监视亚硫酸氢盐介导的dna转化的方法

专利名称：监视亚硫酸氢盐介导的dna转化的方法
技术领域：
本发明涉及在DNA甲基化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的方法。所述方法基于酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)与至少一种标记的DNA报告分子的反应， 所述报告分子在其序列中包含至少一个未甲基化的胞嘧啶残基。在尿苷残基中未甲基化的胞嘧啶残基的亚硫酸氢盐介导的转化之后，UNG从DNA骨架中除去尿嘧啶碱基，因而使得它对热诱导的水解切割敏感。最后，检测在这种断裂过程期间从DNA报告分子上释放的标记物。尿嘧啶-DNA糖基化酶和尿嘧啶-N-糖基化酶有时缩写为UNG或UDG，它们应被理解为相似的或同义的。在任何情况下，在本申请中使用该术语来指明使得DNA骨架对热诱导的水解切割敏感的酶。
背景技术：
DNA甲基化在各种生物体包括原核生物和真核生物的基因组中存在。在原核生物中， DNA甲基化在胞嘧啶和腺嘌呤碱基上发生，并涵盖了宿主限制系统的一部分。然而在多细胞真核生物中，甲基化看起来限于胞嘧啶碱基，并且与被抑制的染色质状态和基因表达抑制相关(例如，在 Wilson, G. G. and Murray, N. Ε. (199lM/ / w. Rev. Genet. 25，585 - 627 中综述)。在哺乳动物细胞中，DNA甲基化主要在CpG 二核苷酸处发生，其不均勻地分布，并且在基因组中减量出现(underr印resented)。在许多启动子区域中发现了通常未甲基化的 CpGs 的簇(称为 CpG 岛)(例如，在 Li, E. (2002)#ai. Rev. Genet. 3，662-673 中综述)。已经在几种人类癌症中证明了引起异常的基因沉默的DNA甲基化的改变(例如，在 Robertson, K. D. and ffolffe, Α. P. (2000) JVat. Rev. Genet. 1，11-19 中综述)。证明了启动子的超甲基化是引起肿瘤阻抑基因灭活的常见的机制(Bird，A. P. (2002)^5 Dev. 16，6-21)。存在各种方法用于实验上测定个体基因中的差异性甲基化(例如，在Rein，Τ. et al. QWmNucleic Acids Res. 26，2255_2洸4中综述)。这些技术尤其地包括亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性PCR (MSP)、Methylight和焦磷酸测序。进行上述技术的一个共同的先决条件是要分析的DNA的亚硫酸氢盐介导的转化 (也称为亚硫酸氢盐修饰)。特别地，未甲基化的胞嘧啶残基被转变为尿苷残基。从胞嘧啶到尿嘧啶的亚硫酸氢盐介导的转化的三步骤反应方案在

图1中示意地显示。简言之，在微酸性条件下胞嘧啶被磺化为胞嘧啶亚硫酸氢盐。自发地发生水解脱氨成为尿嘧啶-亚硫酸氢盐。后者然后在碱性条件下脱磺酸成尿嘧啶。由于在亚硫酸氢盐处理期间甲基化的胞嘧啶残基不被转化为尿苷残基，未甲基化的CpG岛中的DNA序列被有效地改变(C到U)，而甲基化的DNA保持了它的原始序列。然而，对于基于DNA甲基化状态分析的有效的诊断结果，希望的是DNA以最大效率转化，也就是说理想地，给定DNA序列中存在的100%的未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿苷残基。
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亚硫酸氢盐介导的DNA转化一般使用商业上可获得的反应试剂盒进行。在这些测试系统中，DNA通常在相对高的反应温度(例如，60°C )下孵育长时间(在很多情况下，过夜)。 在孵育的这个时间期间，重复的加热步骤到95°C是变性DNA所必需的。在很多情况下，通过简单地使得反应运行看来适当的尽量多次，孵育时间应当达到最高的DNA转化效率，和/或孵育时间是可容忍的，同时维持一定水平的DNA质量。另一方面，还明显的是，延长的加热时期最后引起DNA的降解，因而引起DNA产量和完整性的降低。这对于任何下游的分析可能是致命的，例如，如果样品中的DNA浓度低的话。然而，要分析的不同的样品DNA或不同的应用可能需要独特的实验设置，以实现最大效率。例如，与纯化的样品DNA相比，使用具有非纯化DNA的粗溶胞产物具有更高的不确定性。在粗溶胞产物中，存在着可能潜在地与亚硫酸氢盐相互作用的其他物质，因而干扰 DNA转化反应。鉴于上述考虑，“一个孵育时间满足所有情况”的一般方法显然是不合理的，因为当分析易于转化的DNA样品(例如，纯化的DNA分子)时，这将由于延长的热暴露而引起不必要的DNA质量损失。反之亦然，即使有的话，复杂样品(例如，粗溶胞产物、体液、冷冻的活检组织)中的DNA可能仅相当小程度地被转化。当前，还没有主动地监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的进行和发展的方法。然而， 提供这样的方法将帮助精确地确定每个单独反应的终点(即，100%完成)，因而容许从一般化的方案变为样品特异性的反应条件。可以避免不必要的和过度的加热孵育时间，从而改
善DNA质量。因而，对于克服上述限制、容许精确监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的方法存在着持续的需求。特别地，需要相应的方法，其允许为分析的每个样品DNA设置个体化的反应条件，从而改善差异化DNA甲基化分析的结果。发明概述
本发明的一个目的是提供用于在DNA甲基化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的新的方法。更具体地，一个目的是提供容许转化终点的精确测定的方法。此外，一个目的是提供一种方法，其允许反应条件的精确控制以及匹配，所述反应条件应用于所采用的样品DNA的特定要求，从而引起获得的DNA质量的总体改善。这些目的以及根据确保性描述将变得显而易见的其他目的通过独立权利要求的主题来实现。本发明的某些优选的实施方式由从属权利要求的主题来限定。在一个方面中，本发明涉及在DNA甲基化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的方法，包括
(a)提供要分析的样品DNA和至少一种DNA报告分子，其中所述至少一种DNA报告分子包含
(i)在它的核苷酸序列中至少一个未甲基化的胞嘧啶残基；以及
(ii)至少一种标记物(label)；
以及其中所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子在相互流体连接的、空间上分隔的反应区室中提供；
(b)向所述空间上分隔的反应区室添加亚硫酸氢盐，从而介导所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶残基向尿苷残基的转化；
(c)向所述至少一种DNA报告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，从而介导步骤(b)中获得的尿嘧啶碱基从DNA骨架上脱除；
(d)通过热处理来断裂步骤(c)中获得的DNA;以及
(e)检测在步骤(d)期间从所述至少一种合成的DNA报告分子释放的至少一种标记物。在一个实施方式中，所述方法进一步包括
(f)将(e)中获得的结果与参考值比较。在另一个实施方式中，检测步骤在给定的时期内重复至少一次。优选地，步骤(e)中获得的结果用于控制根据步骤(b)的反应的发展。在优选的实施方式中，所述至少一种DNA报告分子是合成的寡核苷酸。在特别优选的实施方式中，所述至少一种合成的DNA报告分子被固定在支持物上。在另一个优选的实施方式中，所述尿嘧啶-DNA-糖基化酶是热稳定的。在一个具体的实施方式中，步骤(c)、(d)和(e)在提供所述至少一种DNA报告分子所采用的同一反应区室中进行。在可选择的实施方式中，步骤(c)、(d)和(e)中的任一个或多个在至少一个进一步的空间上分隔的反应区室中进行，所述反应区室与提供所述至少一种DNA报告分子所采用的反应区室是流体连接的。在进一步具体的实施方式中，至少任何一个，并且优选地，所有反应区室装备有一个或更多个温度控制单元，用于控制和调节反应区室内的温度。在优选的实施方式中，反应区室之间的空间分隔通过半透膜、优选地大小排阻膜或微量渗析膜的方式实现。在进一步优选的实施方式中，相互流体连接的至少两个空间上分隔的反应区室被整合到传感设备、优选地连续传感设备中。在另一个方面，本发明涉及在此限定的方法用于分析样品DNA的甲基化状态的用途。优选地，进行DNA甲基化状态的分析用于诊断癌症。图简述
图1示意地描绘了从胞嘧啶(左侧)到尿嘧啶(右侧)的亚硫酸氢盐介导的转化的一般的三步骤反应方案。在微酸性条件下胞嘧啶被磺化为胞嘧啶-亚硫酸氢盐。自发地发生水解脱氨成为尿嘧啶-亚硫酸氢盐。后者然后在碱性条件下脱磺酸成尿嘧啶。图2示意地描绘了在DNA的延伸中在尿苷残基上尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的反应。如果胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶，尿苷残基仅可在DNA中存在，引起DNA中的突变。UNG 从DNA的糖-磷酸骨架上除去尿嘧啶碱基。虽然DNA骨架保持完整，产生的无碱基位点对于提高温度下的水解切割是敏感的。图3示意地描绘了根据本发明的方法的原理。提供的是至少一种标记的DNA报告分子，在它的核苷酸序列中包含未甲基化的胞嘧啶残基，所述胞嘧啶残基通过添加重硫酸盐的方式转化为尿苷残基(1.)。用UNG处理DNA引起尿嘧啶碱基从DNA骨架上脱除(2.)， 因而使得它在这些无碱基位点对热诱导的断裂敏感(3.)。任选地分离从至少一种DNA报告分子上释放的标记物(4.)，并通过合适的分析方法来检测。图4描绘了在示范性的传感设备中进行的根据本发明方法的一个实施方式的示意图，所述传感设备具有相互流体连接的至少五个空间上分隔的反应区室。这个实施方式的详细说明在实施例1中给出。图5示意地描绘了在具有相互流体连接的至少两个空间上分隔的反应区室的示范性的传感设备中，通过利用固定在固相支持物(即，珠子表面)上的DNA报告分子的部分， 离散的数据点的采集。图A-C说明了部分释放的示意性的时间系列。图D代表了测定DNA 转化效力的可能的曲线。细节在实施例3中给出。图6描绘了在示范性的传感设备中进行的根据本发明方法的另一个实施方式的示意图，所述传感设备具有相互流体连接的至少两个分隔的反应区室。采用的一种DNA报告分子固定在反应区室之一的表面上。图A说明了样品DNA和DNA报告分子的亚硫酸氢盐介导的转化。图B显示了在适合的温度和缓冲条件下从储存器添加UNG。图C显示了“转化的” DNA报告分子的热诱导的断裂。这个实施方式的详细说明在实施例4中给出。图7描绘了在示范性的传感设备中进行的根据本发明方法的进一步的实施方式的示意图，所述传感设备具有相互流体连接的至少两个分隔的反应区室。使用的UNG酶是热稳定的，因而可以与至少一种DNA报告分子一起提供，所述DNA报告分子固定在反应区室之一的表面上。这个实施方式的详细说明在实施例5中给出。详细说明
本发明基于出乎意料地发现，通过组合酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)与至少一种标记的DNA报告分子的反应，报告分子在它的序列中包含至少一个未甲基化的胞嘧啶残基， 可以建立用于在DNA甲基化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的有效的方法。在下文说明性描述的本发明可以在缺少没有在此具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当进行。将针对特定的实施方式和参考某些图描述本发明，但是本发明不受此限制，而是仅由权利要求限制。描述的图仅是示意性的并被认为是非限制性的。当术语“包括”在本说明书和权利要求中使用时，它不排除其他要素或步骤。对于本发明的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选的实施方式。如果在下文中，某一组被限定为包含至少一定数量的实施方式，这也被理解为公开了一种组，其优选地仅由这些实施方式组成。在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词例如“一(a、an)”、“该(the)”的情况下，这包括该名词的复数，除非特别声明了其他情况。在本发明的上下文中术语“约”表示精确性的区间，本领域的技术人员将理解仍然确保了所讨论的特征的技术效果。该术语一般表明从所指明数值的士 10%和优选地士 5% 的偏离。此外，在说明书中和在权利要求中，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等等，是用于区分相似的要素，而不必描述次序或时间顺序。要理解的是，这样使用的术语在合适的状况下是可互换的，且在此描述的本发明的实施方式能够以不同于在此描述或说明的其他顺序来操作。术语的进一步的定义将在以下在使用该术语的上下文中给出。单独地提供以下术语或定义来帮助理解本发明。这些定义不应当被认为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
在一个方面，本发明涉及在DNA甲基化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的方法，包括
(a)提供要分析的样品DNA和至少一种DNA报告分子，其中所述至少一种DNA报告分子包含
(i)在它的核苷酸序列中至少一个未甲基化的胞嘧啶残基；以及
(ii)至少一种标记物；
以及其中所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子在相互流体连接的、空间上分隔的反应区室中提供；
(b)向所述空间上分隔的反应区室添加亚硫酸氢盐，从而介导所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶残基向尿苷残基的转化；
(c)向所述至少一种DNA报告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，从而介导步骤(b)中获得的尿嘧啶碱基从DNA骨架上脱除；
(d)通过热处理来断裂步骤(c)中获得的DNA；以及
(e)检测在步骤(d)期间从所述至少一种合成的DNA报告分子释放的至少一种标记物。如在此使用的，术语“样品DNA”是指包含一个或更多个DNA分子的任何样品，一旦DNA分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶残基被转化成尿苷残基，则要分析所述DNA分子的差异甲基化状态。DNA分子可以是天然发生的或合成的化合物(例如，通过重组DNA技术或通过化学合成产生的)，且可以是单链的或双链的。DNA分子可以具有任何长度。一般地，长度在10 bp到100000 bp之间变动，优选在100 bp到10000 bp之间，特别优选在500 bp到5000 bp之间。样品DNA中包含的DNA分子可以以纯化的形式存在(例如，在适合的缓冲溶液中提供的，例如本领域已知的TE或PBS)，或可以包括在未纯化的、部分纯化的或富集的样品溶液中。这样的未纯化的样品的实例包括粗的细胞溶胞产物、体液(例如，血液、血清、唾液和尿液)、溶解的组织，等等。在某些实施方式中，根据本发明的方法包括纯化这样的未纯化的样品中存在的 DNA。纯化一般在亚硫酸氢盐介导的DNA转化完成之后实现。纯化DNA的方法和相应的设备(任选地作为自动化系统或工作平台的整合部分)是本领域公知的，且可从许多供应商商业上获得。如在此使用的，术语“DNA报告分子”是指在它的核苷酸序列中包含至少一个未甲基化的胞嘧啶残基和至少一个标记物的DNA分子，其用作实际的底物，用于监视引起可检测标记物释放的亚硫酸氢盐介导的DNA转化。用至少一种DNA报告分子进行本发明的方法， 也就是说，用一种或更多种这样的分子。在采用超过一种DNA报告分子的情况下，它们一般是相同类型的(即，具有相同的核酸序列和/或标记物)。然而，还可能的是使用不同类型的 DNA报告分子(即，具有不同的核酸序列和/或标记物)。一般地，本发明中使用的DNA报告分子是具有10到150个核苷酸长度，例如，15到 80个核苷酸、15到60个核苷酸或15到40个核苷酸的核酸分子。DNA报告分子可以是天然发生的分子，或优选地，合成的分子(例如，通过重组DNA技术或化学合成产生的)。优选地， 本发明中使用的报告分子是单链核酸分子。然而，也可以采用双链分子。在优选的实施方式中，至少一种DNA报告分子是合成的寡核苷酸(S卩，单链的)。
为了进行检测反应，DNA报告分子包含一个或更多个可检测标记物。如在此使用的，术语“标记物”是指任何化合物或部分，其包含一种或更多种合适的化学物质或酶，其直接或间接地产生可检测化合物，或化学、物理或酶反应中的信号。如在此使用的，该术语将被理解为包括可检测标记物以及与一种或更多种这样的可检测标志物偶联的任何化合物。 此外，在本发明的范围内，干扰通过标记物的可检测信号产生的部分(例如，猝灭剂“劫持” 得自荧光团的激发的发射，只要猝灭剂和荧光团相互非常靠近)也属于标记物。标记物可以被掺入或附着于报告分子上，例如，以修饰的和/或标记的核糖核苷酸、脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸的形式。标记物可以附着到DNA报告分子的序列内的5’ -末端和/或3’ -末端和 /或任何内部核苷酸。可以根据本发明使用的可检测标记包括任何化合物，其在化学、物理或酶反应中直接或间接地产生可检测的化合物或信号。标记可以通过本领域公知的方法来实现(参见， 例如 Sambrook, J. et al.Iecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;以及 Lottspeich, F. , and Zorbas H. (l^^Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/ Berlin, Germany)。标记物可以特别地选自荧光标记物、酶标记物、着色标记物、产色标记物、发光标记物、放射性标记物、半抗原、生物素、金属络合物、金属和胶体金。所有这些类型的标记物是本领域中充分确立的。由这样的标记物介导的物理反应的实例是在辐射或激发时荧光或磷光的发射，或在使用放射性标记物时X-射线的发射。碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶以及β-内酰胺酶是酶标记物的实例，其催化产色反应产物的形成，并且它们可以用于本发明中。在本发明的特别优选的实施方式中，可检测标记物是荧光标记物。许多荧光标记物是本领域充分确立的，且可从不同的供应商商业上获得(参见，例如 The Handbook-Α Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, IOth ed. (2006)， Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAj USA)。对于检测这样的标记物，用于进行本发明的方法的设备可以包括检测系统，其适合于测定指示标记物的存在和/或量的值。适合的检测系统的选择取决于几个参数，例如用于检测的标记物的类型或进行的分析的种类。各种光学的和非光学的检测系统是本领域充分确立的。例如，可以在本发明中使用的荧光检测方法特别地包括荧光共振能量转移 (FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)和荧光相关光谱法。在特定的实施方式中，检测使用FRET或BRET进行，它们基于荧光或生物发光猝灭剂对的各自形成。例如，在 Liu, B. et al. (2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102， 589-593 中也描述了 FRET 的运用。例如，在 Xu, Y. et al. (1999)/￥oc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156 中详述了 BRET 的运用。至少一种DNA报告分子可以以未结合的形成来提供(即，在溶液中的游离分子)。在特定的实施方式中，DNA报告分子被固定在支持物上(S卩，附着于基质)。一般地，支持物是固体部件，例如，固体表面。DNA报告分子对支持物的附着可以通过DNA报告分子与给定支持物部件的任何直接的(例如，通过报告分子中包含的锚定基团)或间接的(例如，通过介导结合的捕获分子)相互作用实现。这种相互作用可以是共价的或非共价的结合，且一般是可逆的。例如，碳二亚胺化学作用可以用于共价地将DNA报告分子偶联到活化的表面。然后为此提供在DNA报告分子的5’或3’末端的适合的胺接头。用于实现DNA报告分子的固定的各种其他已确立的化学作用是本领域已知的。DNA报告分子可以固定在移动支持物上，优选地珠子，例如磁性珠子、聚苯乙烯珠子和乳胶珠子。这样的移动支持物部件可以在用于进行所述方法的传感设备的流体流动中转移。另一方面，还可能的是将DNA报告分子直接固定在反应区室的内表面上，或，例如，排布在反应区室中、但不能自由地转移的显微镜载玻片、晶片或陶瓷材料上。在某些实施方式中，将检测反应的结果与参考值比较，例如，用固定量的标记物获得的值(例如，作为内部对照提供的)，或与来自文献的数据比较。优选地，检测步骤在给定的时间内重复至少一次，例如，30分钟、60分钟、120分钟、6小时、12小时、24小时、48小时，等等。多次重复是可能的，例如，2、5、8、10、15、20、30
次，等等。重复可以在给定的时期内以固定时间间隔进行。然而，重复之间的时间间隔也可以变化，例如，随着亚硫酸氢盐介导的DNA转化达到完成而变得更短，以精确地测定反应的终点。换句话说，在检测期间获得的结果被用于控制DNA转化的发展。如果至少一种DNA 报告分子的亚硫酸氢盐介导的转化完成，认为的是同样适用于样品DNA。
在本发明中，所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子在相互流体连接的、空间上分隔的反应区室中提供。也就是说，样品DNA在第一反应区室中提供，且至少一种DNA报告分子在第二反应区室中提供，两个区室代表独立的实体。如在此使用的，术语“反应区室” (也称为“反应室”)是指用于容纳液体样品的任何结构。这样的结构的各种构造(例如，具有立方体的或圆柱形的三维形状)是本领域公知的。然而，反应区室不是独立的(self-contained)，而是相互流体连通的，也就是说， 成分的至少一部分可以在区室之间的流体流动中转移。例如，这可以通过经由微流通道连接反应区室的方式实现。在优选的实施方式中，反应区室之间的空间分隔通过半透膜、优选地大小排阻膜或微量渗析膜的方式实现。这样的半透膜容许小分子通过屏障，而保留较大的分子(即，超过膜的性质所决定的给定尺寸界限)。根据本领域已知的标准方案来进行向空间上分隔的反应区室添加亚硫酸氢盐(例如，亚硫酸氢钠，但任何其他盐同样是适合的)，用于介导样品DNA和至少一种DNA报告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶残基向尿苷残基的转化。试剂也可从不同的供应商商业上获得。在图1中示意地描绘了一般反应方案。DNA转化一般在40-70°C之间，优选 55-65°C之间，特别优选在60°C的反应温度下进行。孵育期可以在几分钟到几小时(例如，过夜)之间变化(特别是取决于要分析的样品)，或甚至更久。样品DNA和至少一种DNA报告分子的DNA转化在空间上分隔的反应区室中并行地 (即，在相同的实验条件下)发生。所需要的各自试剂可从特定的储存器添加到反应区室之一和/或两者中，在所述反应区室中提供了各自的DNA分子。为了调整特定的反应温度，进行本发明所采用的至少任何一个、优选地所有反应区室装备有一个或更多个温度控制单元，用于控制和调节反应区室内的温度。这样的温度控制单元可以包含一个或更多个独立的加热和/或冷却元件，其可以直接接触所使用的设备的一个或更多个反应区室。各种热控制系统是本领域公知的，且可从不同的供应商获得。酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)通常在PCR反应中使用，来阻止来自先前反应的潜在污染性PCR产物的“遗留(carry-over)”。它可从许多供应商商业上获得，且作用于单链以及作用于双链的DNA。UNG是细胞的DNA修复机构的一部分，任务是除去尿苷残基。如果胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，尿苷仅可以在DNA中存在，引起DNA中的突变。该酶从DNA的糖-磷酸盐骨架上除去尿嘧啶碱基，反应在图2中示意性说明。这个反应是所谓的碱基切除修复机制的一部分，在这种情况下阻止DNA中的胞嘧啶脱氨基突变。任何已知的尿嘧啶-DNA-糖基化酶都可以在本发明中采用。所述酶被添加到至少一种DNA报告分子，而不是样品DNA。取决于所采用的特定的酶，在建立的标准反应条件下在DNA骨架上发生酶反应(S卩，在亚硫酸氢盐介导的转化期间获得的尿嘧啶碱基的脱除)。在优选的实施方式中，使用热稳定的UNG，特别是来自嗜热生物的UNG酶。这样的热稳定的UNG酶是本领域已知的(例如，Sartori，A. A. et al(200lV； Biol. Chem. 276， 29979-29986 ；Sartori, A. A. et al (2002)EMBO J. 21，3182-3191)。它们甚至在超过 90°C的温度下维持高活性。UNG介导的酶反应可以在提供至少一种DNA报告分子的同一反应区室中进行，或在进一步的(即，第三个)反应区室中进行，所述反应区室是空间上分隔的、但是与其中提供至少一种DNA报告分子的区室流体连通。必需的试剂可以从与各自的反应区室流体连通的特定储存器中提供。在UNG处理之后获得的DNA报告分子仍然具有完整的DNA骨架，但是具有已经移除了尿嘧啶碱基的一个或多个无碱基位点。这些无碱基位点在提高的温度下，例如，90°C到 95°C之间的温度下对水解切割是敏感的。在本发明中，热诱导的断裂可以进行各种时期，例如，10秒、30秒、1分钟、2分钟、5 分钟，这取决于存在的DNA的类型和量。本领域技术人员充分了解如何选择孵育时间。热诱导的断裂步骤可以在其中提供至少一种DNA报告分子的同一反应区室中进行(任选地在其中还发生UNG介导的反应)，或在另一个空间上分隔的反应区室中进行。后一区室可以是其中发生UNG介导的反应的同一反应区室(S卩，第三个反应区室)，或是与第二区室和/或第三区室空间上分隔的、但流体连通的进一步的(即，第四个)区室。最后，检测步骤可以在其中提供至少一种DNA报告分子的同一反应区室中进行 (以及任选地其中还发生UNG介导的反应和热诱导的断裂)，或在另一个空间上分隔的反应区室中进行。后一区室可以是已如上描述的第三区室或第四区室，或它可以是与第二区室和/或第三区室和/或第四区室空间上分隔、但流体连通的进一步的(即，第五个)区室。根据本发明的方法的原理在图3中示意性地概括。在某些实施方式中，相互流体连接的至少两个空间上分隔的反应区室被整合到传感设备、优选地连续传感设备中。进而，传感设备可以是自动化平台或工作站的整合部分， 所述自动化平台或工作站还包括，例如，用于DNA样品纯化、和/或用于随后的差异甲基化分析的装置(例如，用于进行PCR反应的热循环仪)。这样的平台是本领域已知的和商业上可获得的。在另一个方面，本发明涉及在此限定的方法用于分析样品DNA的甲基化状态的用途。换句话说，用于监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的本方法是通过提供高质量 (即，完全转化的)DNA来确保下游应用的准确性和可靠性的先决条件。这样的下游应用包括亚硫酸氢盐测序、甲基化敏感性单链构像分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)、甲基化敏感性微阵列应用、组合的亚硫酸氢盐限制分析(COBRA)、甲基化敏感性实时PCR应用，等等。在优选的实施方式中，DNA甲基化状态的分析被用于诊断癌症。通过附图和以下的实施例进一步描述本发明，其仅仅是为了说明本发明的特定实施方式的目的，而无论如何不被看作是限制本发明的范围。
实施例^MM 1 在连续传感设各中监视I硫酸氡龙介导的DNA转化
在这个实施方式中，在示范性的连续传感器中进行根据本发明的方法，所述连续传感器在图4中示意性地说明。在这样的情况下，希望的是所述方法的不同步骤在不同的空间上分隔的反应区室中发生。传感设备的这种结构防止了不同的方法步骤之间的干扰以及反应成分之间的不相容性。例如，尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的酶活性可能在热断裂步骤期间显著地降低。图4中显示的传感设备具有至少五个空间上分隔的反应区室。在第一反应区室中，提供样品DNA。样品DNA可以从这个区室中移除用于甲基化状态的随后的分析(未显示)。第一区室连接到适合数量的储存器，其含有用于DNA的制备和转化的必要的成分(例如，亚硫酸氢盐溶液)。第一反应区室紧密邻近于第二反应区室定位，在第二反应区室中至少一种DNA报告分子(即，标记的合成的DNA寡核苷酸)。两个反应区室之间的空间分隔以一定方式实现，从而转化试剂可以通过，但是样品DNA被保留在第一室中，也就是说，通过半透性的屏障，例如，通过大小排除(过滤)膜。换句话说，两个反应区室是互相流体连通的。通过采用一个或更多个加热(和/或冷却)元件，可以控制第一和第二反应区室中的温度，以容许适合的反应条件(例如，60°C)的调整。在第三反应区室中，提供了 UNG酶，且发生尿嘧啶碱基从“转化的”至少一种DNA报告分子上脱除。第二和第三反应区室之间的空间分隔以这样的方式实现，从而缓冲成分可以被替换或移动，例如，通过微量渗析膜的方式，来产生UNG酶的最佳反应条件。在邻近于第三区室定位的第四反应区室中，在无碱基位点发生DNA报告分子的热诱导的水解切割。第三和第四反应区室之间的空间分隔以这样的方式配置，从而UNG酶分子被保留，而DNA报告分子不保留，例如，通过(半透性的)大小排阻(过滤)膜的方式。在邻近于第四区室定位的第五个反应区室中，对前述断裂步骤期间释放的标记物 (例如，荧光染料)进行检测。第四和第五反应区室之间的空间分隔以这样的方式配置，从而标记物和断裂的DNA报告分子可以通过第五反应区室，但是任何完整的DNA报告分子被保留在第四反应区室中，例如，通过(半透性的)大小排阻(过滤)膜的方式。在反应方案开始时在第二反应区室中提供的至少一种DNA报告分子的量优选地是这样，从而进入随后的反应途径的部分在分析的时间被认为是恒定的。标记物的检测的数量则是DNA转化的度量。标记物产生的信号被标准化为进入第三反应区室的DNA报告分子的部分，例如， 通过核酸含量的UV测量的方式测定的。未转化的、因而不被UNG和热量的组合作用断裂的DNA报告分子的部分被重新导回第二反应区室。然后，这些DNA报告分子再次进入转化反应。例如，这可以通过第四和第二反应区室之间的连接(闭环结构，未在图4中示出)来实现。常规的微流设备可以用于限制液体和试剂的量，以及启动系统。实施例2 两倍标记的DNA报告分子的使用
在根据本发明的方法的进一步的实施方式中，至少一种DNA报告分子(S卩，合成的寡核苷酸)包含第一和第二标记物。所述第一标记物是荧光染料，其可以选自多种商业上可获得的染料。第二种标记物是这种染料的适合的猝灭剂。可选地，第二分子是另一种荧光染料，其与第一染料一起形成荧光共振能量转移(FRET)的供体-接受体对。在DNA报告分子的热诱导的断裂时，第一荧光染料与猝灭剂分子分离。可选地， FRET供体-接受体对相互分离。然后在热诱导的断裂步骤中荧光信号已经是可检测的。因此，通过组合断裂和检测步骤，图4中说明的传感设备的至少五个反应区室之一是可有可无的，产生所述设备的简化的结构。^MM 3 固定在珠子卜.的DNA报告分子的#用
对于某些应用，可能优选的是产生仅少数数据点，例如，来限制试剂的量、能量消耗，等等。在这样的情况下，至少一种DNA报告分子(S卩，合成的寡核苷酸)包含附着于一个末端、 例如3’-末端的适合的标记物，通过另一个末端、例如5’-末端固定在移动表面上，优选的珠子，例如聚苯乙烯珠子或磁性珠子。在一个具体的实施方式中，珠子被保留在示范性的传感设备的第二反应区室中， 且在某些时间点，珠子的一部分可以被释放进入进一步的一个或更多个区室。图5中示意性地显示了在具有两个空间上分隔的反应区室的示范性的传感设备中，通过利用固定在固相支持物(即，珠子表面)上的DNA报告分子的部分，离散的数据点的采集。图A-C说明了部分释放的示意性的时间系列。图D代表了测定DNA转化效力的可能的曲线。在第二反应区室中固定在珠子上的DNA报告分子的使用还允许交换这个区室中的溶液，同时保留DNA报告分子。因而图5显示的传感设备的第二和第三反应区室之间缓冲液平衡的要求是可有可无的，且可以省略。此外，来自第二反应区室的DNA报告分子的部分释放容许更精确控制转移到进一步的一个或更多个反应区室的DNA报告分子的绝对数量(因为每个珠子的DNA报告分子的数量以及每次释放的珠子的数量是已知的)。进而促进了未转化的/转化的DNA报告分子的比例的计算。将珠子限制在第二反应区室中可以通过，例如，与磁场的应用一起使用磁性珠子， 或通过与AC电场以及介电泳力一起使用聚苯乙烯珠子来实现。实施例4 在反应区室的内表面上固定的DNA报告分子的使用
在进一步的实施方式中，采用包含第一和第二反应区室的传感设备进行本发明的方法。所述传感设备在图6中示意性地说明。第一反应区室(其中提供样品DNA)连接到含有亚硫酸氢盐转化所需试剂的储存
ο第二反应区室连接到含有处于适合的缓冲液中的UNG酶的至少一个储存器。至少一种DNA报告分子(S卩，标记的合成的寡核苷酸)被固定在第二反应区室的内表面上，例如， 通过使用碳二亚胺化学作用，以及DNA报告分子的一个末端的氨基接头。DNA报告分子的另一个末端用合适的标记物，例如，荧光染料来修饰。第一和第二反应区室是空间上分隔的，但是相互流体连通，从而容许缓冲液和/ 或转化试剂的交换，但样品DNA和酶不能通过，例如，通过半透性大小排除滤膜的方式。两个反应区室中的温度可以调节到容许高效的亚硫酸氢盐介导的DNA转化的水平。然而，第二反应区室中的温度可以独立于第一反应区室地调节，例如，通过使用第二加热(和/或冷却)元件。在第一个方法步骤中，两个反应区室中的缓冲条件和温度都适合于转化样品DNA 和固定的DNA报告分子(图6A )。在第二个步骤中，第二反应区室中的温度被降低，容许发生UNG反应，例如，37°C。 然后，来自储存器的UNG酶被应用于第二区室(图6B)。在第三步骤中，第二反应区室中的温度被提高，例如，提高到95°C，以在无碱基位点断裂DNA报告分子(图6C)。从断裂的DNA报告分子上释放的标记物然后通过合适的检测器来测量。可选地，通过与TIRF、共焦扫描器等一起使用荧光标记物，可以测量处在表面的仍然完整的DNA报告分子的标记物。在第二反应区室中的热处理之后，温度再次降低到第一反应区室的温度，以继续转化反应。在某些时间点，重复该方案，产生表示随着时间的过去的转化效率的不连续的曲线(类似于图6D)。在第二区室中的UNG处理、热诱导的断裂和标记物检测期间，第一区室中的温度一般被降低以停止样品DNA的转化。这容许两个区室中获得的转化反应的更好的相关。因而，在这个实施方式中，进行连续测量，并且更为精细的温度控制是必需的，但是降低了所需区室的复杂性和数量。实施例5 热稳定的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的使用
在根据本发明的方法的另一个实施方式中，使用热稳定的UNG酶，其在热断裂期间保持活性。然而优选地，使用来自嗜热生物的UNG酶。这样的热稳定的UNG酶是本领域已知的 (例如，Sartori, A. A. et al (2001)7； Biol. Chem. 276，29979-29986 ；Sartori, Α. Α. et aim奶EMBO J. 21，3182-3191)。它们甚至在超过90°C的温度下保持高活性。传感设备中的断裂步骤在90°C到95°C之间的温度下进行。因而，在热诱导的断裂期间和之后， 热稳定的UNG酶保持活性。在这个实施方式中，在第二反应区室中与DNA报告分子(S卩，标记的合成的寡核苷酸)一起提供UNG酶，所述DNA报告分子被固定在区室的内表面上。与第二反应区室中的两步骤温度方案一起，没有酶储存器的双区室传感设备则是足够的。两个区室再次通过半透性大小排除滤膜的方式连接，以防止反应区室之间酶和样品DNA的交换。采用的传感设备的例示在图7中给出。检测可以如上文实施例1-5描述的进行。实施例6 样品DNA纯化
为了进一步分析亚硫酸氢盐介导转化后的样品DNA，例如，通过甲基化特异性PCR或任何其他适合的技术，样品DNA必需以纯化的形式提供。因而，例如，用于使用适合的结合缓冲液(例如，具有高含量的离液盐)将DNA结合
13到二氧化硅膜上、用适合的缓冲液(例如，具有高含量的乙醇)洗涤结合的DNA，以及用适合的缓冲液(例如，水或其缓冲的溶液)洗脱DNA的装置和试剂可以被包括在根据本发明的方法中。这可以通过提供附着到第一反应区室的出口、含有所述二氧化硅膜的出口以及各自试剂溶液的储存器来实现。在此说明性地描述的本发明可以在缺少没有在此具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下进行。因而，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等等应当可扩展地和无限制地阅读。另外，在此采用的术语和表述被用作说明的术语，而不是限制的术语，在使用这样的术语和表述时不意图排除所显示和描述的特征的任何等价物或其部分， 而是认识到的是各种修饰在要求保护的本发明的范围内是可能的。因而，要理解的是，虽然本发明已经通过实施方式和任选的特征具体地公开，其中蕴含的本发明的修改和变化可以由本领域技术人员采用，这种修改和变化被认为处于本发明范围内。在此已经广泛地和一般地描述了本发明。落入一般性公开的各种更窄的类别和亚属分组也构成本发明的部分。这包括带有从所述属中除去任何主题的条件性或否定性限制的本发明的一般性描述，无论所除去的材料是否在此具体地叙述。其他实施方式处于所附的权利要求之内。此外，当按马库什组的方式描述本发明的特征或方面时，本领域的技术人员将认识到，本发明也由此对于马库什组的任何独立成员或成员的亚组描述。
权利要求
1.用于在DNA甲基化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的方法，包括(a)提供要分析的样品DNA和至少一种DNA报告分子，其中所述至少一种DNA报告分子包含(i)在它的核苷酸序列中至少一个未甲基化的胞嘧啶残基；以及(ii)至少一种标记物；以及其中所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子在相互流体连接的、空间上分隔的反应区室中提供；(b)向所述空间上分隔的反应区室添加亚硫酸氢盐，从而介导所述样品DNA和所述至少一种DNA报告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶残基向尿苷残基的转化；(c)向所述至少一种DNA报告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，从而介导步骤(b)中获得的尿嘧啶碱基从DNA主干上脱除；(d)通过热处理来断裂步骤(c)中获得的DNA；以及(e)检测在步骤(d)期间从所述至少一种合成的DNA报告分子释放的至少一种标记物。
2.权利要求1的方法，进一步包括(f)将(e)中获得的结果与参考值比较。
3.权利要求1或2的方法，其中所述检测步骤在给定的时间期内重复至少一次。
4.权利要求1到3的任一项的方法，其中步骤(e)中获得的结果被用于控制根据步骤 (b)的反应的发展。
5.权利要求1到4的任一项的方法，其中所述至少一种DNA报告分子是合成的寡核苷酸。
6.权利要求1到5的任一项的方法，其中所述至少一种合成的DNA报告分子被固定在支持物上。
7.权利要求1到6的任一项的方法，其中所述尿嘧啶-DNA-糖基化酶是热稳定的。
8.权利要求1到7的任一项的方法，其中步骤(c)、(d)和(e)在提供所述至少一种DNA 报告分子所采用的同一反应区室中进行。
9.权利要求1到7的任一项的方法，其中步骤(c)、(d)和(e)的任何一个或多个在与提供所述至少一种DNA报告分子所采用的反应区室流体连接的至少一个进一步的空间上分隔的反应区室中进行。
10.权利要求1到9的任一项的方法，其中至少任何一个、优选地所有反应区室装备有一个或更多个温度控制单元，用于控制和调节一个或更多个反应区室内的温度。
11.权利要求1到10的任一项的方法，其中反应区室之间的空间分隔通过半透膜、优选地大小排阻膜或微量渗析膜的方式实现。
12.权利要求1到11的任一项的方法，其中相互流体连接的至少两个空间上分隔的反应区室被整合到传感设备、优选地连续传感设备中。
13.权利要求1到12的任一项中限定的方法用于分析样品DNA的甲基化状态、或在分析样品DNA的甲基化状态时的用途。
14.权利要求13的用途，其中进行DNA甲基化状态的分析用于诊断癌症。
15.权利要求1的报告分子在分析DNA甲基化状态的过程中的用途。
全文摘要
本发明涉及在DNA甲基化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的方法。所述方法基于酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)与至少一种标记的DNA报告分子的反应，所述报告分子在其序列中包含至少一个未甲基化的胞嘧啶残基。在尿苷残基中未甲基化的胞嘧啶残基的亚硫酸氢盐介导的转化之后，UNG从DNA骨架中除去尿嘧啶碱基，因而使得它对热诱导的水解切割敏感。最后，检测在这种断裂过程期间从DNA报告分子释放的标记物。
文档编号C12Q1/68GK102549168SQ201080042611
公开日2012年7月4日 申请日期2010年9月15日 优先权日2009年9月23日
发明者I.佩茨 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司