5 7天。其后，作为三维培养的第二步骤(步骤2B)，在含有FCS、HGF、⑶NF、b-FGF 的上述培养液中额外添加有BMP7(最终浓度250ng/ml)及EGF(最终浓度500ng/ml)的培养液内于37°C下培养约四周。作为一实施例，培养液从第一步骤(步骤2A)向第二步骤 (步骤2B)的变化，是对于将含有FCS、HGF、⑶NF、b-FGF的上述培养液添加400 μ 1于M 孔Transwell的每个孔中的状态，通过添加2 μ 1的50 μ g/ml BMP7高浓度溶液和2 μ 1的 100 μ g/ml EGF高浓度溶液来进行。三维培养第21天的培养形态示于图3a。<实施例2>采用肾脏干细胞/前体细胞之三维培养除了采用后肾间质干细胞(metan印hric mesenchymak)或输尿管芽细胞取代 rKS56细胞进行培养之外，以与实施例1相同之方法来进行培养。关于各个三维培养第21 天的培养形态示于图北及3c。<实施例3>随用于制造rKS56细胞之细胞块的细胞数而变的培养细胞形态除了改变采用rKS56细胞来制造细胞块之际所使用的各种细胞数之外，通过与实施例1相同的方法来对细胞进行培养，并确认此时各种细胞形态的出现频率。图4中A表示未辨认出管腔构造的状态，B表示未辨认出集合的类肾盏构造、但可辨认出类肾小球构造与类输尿管构造的状态，C则表示辨认出所有类肾小球构造、类输尿管构造、类肾盏构造的状态。作为上述的结果，如图5所示，在rKS56细胞之细胞块制造的细胞数较低时，对肾组织充分的分化诱导频率较低，随着细胞数提升，便可确认出其对肾组织充分的分化诱导能力。具体而言，已对图6所示之细胞的培养形态进行确认。图6中，制造rKS56细胞块时的细胞数在a)、g)及m)中为6. 25X 103个、在b)、h)及η)中为1. 25 X IO4个、在c)、i) 及ο)中为2.5X104个、在d)、j)及ρ)中为5. OX IO4个、在c)、k)及q)为1.0X IO5个、以及在f)、1)及r)中为2. OX IO5个。此外，将培养第1天的形态示于a)、b)、c)、d)、e)及 f)、培养第7天的形态示于g)、h)、i)、j)、k)及1)、以及培养第21天的形态示于m)、η)、 ο)、ρ)、q)及 r) ο<实施例4>关于改变三维培养之培养基的条件时的培养细胞形态确认对与实施例1所述细胞块的制造方法相同的方法所制造的rKS56细胞的细胞块进行二维培养时、或改变各种培养液组成来进行三维培养时的各种细胞形态。
培养是在以下a) ρ)之条件下进行。于各培养液中添加的青霉素及链霉素。 此外，本实施例中，在a)培养液中进行培养时，是在未使用支架的情况下来进行二维培养。 细胞块的三维培养是在以其他组成的培养液培养细胞时进行。此外，细胞块的二维培养及三维培养并未分成两阶段，从培养开始时即在含有所有各种组分的培养液中进行培养。1)各培养液a)DMEM/F12 + 10 % FCS+GDNF (250ng/ml) +b-FGF (250ng/ml) +HGF (250ng/ ml)+EGF(500ng/ml)+BMP7(250ng/ml)b)DMEM/F12+10% FCSc)DMEM/F12+10% FCS+⑶NF Q50ng/ml)d) DMEM/F12+10% FCS+b-FGF (250ng/ml)e)DMEM/F12+10% FCS+HGF (250ng/ml)f) DMEM/F12+10 % FCS+⑶NF (250ng/ml) +b-FGF (250ng/ml) +HGF (250ng/ml)g) DMEM/F12+10% FCS+EGF (500ng/ml)，此培养液中的变化h) DMEM/F12+10% FCS+BMP7 (250ng/ml)i)DMEM/F12+10% FCS+EGF (500mg/ml) +BMP7 (250ng/ml)j)DMEM/F12 + 10 % FCS+GDNF (250ng/ml) +b-FGF (250ng/ml) +HGF (250ng/ ml)+EGF(500ng/ml)+BMP7(250ng/ml)k) DMEM/F12+10% FCS+ 激活素(activin) (250ng/ml)1)DMEM/F12+10% FCS+ 卵泡抑素(follistatin) (250ng/ml)m) DMEM/F12+10 % FCS+EGF (lOOOng/ml) +BMP7 (250ng/ml)n)DMEM/F12+10% FCS+HGF Q50ng/ml) +激活素 Q50ng/ml)o) DMEM/F12+10 % FCS+LIFsR α (250ng/ml)p)DMEM/F12+10% FCS+ 肾连蛋白(nephronectin) (250ng/ml)2)培养21天后的培养形态结果以下表示在各条件下培养21天后的观察结果(参照图7)。此外，就m)条件而言， 因物流供给方面的原因，仅表示培养第4天的观察结果。于a)培养条件下，显示出若未进行三维培养则未进行形态形成(显示细胞形态已改变、分化)。于b)培养条件下，确认若未加入生长因子则未进行形态形成。于c)培养条件下，确认仅添加GDNF即可形成数个长管腔构造。于d)培养条件下，确认仅添加b-FGF即可形成粗管腔构造。于e)培养条件下，确认仅添加HGF虽可形成管腔构造等，但形态却不完整。于f)培养条件下，在含有HGF、GDNF及b_FGF的培养液中可相对地确认形态形成。 确认管腔构造的粗细不清晰，在含有后续的EGF或BMP7的培养液中，所培养者较易形成接近正常的肾脏。于g)培养条件下，确认仅添加EGF即易于形成弯曲管腔构造。于h)培养条件下，确认在前端形成有许多类肾小球构造。于i)培养条件下，确认块中形成有囊状(cystic)物，并确认为多囊性肾病变形态。
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于j)培养条件下，确认为接近肾脏形态的形态。于k)培养条件下，确认完全无变化。于1)培养条件下，确认弯曲的粗管腔构造。(无类肾小球构造)于m)培养条件下，确认块中形成有囊状物，相较于i)的多囊性肾病变形态，确认为形成更加清晰的形态。于η)培养条件下，在含有HGF及激活素的培养液中确认可于其一部分形成管腔构造。于ο)培养条件下，确认完全无变化。于ρ)培养条件下，确认完全无变化。以上可确认，形态形成会因条件而异，特别是i)及m)可确认出多囊性肾病变形态。具有此等多囊性肾病变形态的组织细胞作为病变模型是有用的。此类病变模型能作为生物分析工具实际应用于，在通过活体内施用等来测试新药剂对肾功能的损害之前，在活体外就损害部位进行研究，例如关于用以治疗多囊性肾病变的治疗药物，其可作为新颖药剂之筛检、化验的材料来利用。<实施例5>培养第4天的三维培养形态的确认及各种标记的确认在通过与实施例1相同方法进行培养时，将细胞在形成类多囊性肾病变条件或类肾脏构造的条件下进行三维培养。结果，于培养第4天可以观察到类输尿管芽细胞(UB) 及其周围的类后肾间叶细胞(MM)(参照图8)。此外，“匪条件”是指形成类肾脏构造的条件，“UB条件”则指形成类多囊性肾病变的条件。以实时定量聚合酶连锁反应(Real Time-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)方法来对UB及MM的细胞表面的各种标记进行确认。就各种标记，将用于进行RT-PCR的引物(primer)示于表1。表1
权利要求
1.一种将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其特征在于于基本培养基含有肝细胞生长因子(HGF)、神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、骨形成因子7(BMP7)及上皮细胞生长因子(EGF)的培养液中，在三维支架的存在下对所述干细胞进行三维培养。
2.如权利要求1所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，所述三维培养包括第一步骤，在含有HGF、GDNF及b_FGF的培养液中对所述干细胞进行培养；与第二步骤，从第一步骤的培养开始经过0 10天后，在含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中进行培养。
3.如权利要求1或2所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，在所述培养液中的HGF、⑶NF、b-FGF及BMP7的浓度各独立选自100 500ng/ml、且EGF浓度选自300 700ng/ml的条件下进行培养。
4.如权利要求1至3中任一项所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，在所述培养液中进一步含有血清。
5.如权利要求1至4中任一项所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，所述血清为胎牛血清(FCS)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，所述干细胞为肾脏的干细胞。
7.一种将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，包括以下步骤1)由所述干细胞形成三维细胞的步骤；以及2)于含有HGF、GDNF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中，在三维支架的存在下对所述细胞块进行三维培养的步骤。
8.如权利要求7所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，所述步骤幻包含第一步骤，在三维支架的存在下，在含有HGF、GDNF, b-FGF的培养液中对所述细胞块进行三维培养；第二步骤，从第一步骤的培养开始经过0 10天后，在含有HGF、⑶NF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中进行三维培养。
9.如权利要求7或8所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，在所述培养液中的HGF、GDNF、b-FGF及BMP7浓度各独立选自100 500ng/ml、且EGF浓度选自300 700ng/ml的条件下进行培养。
10.如权利要求7至9中任一项所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，在所述步骤幻的培养液中进一步含有血清。
11.如权利要求7至10中任一项所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法，其中，在所述步骤1)中，所述细胞块以悬滴法形成。
12.—种组织细胞，其通过权利要求1至11中任一项所述的将干细胞分化诱导成组织细胞的方法诱导而形成。
13.如权利要求12所述的组织细胞，其中，通过将干细胞分化诱导成组织细胞的方法诱导而形成的组织细胞为肾组织细胞。
14.一种生物人工内脏器官，其含有权利要求12或13所述的组织细胞。
15.一种医疗用材料，含有权利要求14所述的生物人工内脏器官。
16.一种生物人工内脏器官的制造方法，包括以下步骤.1)形成干细胞的细胞块的步骤；.2)将所得细胞块播种于支架上的步骤；以及.3)在所述支架上，在含有HGF、GDNF、b-FGF、BMP7及EGF的培养液中对所述细胞块进行培养的步骤。
17.如权利要求16所述的生物人工内脏器官的制造方法，其中，所述生物人工内脏器官为生物人工肾脏。
18.一种将干细胞分化诱导成具有类多囊性肾病变形态的组织细胞的方法，包括以下步骤.1)由所述干细胞形成三维细胞块的步骤；以及.2)在含有BMP7及EGF且未含有⑶NF、b_FGF或HGF中的至少一种的培养液中，在三维支架的存在下对所得干细胞的三维细胞块进行三维培养的步骤。
19.如权利要求18所述的将干细胞分化诱导成具有类多囊性肾病变形态的组织细胞的方法，其中，所述步骤2)中的培养液含有BMP7及EGF且未含有GDNF、b-FGF或HGF中的任一种。
20.一种具有类多囊性肾病变形态的组织细胞，其通过权利要求18或19所述的将干细胞分化诱导成具有类多囊性肾病变形态的组织细胞的方法诱导所形成。
全文摘要
本发明在于提供一种从干细胞分化诱导成组织细胞之方法，以及包含所得之组织细胞的生物人工内脏器官。进一步在于提供一种包含所制造之生物人工内脏器官的医疗用材料。解决方式为利用具有增殖能力、自我复制能力、分化能力的干细胞并通过悬滴法(hanging drop method)来进行培养，由此以三维方式构建胚体(embryonic body)细胞块，并通过在HGF、GDNF、b-FGF、BMP7及EGF的存在下，对所述细胞块进行培养即可分化成组织细胞。又可使用分化成组织细胞的细胞来制造生物人工内脏器官，而能够进一步提供医疗用材料。
文档编号C12N5/071GK102597220SQ201080036500
公开日2012年7月18日 申请日期2010年8月11日 优先权日2009年8月17日
发明者喜多村真治, 槙野博史 申请人:株式会社器官再生工学