专利名称：经由植物转录的分子预防和治疗有益昆虫的疾病的制作方法
经由植物转录的分子预防和治疗有益昆虫的疾病发明领域和背景本发明涉及使用RNA干扰技术降低有益昆虫对于致病生物体的易感性的组合物和方法，且更特别地，涉及表达dsRNA的植物在预防和治疗蜜蜂感染中的用途。有益昆虫和昆虫病原体蜜蜂和其它传粉昆虫对于全世界经济的重要性远超过它们在蜂蜜生产方面的贡献。美国农业部(USDA)估计在我们的食物中我们消耗的每隔两次咬食都依赖于蜜蜂对该食品的传粉。传粉在对于果实作物的增值方面的总贡献每年超过150亿美元，且间接潜在的结果为750亿美元。人类社会的空前的影响，即单种栽培和技术、农药的过度使用和全球变暖及随后出现的疾病，全都导致专家所谈及的地球物种的第六次大灭绝。反过来这已经引起有益昆虫的数量的灾难性下降，其中最严重地影响着传粉昆虫例如蜜蜂。实际上，在美国已经存在对农业的巨大冲击以及对人的食物链的威胁，其直接的结果是被称为蜜蜂的蜂群崩溃失调病(CCD)，其特征为自其成年蜜蜂群体的快速损失。从2006年起全世界的蜜蜂群体的减少已达到每季损失25-30%或更多，其重要的部分归因于蜂群崩溃失调病(CXD)。有益昆虫，例如用于传粉的蜜蜂或熊蜂，以及用于生物防治方案的害虫的对手，例如寄生蜂，全都具有引起它们多种疾病的一系列的害虫和病原体。这些疾病降低了它们繁殖力并因此降低它们作为有益昆虫的能力。对于蜜蜂，这些包括大量的寄生虫和病原体，包括病毒、细菌、原生动物、体内寄生虫和螨，每种都有传播的特征模式。CXD已经与以色列急性麻痹病毒(IAPV)关联。变弱的群体还对于与其它病原体例如病毒[例如残翅病毒(DWV)、克什米尔蜜蜂病毒(KBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV)]、细菌(例如蜂房球菌(Melissococcus pluton)，欧洲蜂幼虫腐臭病)和微孢子目(例如微孢子虫(Nosema))相关的机会感染更加易感。此外，害虫(例如寄生的瓦螨(Varroa))的感染使蜜蜂变弱并破坏保护性的昆虫外骨骼，使它们易受由致病物种的进一步感染。已使用控制这些感染的化学方法，例如用于微孢子虫感染的烟曲霉素和用于瓦螨的拟除虫菊酯和有机磷酸酯杀螨剂。它们不仅不能根除病原体和害虫，而且引起毒性和蜜蜂的蜂蜜污染的严重风险。使用siRNA/dsRNA沉默的方法已经显示在各种各样的物种(包括植物)中RNA干扰(dsRNA和siRNA)在使基因表达沉默中有效的，并且与植物和动物中的癌症、遗传疾病、传染病有广泛的关联。已经在多种生物体中显示dsRNA或它们的siRNA衍生物可用于遏止、延迟或甚至预防多种病原体， 最显著地是病毒疾病(参见例如，Tenllado等的W0/2003/004649)。在一些物种中已经显示RNAi介导的干扰从dsRNA递送的起始位点扩散，在整个注射的动物中产生干扰表型。最近已经在蜜蜂幼虫中证实dsRNA的相同的扩散效应，以及在人、小鼠和秀丽隐杆线虫(C. elegans)中检测到被认为参与内吞吸收和dsRNA的扩散效应的 SID 跨膜通道(Aronstein 等，J. Apic Res and Bee World, 2006 ；45 :20-24)。
已建议将RNA干扰技术应用于昆虫，所述昆虫为植物害虫和其它植物害虫。已经证实通过喂养使昆虫基因适度的RNAi型沉默(Turner等，hsect Mol Biol 2006 ； 15 383 ；和Araujo等，hsect Mol. Biol2006 ;36 :683)。经蜂蜜的dsRNA吸收也已经被证实 (Aronstein φ, J Apiculture Res Bee World 2006 ；45 :20-24)。美国专利No. 6，326，193涉及使用重组昆虫病毒例如表达dsRNA的杆状病毒以沉默选择的昆虫基因用于害虫防治。PCT申请W099/3^19描述了使用dsRNA来减少由植物病原体或害虫(例如蜘蛛、昆虫、线虫、原生动物、细菌或真菌)引起的作物破坏。PCT专利申请TO 2004/005485描述了设计以控制植物-寄生线虫的RNAi序列和转基因植物。美国专利申请200301M508描述了用针对阳离子-氨基酸转运体/通道蛋白的 dsRNA来防治害虫。PCT专利申请WO 02/14472描述了在吸式昆虫中用于抑制靶基因表达的反向重复和正义或反义核酸。美国专利申请20030150017描述了与植物害虫例如线虫和昆虫的核苷酸序列同源的或互补的RNA分子的用途。Raemakers 等(PCT 申请 WO 2007/080127 和 WO 2007/080126)已经公开了表达 RNAi的转基因植物，所述转基因植物用于防治由昆虫、线虫、真菌和其它植物害虫引起的害虫感染。其中教导的这些序列是靶向昆虫(包括蜜蜂)的必需基因的序列。Waterhouse等 (美国专利申请20060272049)和Van De Craen (美国专利申请No. 2010068172)也公开了表达针对植物昆虫害虫的必需基因的dsRNA的转基因植物，所述转基因植物用作农药和杀虫齐IJ。BoiAharov等(美国专利申请20070250947)公开了在转基因植物中用于靶向植物寄生线虫的dsRNA。虽然证实了 dsRNA的表达和加工，但未显示实际地用dsRNA抑制感染。最近，Paldi等证实通过蜜蜂摄取IAPV-dsRNA片段引起病毒RNA降解并成功地使IAPV感染沉默和防止蜜蜂死亡(PCT申请W02009/060429)，并且微孢子虫特异性的 dsRNA可特异性地和差异性地使ADP/ATP转运基因表达沉默(Paldi等，Applied Environ Microbiol, Epub，2010 年 7 月 9 日)。尽管可通过在蜜蜂饲料中提供dsRNA来促进将dsRNA直接应用于商业生长的蜜蜂，如Paldi等所描述(PCT申请W02009/060429)，但没有方法来保护蜜蜂的野生种群，它们在世界的多数地方仍是作物传粉的主力。因此，存在对有益昆虫提供保护它们免受病原性致病因子的改进的方法的需要。发明概述根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含表达下调昆虫病原体的基因产物表达的核酸因子的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接至植物中的可操作的顺式调控元件。根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含以下核酸构建体的细胞，所述核酸构建体包含表达下调昆虫病原体的基因产物表达的核酸因子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至植物中的可操作的顺式调控元件。根据本发明的一些实施方案，所述细胞为植物细胞。根据本发明的一些实施方案，所述细胞为农杆菌(Agrobacterium)。根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了表达以下核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含表达下调昆虫病原体的基因产物表达的核酸因子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至植物中的可操作的顺式调控元件。
根据本发明的一些实施方案，所述植物为选自芸苔(rapeseed)、苜蓿(alfalfa) 和三叶草(clover)的开花植物。根据本发明的一些实施方案，所述植物在花蜜腺组织、花外蜜腺或花粉中表达该核酸构建体。根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了降低昆虫对于由昆虫病原体引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括对所述昆虫提供表达以下核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含表达下调昆虫病原体的基因产物表达的核酸因子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至植物中的可操作的顺式调控元件，以使得该昆虫取食该植物并摄取该核酸因子，由此降低该昆虫对于病原体的易感性。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为传粉昆虫或植食性昆虫。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为蜜蜂并且所述植物表达与选自SEQ ID NO :60-252698,252699-256728和256782_266洸0的核酸序列互补的核酸因子。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为蜜蜂并且所述植物表达与选自SEQ ID NO :55-59、253194、254090、25拟89、256752、256761 和 256762 的核酸序列互补的核酸因子。根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于降低蜜蜂对于由昆虫病原体引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括对所述蜜蜂提供表达以下核酸构建体的植物， 所述核酸构建体包含表达下调IAPV、微孢子虫和/或瓦螨蜜蜂病原体的基因产物表达的核酸因子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至植物中的可操作的顺式调控元件，以使得该蜜蜂取食该植物并摄取该核酸因子，由此降低该蜜蜂对于病原体的易感性。根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了降低蜜蜂对于蜂群崩溃失调病 (CCD)的易感性的方法，所述方法包括对所述蜜蜂提供表达以下核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含表达下调IAPV、微孢子虫和/或瓦螨蜜蜂病原体的基因产物表达的核酸因子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至植物中的可操作的顺式调控元件，以使得该蜜蜂取食该植物并摄取该核酸因子，因此降低该蜜蜂对于病原体的易感性。根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生能够降低取食该植物、植物组织或植物分泌物的昆虫对于由昆虫病原体引起的疾病的易感性的植物的方法，所述方法包括用下调IAPV、微孢子虫和/或瓦螨蜜蜂病原体的基因产物表达的核酸因子转化该植物的细胞，该多核苷酸可操作地连接至植物中的顺式调控元件；选择表达昆虫病原体特异性的dsRNA的转化的植物或植物细胞；并繁殖该植物或植物细胞以产生能够降低取食该植物的昆虫的易感性的植物或植物细胞。根据本发明的一些实施方案，所述核酸因子选自dsRNA、反义RNA和核酶。根据本发明的一些实施方案，所述dsRNA选自siRNA、shRNA和miRNA。根据本发明的一些实施方案，所述顺式调控元件在花蜜腺组织、花外蜜腺和/或花粉中是活性的。根据本发明的一些实施方案，所述核酸因子的长度大于15个碱基对。根据本发明的一些实施方案，所述核酸因子的长度为19至25个碱基对。根据本发明的一些实施方案，所述核酸因子的长度大于30个碱基对。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为蜜蜂。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫病原体选自病毒、细菌、寄生原生动物、真菌、线虫和螨。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫病原体为病毒。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为蜜蜂且所述病毒为以色列急性麻痹病
ο根据本发明的一些实施方案，所述核酸因子与SEQ ID NO :256752、256761、256762 和311552中任一种所列的病毒核酸序列互补。根据本发明的一些实施方案，所述核酸因子与SEQ ID NO :256782466260中任一种所列的病毒核酸序列互补。根据本发明的一些实施方案，所述核酸序列如SEQ ID NO :311533中所列。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为蜜蜂且所述病原体为微孢子虫寄生虫。根据本发明的一些实施方案，所述核酸因子与SEQ ID NO =55-252698所列的微孢子虫核酸序列互补。根据本发明的一些实施方案，所述微孢子虫寄生虫为东方蜜蜂微孢子 (N. cerana)，且所述基因产物为编码微孢子虫ATP/ADP转运蛋白或其同源物的mRNA。根据本发明的一些实施方案，所述ATP/ADP转运蛋白或其同源物选自由SEQ ID NO :44、45、46和47编码的蛋白质。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为蜜蜂且所述病原体为狄斯瓦螨(Varroa destructor mite)0根据本发明的一些实施方案，所述基因产物为编码选自NADH脱氢酶亚基2、ATP 合成酶亚基8、ATP合成酶亚基6、钠通道和细胞色素氧化酶亚基I的多肽的瓦螨特异性的 mRNA。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为蜜蜂且所述核酸构建体包含至少两种核酸因子，所述核酸因子中的每一种下调至少一种蜜蜂病原体的至少一种基因产物的表达。根据本发明的一些实施方案，所述昆虫为蜜蜂且所述至少一种蜜蜂病原体选自病毒、细菌、寄生原生动物、真菌、线虫和螨。根据本发明的一些实施方案，所述至少一种蜜蜂病原体包括至少两种蜜蜂病原体。根据本发明的一些实施方案，所述核酸因子对应于在所述至少两种蜜蜂病原体中的保守序列。除非另外限定，否则本文使用的所有的技术和/或科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意思相同。尽管与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可用于实施或检验本发明的实施方案，但示例性方法和/或材料在下文进行描述。在矛盾的情况下，以包括定义在内的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅为描述性的而并非旨在必然限制性。附图简述本文仅以实例的方式参考附图描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参考附图，需强调的是细节以实例的方式显示且出于本发明的实施方案的示例性论述的目的。 在这一点上，与附图一起的描述使得如何实践本发明的实施方案对于本领域技术人员来说显而易见。
附图中
图1为携带分别编码IAPV-特异性的dsRNA及其反向重复的插入片段的质粒 ρJETCPsetl 和 pJETCPset2 的示意图；图2为质粒pRNA69CPsetl的示意图；图3为显示使用T7引物从pRNA69CP-IR的IAPV-特异性的dsRNA的转录的示意图；图4为来自显示合适大小的dsRNA产物的pRNA69CP_IR的转录产物的凝胶分析； 泳道1为分子量大小梯度。泳道2-内源性蜜蜂RNA(单链)(完全降解)+RNA酶A。泳道 3-pRNA IR-CP#1 的转录产物，无 RNA 酶 Α。泳道 4-pRNA IR_CP#1+RNA 酶 A 的 dsRNA 转录产物。泳道5-pRNA IR-CP#2+RNA酶A的dsRNA转录产物。泳道6-内源性蜜蜂 RNA(单链)+DICER(抗性)。泳道7-pRNA IR_CP#1的转录产物，无DICER。泳道8-pRNA IR-CP#1+DICER 的 dsRNA 转录产物。泳道 5-pRNA IR-CP#2+DICER 的 dsRNA 转录产物。注意转录产物的合适大小，它们对于单链-特异性的RNA酶I的抗性(泳道4和…，和用双链-特异性的DICER的完全降解(泳道8和9)；图5为显示pRNA69CP-IR和质粒pBART和pART27的示意图；图6为包含IAPV-特异性的dsRNA表达盒的pBART和pART27的示意图；图7为来自显示合适大小的dsRNA产物的pBART IR_CP#1和IR_CP#2的转录产物的凝胶分析。泳道1-来自微孢子虫特异性的dsRNA (混合的ss和ds RNA) +RNA 酶A(注意部分降解和单一抗性的760bp片段)饲养的蜜蜂的内源性蜜蜂RNA。泳道 2-pRNA69IR-CP#l+RNA 酶 A (抗性)的转录产物。泳道 3-pBART IR-CP#1 的 dsRNA 转录产物，无RNA酶A。泳道4-pBART IR-CP# 1 +RNA酶A的dsRNA转录产物。泳道5-pBART IR-CP#2+RNA 酶 A 的 dsRNA 转录产物。泳道 6-pART27IR-CP#l+RNA 酶 A 的 dsRNA 转录产物。 泳道 7-pART27IR-CP#l+RNA 酶 A 的 dsRNA 转录产物。泳道 8_pART27IR_CP#l 的 dsRNA 转录产物，无RNA酶A。泳道9-分子量梯度。泳道10-来自微孢子虫-特异性的dsRNA(混合的ss 和dsRNA) +DICER (注意dsRNA片段的完全降解，和ss核糖体的和m_RNA的抗性)饲养的蜜蜂的内源性蜜蜂RNA。泳道ll-pRNA6WR-CP#l+DICER(降解的)的转录产物。泳道12-pBART IR-CP#1 的 dsRNA 转录产物，无 DICER。泳道 13-pBART IR-CP#1+DICER 的 dsRNA 转录产物。泳道 14-pBART IR-CP#2+DICER 的 dsRNA 转录产物。泳道 15-pART 27IR_CP#1+DICER 的 dsRNA 转录产物。泳道 16-pART 27IR-CP#1+DICER 的 dsRNA 转录产物。泳道 17_pART27IR_CP#l 的dsRNA转录产物，无RNA酶A。注意转录产物的合适大小，它们对于单链-特异性的RNA 酶I的抗性(泳道3-7)和用双链-特异性的DICER的完全降解(泳道13-17)。本发明的具体实施方案的描述在一些实施方案中，本发明涉及使用RNA干扰技术降低有益昆虫对于致病生物体的易感性的植物表达的组合物和方法，且更特别地，但不排他地，涉及表达蜜蜂病原体-特异性的dsRNA的植物在预防和治疗蜜蜂感染中的用途。在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解，本发明未必将其应用限制于以下描述中所述的或通过实施例例示的细节。本发明能采用其它实施方案或以多种方式实施或进行。引起有益昆虫(例如蜜蜂和其它传粉者)的疾病的病原体对于现代农业造成无数的经济损失，并对于改变传统的传粉模式和对于现代农业重要的基因流构成威胁。用于减少昆虫病原体感染的发生率和严重性的有效的且经济上可行的手段，以及将这些手段有效地递送至感染的昆虫是特别需要的。 Paldi等已经证实病毒和微孢子虫蜜蜂病原体的基因沉默(IAPV-PCT申请 W02009/060429 ；和 Nosema-Paldi 等，Applied Environ Microbiol, Epub，2010 年 7 月 9 日)以及在用病原体-特异性的dsRNA饲养的蜜蜂中对于感染的易感性降低。然而，将病原体-特异性的dsRNA提供给极为重要的野生蜜蜂群体，该群体不聚集于容易定位的蜂箱中，并提供给在大量的花饲料的季节觅食的蜜蜂，这既要求增加病原体-特异性的dsRNA的量，又要求将其传播和递送至该昆虫的改进的方法。蜜蜂和其它有益的植食性昆虫从植物组织(例如花蜜、花粉和植物的柔软部分) 中取食。本发明人已惊奇地发现在蜜蜂和其它有益昆虫的附近提供在昆虫可用的植物组织和分泌物中表达昆虫病原体-特异性的dsRNA的植物，可有效地减少在该有益昆虫中由这些病原体引起的疾病和感染。摄取该植物或植物组织的蜜蜂和其它有益昆虫从致病生物体的基因沉默中受益，并降低了对于相关疾病和感染的易感性。在具体的实施方案中，本发明提供了用于转化植物以表达能够使IAPV、微孢子虫物种和瓦螨基因的多核苷酸的方法和组合物，以及使用该转基因植物降低蜜蜂对于蜂群崩溃失调病的感染和易感性的方法。因此，根据本发明的一个方面，提供了降低昆虫对于由昆虫病原体引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括对所述昆虫提供表达以下核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含表达下调昆虫病原体的基因产物表达的核酸因子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至植物中的可操作的顺式调控元件，以使得所述昆虫取食所述植物并摄取所述核酸因子，由此降低所述昆虫对于所述病原体的易感性。本文使用的术语“有益昆虫”被定义为昆虫纲的若干成员中的任一种，包括无翅亚纲(无翅的)和有翅亚纲(有翅的)，它们发挥人类需要的作用，例如协助农业生产，并对害虫防治、栖息地整合、美学和园艺和造园中的“自然活力”有贡献的昆虫。本发明的一些实施方案中，所述有益昆虫为植食的或传粉的昆虫。包括植食的和传粉的物种的有益昆虫的非限制性列表，包括蜜蜂、小花蝽(小花蝽属)、大眼长蝽(big-eyed bug)(大眼长蝽属)、花萤(花萤科(Antharidae))、草蛉(草蛉科(Chrysophidae))和食蚜蝇(食蚜蝇属 (Syrphios))。在一个实施方案中，“有益昆虫”也包括那些捕食其它取食本发明的转基因植物的昆虫或生物体(例如蚜虫、螨、幼虫、卵等)的有益昆虫。本文使用的术语“蜜蜂”被定义为具有若干翅、身体多毛、通常为膜翅目中蜜蜂总科超家族的有刺昆虫中的任一种，包括独居和群居种类，特征为嚼吸式和咀嚼式口器用于收集花蜜和花粉。示例性的蜜蜂种类包括但不限于蜜蜂属(Apis)、熊蜂属(Bombus)、无刺蜂属(Trigona)、壁蜂属(Osmia)等。在一个实施方案中，蜜蜂包括但不限于熊蜂(大黄蜂 (Bombus terrestris))和蜜蜂(西方蜜蜂(Apis mellifera))。本文使用的术语“群体”被定义为一群数十至通常数万的在筑巢、食物收集和养育后代方面合作的蜜蜂。群体通常具有一个蜂王，其余的蜜蜂为“工蜂”(雌性)或“雄蜂”(雄性)。群体的社会结构通过蜂王和工蜂维持并依赖于有效的通信系统。工蜂等级制度中的劳动力分工主要取决于蜜蜂的年龄但随着该群体的需要而变化。繁殖和群体强度取决于蜂王、食物储备的量和工蜂劳动力的规模。蜜蜂也可被细分为以下种类“蜂箱蜜蜂”，通常为工蜂寿命的第一部分，该期间“蜂箱蜜蜂”在蜂箱中进行任务，和“采集蜜蜂”，在蜜蜂寿命的后期部分期间，该期间“采集蜜蜂”自蜂箱外定位并收集花粉和花蜜，并将该花蜜或花粉带至蜂箱用于消耗和储存。本文使用的术语“昆虫病原体”被定义为能在昆虫或昆虫群体(例如在社会性昆虫情况下)内增殖的包含核酸的因子，该病原体在该昆虫或昆虫群体中引起疾病，特别地， 但不排他地，病毒、细菌、真菌或螨。昆虫或昆虫群体的致病性因子可为胞内或胞外寄生虫， 且甚至可为螨(例如寄生的瓦螨)或其捕食该昆虫或昆虫群体的其它昆虫。根据本发明的一个实施方案，所述病原体为引起或促进蜜蜂或蜜蜂群体疾病的“蜜蜂病原体”，所述蜜蜂或蜜蜂群体疾病例如蜂群崩溃失调病、幼蜂皱萎病病毒疾病、残翅病、云翅病、慢性麻痹、孢子虫病(Nosemosis)、美洲幼虫腐臭病、蜜蜂和/或蜜蜂群体、瓦螨感染等。本文使用的术语“昆虫疾病”或“昆虫群体疾病”被定义为在一只昆虫、一群昆虫和 /或昆虫群体中的行为、生理、形态、生殖适合度、经济价值、传粉能力、抗感染和/或侵袭的非期望改变，直接或间接由与昆虫或昆虫群体致病因子的接触所导致。根据本发明的一个实施方案，所述昆虫为蜜蜂且非期望的改变包括但不限于蜜蜂或蜜蜂群体的行为、生理、形态、生殖适合度、经济价值、蜂蜜生产、传粉能力、抗感染和/或侵袭。本文使用的术语“耐受性”被定义为昆虫或昆虫群体抵抗和/或耐受由和/或昆虫病原体的繁殖引起的侵袭的能力，包括但不限于感染的程度、症状的严重性、对其它个体的感染性(接触传染)等。可以评估耐受性，例如，通过监测在用昆虫病原体受激后群体中昆虫长久性(Iongetivity)/寿命、感染性、症状(如但不限于，饥饿、活力、飞行范围等)的存在、致病生物体的存在或疾病的时间过程。本文使用的术语“易感性”被定义为昆虫或昆虫群体成为侵袭或被和/或昆虫病原体的支撑繁殖(support proliferation)感染的能力，包括但不限于，感染的程度、症状的严重性、对其它个体的感染(接触传染)等。可以评估易感性，例如，通过监测在用昆虫病原体受激后单个蜜蜂或蜜蜂群体中感染性、症状(如但不限于，饥饿、活力、飞行范围等) 的存在、致病生物体的存在、死亡率或疾病的时间过程。本文使用的术语“植物”是指整个植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞和其种子和后代。植物细胞包括不限于来自种子、悬浮培养物、胚胎、分生组织区、愈伤组织、叶、 根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于以下根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和多种形式的细胞和培养物(例如单细胞、原生质体、胚胎和愈伤组织)。植物组织可在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。术语“植物器官”或“植物组织”是指构成植物的形态和功能上不同部分的植物组织或组织群。术语“基因组”是指以下(1)遗传物质(基因和非编码序列)的完全补足物，其存在于生物体的每个细胞或病毒或细胞器中；和/或(2)继承来自一个亲本的(单倍体)单元的整套染色体。“后代”包括植物的任何后续的一代。植物可以是单子叶植物和双子叶植物、谷物、蔬菜、观赏植物、作物植物和针叶树。适合于用于本发明的一些实施方案的植物的非限制性列表在下文提供。本文使用的术语“附近”或“所述蜜蜂的附近”是指充分接近该昆虫的位置，以使该昆虫或蜜蜂在采集或寻找食物时，能容易地接触并摄取植物组织、器官、分泌物或细胞。 本领域技术人员能容易地测定本发明的转基因植物应位于离蜜蜂的出发点有多远，以使该蜜蜂和转基因植物之间实现有效的接触。应理解对于飞行的有益昆虫(例如蜜蜂)来说的 “附近”，从蜂源的距离将大于例如对于爬行昆虫来说的“附近”。此外，在一些实施方案中， 表达本发明的病原体特异性的dsRNA的转基因植物将被种植于其它作物之间，而在其它实施方案中，该转基因植物其自身为作物植物。应理解，根据本发明的一些实施方案，将植物或植物组织或分泌物(例如，花蜜、花粉、叶、渗出物等)中的至少一部分例如通过摄取、吸入等提供至昆虫。适合根据本发明的方法和组合物的一些实施方案进行治疗的示例性致病病原体和与昆虫致病因子相关的昆虫和昆虫群体的疾病的非限制性列表列于以下表II中。IAPV 的几种已知分离物的完整基因组和可用本发明的方法和组合物类似地靶向的菌株之间的可能的种系发生的关系方面的信息在I^alacios等2008 (Journal of Virology, 2008,82 6209-217)中提供。东方蜜蜂微孢子基因组的草图已经由nCornma等(PLoS Pathogen, 2009 ；5 :el000466)提供。狄斯瓦螨(Varroa destructor)的完整基因组由Ongus等提供 (J Gen Virol 2004 ;85 :3747-55)，且其线粒体基因组由 Navajas 等提供(Mol Biol Evol, 2002；19 :2313-17)。表II 示例件昆虫病原体寄生生物体基因
权利要求
1.一种核酸构建体，其包含表达下调昆虫病原体的基因产物表达的核酸因子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至植物中可操作的顺式调控元件。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸因子选自dsRNA、反义RNA和核酶。
3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其中所述dsRNA选自siRNA、shRNA和miRNA。
4.根据权利要求1所述的核酸构建体，所述顺式调控元件在花蜜腺组织、花外蜜腺和/ 或花粉中是活性的。
5.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸因子的长度大于15个碱基对。
6.根据权利要求5所述的核酸构建体，其中所述核酸因子的长度为19至25个碱基对。
7.根据权利要求5所述的核酸构建体，其中所述核酸因子的长度大于30个碱基对。
8.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述昆虫为蜜蜂。
9.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述昆虫病原体选自病毒、细菌、寄生原生动物、真菌、线虫和螨。
10.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述昆虫病原体为病毒。
11.根据权利要求10所述的核酸构建体，其中所述昆虫为蜜蜂且所述病毒为以色列急性麻痹病毒。
12.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中所述核酸因子与SEQID NO =256752, 256761,256762和311552中任一种所列的病毒核酸序列互补。
13.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中所述核酸因子与SEQID NO 256782-266260中任一种所列的病毒核酸序列互补。
14.根据权利要求11所述的核酸构建体，其具有SEQID NO :311533所列的核酸序列。
15.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述昆虫为蜜蜂且所述病原体为微孢子虫寄生虫。
16.根据权利要求15所述的核酸构建体，其中所述核酸因子与SEQID NO =55-252698 中任一种所列的微孢子虫核酸序列互补。
17.根据权利要求15所述的核酸构建体，其中所述微孢子虫寄生虫为东方蜜蜂微孢子，且所述基因产物为编码微孢子虫ATP/ADP转运蛋白或其同源物的mRNA。
18.根据权利要求17所述的核酸构建体，其中所述ATP/ADP转运蛋白或其同源物选自由SEQ ID NO :44、45、46和47编码的蛋白质。
19.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述昆虫为蜜蜂且所述病原体为狄斯瓦螨。
20.根据权利要求19所述的核酸构建体，其中所述基因产物为编码选自NADH脱氢酶亚基2、ATP合成酶亚基8、ATP合成酶亚基6、钠通道和细胞色素氧化酶亚基I的多肽的瓦螨特异性的mRNA。
21.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述昆虫为蜜蜂且所述核酸结构包含至少两种核酸因子，所述核酸因子中的每一种下调至少一种蜜蜂病原体的至少一种基因产物的表达。
22.根据权利要求21所述的核酸构建体，其中所述昆虫为蜜蜂且所述至少一种蜜蜂病原体选自病毒、细菌、寄生原生动物、真菌、线虫和螨。
23.根据权利要求22所述的核酸构建体，其中所述至少一种蜜蜂病原体包括至少两种蜜蜂病原体。
24.根据权利要求23所述的核酸构建体，其中所述核酸因子对应于所述至少两种蜜蜂病原体中的保守序列。
25.一种细胞，其包含权利要求114中任一项所述的核酸构建体。
26.根据权利要求25所述的细胞，其为植物细胞。
27.根据权利要求25所述的细胞，其中所述细胞为农杆菌。
28.一种植物，其表达权利要求1至M中任一项所述的核酸构建体。
29.根据权利要求观所述的植物，其中所述植物为选自芸苔、苜蓿和三叶草的开花植物。
30.根据权利要求观所述的植物，其在花蜜腺组织、花外蜜腺和花粉中表达所述核酸构建体。
31.一种降低昆虫对于由昆虫病原体引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括对所述昆虫提供表达权利要求1至M中任一项所述的核酸构建体的植物，以使所述昆虫取食所述植物并摄取所述核酸因子，由此降低所述昆虫对于所述病原体的易感性。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述昆虫为传粉昆虫或植食性昆虫。
33.一种用于降低蜜蜂对于由昆虫病原体引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括对所述蜜蜂提供表达权利要求11至20中任一项所述的核苷酸构建体的植物，以使所述蜜蜂取食所述植物并摄取所述核酸因子，由此降低所述蜜蜂对于所述病原体的易感性。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述昆虫为蜜蜂并且所述转基因植物表达与选自SEQ ID NO :60-252698、25洸99-2567沘和256782-266洸0的核酸序列互补的核酸因子。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述植物表达与选自SEQID NO =55-59, 253194、254090、25拟89、256752、256761、256762 和 311552 的核酸序列互补的核酸因子。
36.一种降低蜜蜂对于蜂群崩溃失调病(CCD)的易感性的方法，所述方法包括对所述蜜蜂提供表达权利要求11至20中任一项所述的核酸构建体的植物。
37.一种产生能够降低取食所述植物、植物组织或植物分泌物的昆虫对于由昆虫病原体引起的疾病的易感性的植物的方法，所述方法包括用权利要求1至M中任一项所述的核酸构建体转化所述植物的细胞，选择表达昆虫病原体-特异性的dsRNA的转化的植物或植物细胞，并繁殖所述植物或植物细胞以产生能够降低取食所述植物的昆虫的易感性的植物或植物细胞。
全文摘要
提供了用于转化植物以表达能够使有益昆虫的病原体(例如IAPV、微孢子虫物种和瓦螨)中的基因表达基因沉默的多核苷酸的方法和组合物，以及使用所述转基因植物降低蜜蜂对于蜂群崩溃失调病的感染和易感性的方法。
文档编号C12N15/113GK102481311SQ201080037297
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月22日 优先权日2009年8月21日
发明者E·本-查诺克, G·亚登, N·帕蒂 申请人:比欧洛吉科斯公司