专利名称：细胞保存方法
技术领域：
本发明涉及用于细胞的冷冻保存的方法和用于该方法的冷冻保存溶液。
背景技术：
近年来，随着医药的进展，已经广泛进行了利用活细胞的基础研究和治疗。因此， 用于安全地保存细胞而同时维持细胞活性的技术是必需的，对此已经进行了多项研究。作为保存细胞的方法，在短期保存的情况下，在悬浮状态下保存细胞而不冷冻的方法是已知的(例如，专利公开物1)；或者，在长期保存的情况下，包括冷冻的用于保存细胞的方法是已知的(例如，专利公开物2)。例如，在过继性免疫治疗或供体淋巴细胞输注(DLI)治疗 (其为针对癌症的免疫治疗)中，有一些这样的情况实际操作上难以在制备之后立即使用 (施用)细胞；因此，需要冷冻保存细胞一定的时间段，直至使用细胞。作为冷冻保存的方法，已知有这样的方法其中，通过将冷冻保护剂加入到含有大约40种成分的细胞培养基中来制备溶液，并使用该溶液作为细胞保存溶液。然而，常规的方法使用如上所述的含有大约40种成分的培养基，在这些成分之中有可能会包括对于细胞或活体而言不想要的那些成分。另外，在“解冻冷冻保存的细胞后将细胞施用至活体”的情况下，需要将细胞保存在溶液状态持续一段时间，直至细胞被施用至活体，但是，常规的冷冻保存溶液具有一个问题细胞的存活率，换言之，活细胞的数目，随着保存时间的延续而显著降低。另外，在“解冻之后需要洗涤细胞”的情况下，也存在一个问题细胞的存活率进一步降低。现有技术参考文献专利公开物专利公开物1 日本专利特开No. 2006-230396专利公开物2 日本专利特开No. 2002-23335
发明内容
本发明要解决的问题本发明的目标是提供用于冷冻保存细胞的方法，所述细胞能够维持在高存活率； 还提供了具有用于冷冻保存的必须成分的冷冻保存溶液。解决问题的方法为了解决上述问题，本发明人验证了在细胞的冷冻保存中常规使用的培养基中的大约40种成分的大量组合中的每一种，以期发现对于活体无害的成分以及在冷冻保存细胞时必不可少的成分。结果为，本发明人发现通过使用含有钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂和碳酸氢盐和/或碳酸盐的溶液获得了即使在解冻后也具有高存活率的细胞。另外，通过使用该溶液，即使上述冷冻保存的细胞被解冻并经历在液体悬浮状态的长期保存时，本发明惊奇地发现保存细胞是可能的，同时维持在高存活率，虽然细胞冷冻了一次，本发明由此完成。
具体地，本发明总体上涉及[1]用于冷冻保存细胞的方法，其特征在于，使用含有下列物质作为必须成分的溶液钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，所述溶液另外可选地包含选自下列的成分蛋白质、镁盐和钙盐。[2]根据[1]的方法，其中所述的糖是选自下列的至少一种糖葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。[3]根据[1]的方法，其中所述冷冻保护剂是选自下列的至少一种冷冻保护剂二甲基亚砜、羟乙基淀粉、乙二醇和甘油。[4]根据[1]的方法，其中所述蛋白质是源自血液的蛋白质。[5]用于保存细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使根据[1]定义的方法进行了冷冻保存的细胞溶液解冻；和，进一步将该细胞溶液保存在液体悬浮状态。和[6]细胞的冷冻保存溶液，其特征在于，所述冷冻保存溶液包含作为必须成分的下列物质钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，并且所述溶液另外可选地包含选自下列的成分蛋白质、镁盐和钙盐。发明效果根据本发明，使得获得在解冻之后保持高存活率的细胞的冷冻保存成为可能，甚至是当细胞在解冻之后维持在液体悬浮状态时，细胞也维持高存活率，并且也保持生理学功能；因此，本发明对于细胞的基础性研究和应用性研究和医学应用是非常有用的。
图1的图显示了当研究本发明的保存方法中使用的溶液的必须成分时，细胞存活活性的一个实例。图2的图比较了在反复冷冻和解冻冷冻保存的细胞之后，细胞的存活活性。图3的图比较了在冷冻保存的细胞解冻之后、在液体悬浮状态保持一个长时间段时的细胞存活活性。图4的图比较了在冷冻保存的不同细胞解冻之后、在液体悬浮状态保持一个长时间段时的细胞存活活性。图5的图比较了反复冷冻和解冻冷冻保存的细胞之后的细胞存活活性。图6的图比较了在冷冻保存的细胞解冻之后、在液体悬浮状态保持一个长时间段时的细胞存活活性。
具体实施例方式以下将更具体地描述本发明。本发明提供了用于冷冻保存细胞的方法，其特征在于所述方法包括将细胞悬浮于含有钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐的溶液中，并将得到的细胞悬浮液进行冷冻保存。换言之，钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐在本发明中对于细胞的冷冻保存是必需的且足够的[也称作用于本发明的冷冻保存方法的溶液(本发明的冷冻保存溶液)的必须成分]。如本文使用的“钠盐”无特别限定，只要当溶解于溶剂时该钠盐产生钠离子；可以使用含氧酸盐、商化物、氧化物、氢氧化物、无机盐、有机酸盐等。例如，含氧酸盐包括过碳酸钠(Nei2CO4)、连二亚硫酸钠(sodium dithionite、sodium hydrosulfite) (Νει2&04)、亚硫酸钠(Na2SO3)、亚硫酸氢钠(NaHSO3)、硫酸钠(sodium sulfate (总名称)=Na2SO4)、硫代硫酸钠(hypo) (Na2S2O3)、亚硝酸钠(NaNO2)和硝酸钠(NaNO2)；卤化物包括氟化钠(NaF)、氯化钠 (NaCl)、溴化钠(NaBr)和碘化钠(NaI)；氧化物包括氧化钠(Na2O)和过氧化钠(Na2O2)；氢氧化物包括氢氧化钠(sodium hydroxide (总名称)Na0H)；无机盐包括氢化钠(NaH)、硫化钠(Na2S)、硫氢化钠(sodium hydrosulf ide) (NaHS)、硅酸钠(Na2SiO3)、磷酸三钠(Na3PO4)、 硼酸钠(Na3BO3)、硼氢化钠(NaBH4)和四氯代金酸钠(Na[AuClJ)；有机酸盐包括乙酸钠 (CH3COONa)和柠檬酸钠；等等。可以使用单一种类的这些钠盐或多个种类的组合。在本发明中，作为单一的种类，优选使用氯化钠；作为多个种类，优选使用氯化钠和柠檬酸钠。所包含的钠盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部钠离子的最终浓度而言，数量优选为0. 01至5，000mmol/L,更优选为0. 1至1，000mmol/L,进一步优选为1至 300mmol/L。如本文使用的“钾盐”无特别限定，只要当溶解于溶剂时该钾盐产生钾离子；可以使用含氧酸盐、商化物、氧化物、氢氧化物、无机盐、有机酸盐等。例如，含氧酸盐包括硝酸钾 (KNO3)、硫酸钾(K2SO4)和过碳酸钾(K2CO4)；卤化物包括氟化钾(KF)、氟氢化钾(KHF2)、氯化钾(KCl)、溴化钾(KBr)和碘化钾(KI)；氧化物包括过氧化钾(K2O2)和氧化钾(K2O)；氢氧化物包括氢氧化钾(KOH)；无机盐包括氢化钾(KH)、硫化钾(K2S)、硫氢化钾(potassium hydrosulfide) (KHS)、高锰酸钾(KMnO4)、铬酸钾(K2CrO4)和氯酸钾(KClO3)；等等。可以使用单一种类的这些钾盐或多个种类的组合。在本发明中，优选使用氯化钾。所包含的钾盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部钾离子的最终浓度而言，数量优选为0. 01至5，00(toimol/L，更优选为0. 1至1，00(toimol/L，进一步优选为1至100mmol/L。如本文使用的“碳酸氢盐”无特别限定，只要当溶解于溶剂时该碳酸氢盐产生碳酸氢根离子；可以使用含多种阳离子的盐。例如，碳酸氢盐包括碳酸氢铵(NH4HCO3)、碳酸氢钾 (KHCO3)、碳酸氢钙(Ca(HCO3)2)、碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸氢镁(Mg(HCO3)2)等。如本文使用的“碳酸盐”无特别限定，只要当溶解于溶剂时该碳酸盐产生碳酸根离子；可以使用含多种阳离子的盐。例如，碳酸盐包括碳酸铵((NH4)2CO3)、碳酸钾(K2CO3)、 碳酸钙(CaCO3)、碳酸钠(Na2CO3)、碳酸钡(BaCO3)、碳酸镁(MgCO3)、碳酸锂(Li2CO3)、碳酸铜 (II) (CuCO3)、碳酸铁(II) (FeCO2)、碳酸银⑴(A^CO3)等。可以使用单一种类的这些碳酸氢盐和/或碳酸盐或多个种类的组合。在本发明中，优选使用碳酸氢钠。所包含的碳酸氢盐和/或碳酸盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部碳酸氢根离子和碳酸根离子的最终浓度而言，数量优选为0.01 至 1，000mmol/L，更优选为 0. 1 至 500mmol/L，进一步优选为 1 至 100mmol/L。如本文使用的“糖”，可以使用单糖、寡糖或糖醇。例如，单糖包括葡萄糖、半乳糖、 果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖包括海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖；糖醇包括木糖醇和山梨糖醇；等等。可以使用单一种类的这些糖或多个种类的组合，在本发明中，糖优选是选自下列的至少一种糖葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖，更优选为葡萄糖。所包含的糖的量优选为冷冻保存溶液的0. 01至100g/L，更优选为0. 1至100g/L， 进一步优选为0. 25至50g/L。
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如本文使用的“冷冻保护剂”包括二甲基亚砜(DMSO)、羟乙基淀粉(HES)、乙二醇、 甘油等。另外，商业上可获得的产品包括CP-I [含有17.65% (W/V)HES和14.71% (V/V) DMSO 的生理盐水，由 KY0KUT0 PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.生产]。可以使用单一种类的这些冷冻保护剂或多个种类的组合。在本发明中，优选使用DMSO和羟乙基淀粉。所包含的冷冻保护剂的量优选为冷冻保存溶液的0. 01% -50%，更优选为-40%， 进一步优选为3% -30%。另外，当使用DMSO和羟乙基淀粉共同作为冷冻保护剂时，所包含的它们的总量优选在上述范围内，各自的浓度为=DMSO浓度优选为0. 01 % -50%，更优选为-30%，进一步优选为2% -15% ；羟乙基淀粉的浓度优选为0.01% -50%，更优选为 1% -30%，进一步优选为2% -15%。在本发明的优选实施方式中，除了用于本发明的冷冻保存细胞的方法中的溶液的必须成分之外，该溶液还可以可选地包含选自下列的成分蛋白质、镁盐和钙盐。如本文使用的“蛋白质”没有特别限定，蛋白质包括分离的蛋白质或可用的重组蛋白质。例如，蛋白质包括源自血液的蛋白质。源自血液的蛋白质包括源自血浆的蛋白质以及源自血清的蛋白质，具体包括血清白蛋白、血清球蛋白等。同样，血清白蛋白包括人血清白蛋白或牛血清白蛋白。商业上可获得的产品包括Buminate Injection 25% (25%的人血清白蛋白，由Baxter Limited生产)等等。可以使用单一种类的这些蛋白质或多个种类的组合。在本发明中，蛋白质优选是人血清白蛋白。所包含的蛋白质的量优选为冷冻保存溶液的0.01% -50%，更优选为-30%，进一步优选为2% -15%。如本文使用的“镁盐”没有特别限定，只要当溶解于溶剂时该镁盐产生镁离子； 可以使用含氧酸盐、商化物、氧化物、氢氧化物、无机盐、有机酸盐等。例如，含氧酸盐包括硝酸镁(Mg(NO3)2)、硫酸镁(MgSO4)和过碳酸镁(MgCO4)；卤化物包括氟化镁(MgF2)、氟氢化镁(Mg (HF2) 2)、氯化镁(MgCl2)、溴化镁(MgBr2)和碘化镁(MgI2)；氧化物包括过氧化镁 (MgO2)和氧化镁(MgO)；氢氧化物包括氢氧化镁(Mg(OH)2)；无机盐包括氢化镁(MgH2)、硫化镁(MgS)、硫氢化镁(magnesium hydrosulf ide) (Mg (SH) 2)、高锰酸镁(Mg(MnO4)2)、铬酸镁(MgCrO4)和氯酸镁(Mg(ClO3)2)；等等。可以使用单一种类的这些镁盐或多个种类的组合。在本发明中，优选使用氯化镁。所包含的镁盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部镁离子的最终浓度而言，数量优选为0. 01至lOmmol/L，更优选为0. 1至 5mmol/L0如本文使用的“钙盐”没有特别限定，只要当溶解于溶剂时该钙盐产生钙离子； 可以使用含氧酸盐、商化物、氧化物、氢氧化物、无机盐、有机酸盐等。例如，含氧酸盐包括硝酸钙(Ca(NO3)2)、硫酸钙(CaSO4)和过碳酸钙(CaCO4)；卤化物包括氟化钙(CaF2)、氟氢化钙(Ca (HF2) 2)、氯化钙(CaCl2)、溴化钙(CaBr2)和碘化钙(CaI2)；氧化物包括过氧化钙 (CaO2)和氧化钙(CaO)；氢氧化物包括氢氧化钙(Ca(OH)2)；无机盐包括氢化钙(CaH2)、硫化钙(CaS)、硫氢化钙(calcium hydrosulf ide) (Ca (SH) 2)、高锰酸钙(Ca(MnO4)2)、铬酸钙 (CaCrO4)和氯酸钙(Ca(ClO3)2)；等等。可以使用单一种类的这些钙盐或多个种类的组合。 在本发明中，优选使用氯化钙。所包含的钙盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部钙离子的最终浓度而言，数量优选为0. 01至lOmmol/L，更优选为0. 1至 5mmol/L0本发明方法中使用的冷冻保存溶液的成分中的钠盐与钾盐的浓度比钠离子与钾离子的浓度比，钠离子/钾离子优选为1/1000至1000/1，更优选为1/100至100/1，进一步优选为1/10至100/1，进一步优选为1/1至100/1，进一步优选为10/1至50/1。另外，除了上述成分之外，本发明的冷冻保存溶液还可以包含不具有细胞毒性的物质，例如，维生素、氨基酸等。此外，从调节pH或发挥缓冲作用的角度而言，除了上述成分之外，本发明的冷冻保存溶液可以包含磷酸根离子。然而，从“解冻后直接将细胞施用至活体”的角度而言，优选使该成分较少，或者，冷冻保存溶液可以不含磷酸根离子。本发明的冷冻保存溶液可以这样制备各称取所需量的钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，并将所有成分溶解于纯水或生理盐水中。或者，冷冻保存溶液可以这样制备将每种成分分别溶解于纯水或生理盐水中，并将每种成分的溶液以所需的量混合。当按照如上所述准备冷冻保存溶液时，可以将每种成分溶解于纯水或生理盐水中，然后可以对其进行除掉细菌的步骤(例如，细菌消除过滤步骤)。此外，可选地，可以按照相同的方式制备蛋白质、镁盐或钙盐，并加入其中。或者，可以组合使用含有钠盐、 钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐的数种商业上可获得的溶液。可以在无菌条件下混合商业上可获得的产品，例如，BI CARBON Infusion (由AJIN0M0T0生产)、日本药典葡萄糖溶液(例如，由Nissin Pharmaceutical Co.，LTD.生产)、日本药典氯化钠溶液(例如，由Otsuka Pharmaceutical Co.，LTD.生产)、日本药典氯化钾溶液(例如， 由Otsuka Pharmaceutical Co.，LTD.生产)、日本药典碳酸氢钠溶液(例如，由Otsuka Pharmaceutical Co. ,LTD.生产)、CP_1 (KY0KUT0 PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO. ,LTD.) 或Buminate Injection 25% (25%的人血清白蛋白，由Baxter Limited生产)，以包含用于本发明的必要的浓度。当使用本发明的冷冻保存溶液时，渗透压无特别限定，理想的是，冷冻保存溶液具有不会对细胞产生损伤的渗透压比。例如，当用于人淋巴细胞的保存时，渗透压优选为120 至1，500m0sm/L，更优选为250至300m0sm/L。在调节渗透压时，可以使用用于本发明的冷冻保存细胞方法的溶液的必须成分中的任一项。本发明的冷冻保存溶液的pH没有特别限定，理想的是，溶液具有不会对细胞产生损伤的PH。例如，当用于保存人淋巴细胞时，pH优选为3. 0至10. 0，更优选为4. 5至9. 0。 当调节pH时，可以使用用于本发明的冷冻保存细胞方法的溶液的必须成分中的任一项。本发明中还包括，如上所述的，用于本发明的冷冻保存细胞方法中的，冷冻保存溶液，其含有包括下列的必须成分钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐， 另外可选地含有选自下列的成分蛋白质、镁盐和钙盐。可用于本发明的冷冻保存方法中的细胞包括分离自哺乳动物、包括人类的多种细胞和细胞群体，以及从中诱导的细胞。多种分离的细胞包括，例如，外周血单核细胞(PBMC)、 造血干细胞、脐带血单核细胞、血细胞系细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞、稚细胞、记忆细胞等，诱导的细胞包括淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、细胞毒性T细胞(CTL)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)、NK细胞等，每种具有细胞毒性活性，并且细胞不限于这些细胞。这些细胞可以通过已知的方法制备。当期望的细胞勻质地悬浮于冷冻保存溶液中时，细胞浓度无特别限定，可以根据细胞的种类、细胞的用途和应用、细胞的大小、保存容器的大小、保存期限等适宜地决定细胞浓度，细胞浓度是例如，优选为1 X IO4至1 X IO9个细胞/mL，更优选为1 X IO5至1 X IO9个细胞/mL，甚至优选为2X IO5至5X IO8个细胞/mL。保存容器无特别限定，只要保存容器能够冷冻保存细胞，可以使用冷冻保存袋子、铝保护器、特效袋(miracle bag)、低温管等。在本发明中，冷冻保存细胞的方法是指包括下列步骤的方法将期望的细胞悬浮于本发明的冷冻保存溶液中，以制备细胞悬浮液；将该细胞悬浮液在置于超低温度的冰箱中静置，从而将细胞悬浮液保存于冷冻状态。超低温度在本文中无特别限定，只要其是使细胞悬浮液完全冷冻的温度，通常可以是零下60°C或更低。同样，本发明中也包括使用液氮的冷冻保存细胞的方法。优选地，细胞悬浮液保存于充满液氮的温度为零下70°C或更低的冰箱中。根据本发明的方法的冷冻保存时间无特别限定，冷冻保存时间是例如5分钟至48个月，优选为1天至12个月。然后，根据本发明的方法进行了冷冻保存的细胞悬浮液被解冻，从而可以在非冷冻状态下进一步保存解冻的细胞悬浮液。换言之，本发明还提供了用于保存细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤将经历冷冻保存的上述细胞悬浮液(即冷冻保存的细胞悬浮液)解冻，并进一步在非冷冻状态保存解冻的细胞悬浮液，换言之，在液体悬浮状态保存。解冻冷冻保存的细胞悬浮液的方法无特别限定，优选可以在0°C至40°C、更优选20°C至 37°C的温度解冻处于冷冻状态的细胞悬浮液。解冻之后的保存温度优选是0°C至40°C，更优选4°C至37°C。非冷冻状态的细胞悬浮液的保存时间无特别限定，保存时间是例如0至 18天，优选0至10天，更优选0至3天。即使在解冻之后，根据本发明的方法进行了冷冻保存的细胞也保持高细胞存活率，在解冻之后继续保存细胞也是可能的。另外，在解冻之后可以不经历洗涤细胞的步骤而直接将细胞施用至活体。实施例以下将通过实施例的方式更具体地显示本发明，但不是意在将本发明的范围限制于此。在本发明的实施例中，“室温”是指20°C至30°C。实施例1 关于保存溶液的研究(1)制备待研究的溶液制备如表1所示的溶液作为用于筛选的保存溶液[表 1]表 权利要求
1.用于冷冻保存细胞的方法，其特征在于，使用含有下列物质作为必须成分的溶液 钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，所述溶液另外可选地包含选自下列的成分蛋白质、镁盐和钙盐。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的糖是选自下列的至少一种糖葡萄糖、半乳糖、 果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述冷冻保护剂是选自下列的至少一种冷冻保护剂二甲基亚砜、羟乙基淀粉、乙二醇和甘油。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述蛋白质是源自血液的蛋白质。
5.用于保存细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使根据权利要求1至4中任一项的方法进行了冷冻保存的细胞溶液解冻；和，进一步将该细胞溶液保存在液体悬浮状态。
6.细胞的冷冻保存溶液，其特征在于，所述冷冻保存溶液包含作为必须成分的下列物质钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，并且所述溶液另外可选地包含选自下列的成分蛋白质、镁盐和钙盐。
全文摘要
冷冻保存细胞的方法，其特征在于使用含有作为必须成分的下列物质的溶液钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，该溶液还可选地包含选自下列的成分蛋白质、镁盐和钙盐。根据本发明，提供了用于冷冻保存细胞的方法，所述细胞能够在解冻之后维持高存活率，还提供了用于冷冻保存的冷冻保存溶液。另外，通过使用该冷冻保存方法，即使在解冻之后，细胞也可以保存在维持高存活率的状态，并维持其生理功能；此外，冷冻和解冻之后的细胞洗涤步骤是不必要的，从而使其在细胞的基础研究和医学处理的应用性研究上是非常有用的。
文档编号C12N5/07GK102482641SQ20108003732
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月17日 优先权日2009年8月19日
发明者榎龙嗣, 田边雅茂, 矶野友美 申请人:宝生物工程株式会社