粗基质中的核酸的检测的制作方法

专利名称：粗基质中的核酸的检测的制作方法
技术领域：
本揭示内容涉及通过扩增方法检测粗基质中的核酸。
背景技术：
等温扩增方法能够使核酸靶标在几分钟内以特异性方式从痕量水平扩增到极高且可检测水平。所述等温方法(例如重组酶聚合酶扩增(RPA))可使基于核酸的诊断的应用扩大到例如重点照护测试与现场和消费者测试(field and consumer testing)等新兴领域。所述技术的等温和宽温度范围可允许用户避免使用复杂的需求电力的仪器。

发明内容
本发明至少部分是基于以下发现可不进行核酸提取和/或纯化在粗基质中检测各种病原性有机体。使用粗基质不进行核酸提取和/或纯化可为上述等温核酸扩增方法的优点增加简单试样制备的优点。在一些情形下，简单处理(例如碱裂解或裂解酶处理)对于检测即足够。在一些其它情形下，可以高敏感性检测有机体的靶核酸序列，而无利用常规裂解溶液预处理试样的任何需要。相反，使试样与等温扩增反应接触可足够以高敏感性检测有机体。在一个方面中，本揭示内容的特征在于包括以下的方法使粗基质与靶核酸物质的等温核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物；在足以进行等温核酸扩增反应的条件下培育所述混合物，由此提供产物；和确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。在另一方面中，本揭示内容的特征在于包括以下的方法使粗基质与靶核酸物质的核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物；将所述混合物在低于95°C (例如，低于90°C、低于85°C、低于80。。、低于75。。、低于70°C、低于65°C、低于60°C、低于55。。、低于50°C、低于45°C或低于40°C)的温度下维持足以进行核酸扩增反应的时间，由此提供产物；和确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。在另一方面中，本揭示内容的特征在于包括以下的方法使粗基质与靶核酸物质的核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物；将所述混合物的摄氏温标温度改变小于30% (例如，小于25%、小于20%、小于15%、小于10%或小于5% )或小于20°C (例如，小于15°C、小于10°C、小于5°C、小于2°C或小于1°C )达足以进行核酸扩增反应的时间，由此提供产物；和确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
在另一方面中，本揭示内容的特征在于包括以下的方法实施混合物的等温反应以提供产物，所述混合物包含粗基质和靶核酸物质的核酸扩增反应的组份；和确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
在另一方面中，本揭示内容的特征在于包括以下的方法使混合物在最高800C (例如，最高75°C、最高70°C、最高65°C、最高60°C、最高55°C、最高50°C、最高45°C或最高40°C )的温度下反应以提供产物，所述混合物包含粗基质和靶核酸物质的核酸扩增反应的组份；和确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。在另一方面中，本揭示内容的特征在于包括以下的方法使混合物反应，同时将混合物的摄氏温标温度改变至多30% (例如，至多25%、至多20%、至多15%、至多10%或至多5%)或至多20°C (例如，至多15°C、至多10°C、至多5°C、至多2°C或至多1°C )以提供产物，所述混合物包含粗基质和靶核酸物质的核酸扩增反应的组份；和确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。在上述方面的一些实施例中，粗基质包括生物试样，例如血液、尿、唾液、痰、淋巴、血浆、精液、肺吸出物和脑脊液中的至少一者。在一些实施例中，生物试样包括至少一种选自由以下组成的群组的试样咽拭子、鼻拭子、阴道拭子或直肠拭子。在一些实施例中，生物试样包含活检试样。在上述方面的一些实施例中，粗基质未经受裂解处理。 在上述方面的一些实施例中，粗基质未用离液剂、洗涤剂或裂解酶制剂处理。在上述方面的一些实施例中，粗基质未经受高温(例如，80°C或更高、85°C或更高、90°C或更高或95°C或更高)热处理步骤。在上述方面的一些实施例中，粗基质未经受裂解处理且靶核酸物质是葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA))核酸。在上述方面的一些实施例中，粗基质未经受裂解处理且靶核酸物质是支原体核酸。在上述方面的一些实施例中，粗基质可经受裂解处理。例如，用洗涤剂和/或裂解酶(例如噬菌体溶菌素(例如，链球菌Cl噬菌体溶菌素(PlyC)))处理粗基质。在上述方面的一些实施例中，粗基质经受裂解处理且靶核酸物质是链球菌(例如，A组链球菌或B组链球菌)核酸。在上述方面的一些实施例中，粗基质经受裂解处理且靶核酸物质是沙门氏菌(例如，鼠伤寒沙门氏菌)核酸。在上述方面的一些实施例中，靶核酸是来自(例如)选自以下的细菌或来自本文所述另一细菌的细菌核酸沙眼衣原体、奈瑟氏淋病双球菌、A组链球菌、B组链球菌、难辨梭状芽孢杆菌、埃希氏大肠杆菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、阴道加德纳氏菌、人型支原体、活动弯曲杆菌属、普雷沃氏菌属和红棕色单胞菌属。在上述方面的一些实施例中，靶核酸是哺乳动物核酸，例如核酸与肿瘤细胞有关。在上述方面的一些实施例中，靶核酸是(例如)来自HIV、流感病毒或登革病毒或来自本文所述另一病毒的病毒核酸。在上述方面的一些实施例中，靶核酸是(例如)来自白色念珠菌或本文所述另一真菌的真菌核酸。在上述方面的一些实施例中，靶核酸是(例如)来自毛滴虫或本文所述另一原生动物的原生动物核酸。在上述方面的一些实施例中，等温核酸扩增反应是重组酶聚合酶扩增。在一些实施例中，等温核酸扩增反应是转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增、信号介导的RNA扩增、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA等温扩增、等温多重置换扩增、解链酶依赖性扩增、单引物等温扩增、环解链酶依赖性扩增或切口和延长扩增反应。在上述方面的一些实施例中，反应条件包含(例如)浓度大于1%的聚乙二醇(PEG)。在另一方面中，本揭示内容的特征在于检测特定DNA或RNA物质的方法，其中使试样在未经离液剂、洗涤剂先前裂解处理、无高温热处理步骤或裂解酶制剂的情况下与反应再水合缓冲液或水合反应系统接触，并且扩增到可检测水平。在一些实施例中，靶核酸物质包括金黄色葡萄球菌或MRSA的基因组DNA。在一些实施例中，扩增方法是重组酶聚合酶扩增(RPA)方法。在一些实施例中，再水合缓冲液或完全再水合扩增环境中包括浓度大于1%的聚乙二醇。 在另一方面中，本揭示内容的特征在于包括等温核酸扩增反应的组份和裂解酶的试剂盒。等温核酸扩增反应的组份可包括(例如)重组酶。在一些实施例中，裂解酶包括噬菌体溶菌素，例如链球菌Cl噬菌体溶菌素(PlyC)。在另一方面中，本揭示内容的特征在于包括等温核酸扩增反应的组份和侧向流动或微流体装置(例如，用于检测反应产物)的试剂盒。等温核酸扩增反应的组份可包括(例如)重组酶。在另一方面中，本揭示内容的特征在于包括等温核酸扩增反应的组份和拭子(例如，用于获得生物试样)的试剂盒。等温核酸扩增反应的组份可包括(例如)重组酶。在上述试剂盒中任一者的一些实施例中，试剂盒不包括用于核酸纯化或提取的试齐U，例如离液剂和/或核酸结合介质。如本文所用“粗基质”是包括来自生物来源的核酸的基质，其中基质未经受核酸提取和/或纯化。在一些实施例中，生物来源包括细胞和/或生物试样(例如，来自患者)和/或环境试样。细胞和/或生物试样和/或环境试样可未裂解或经受裂解步骤。除非另有说明，否则本文所用所有技术和科学术语皆具有与所属领域技术人员通常所了解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与彼等本文所述者类似或等效的方法和材料，但下文仍对适宜方法和材料加以阐述。本文所提及的所有出版物、专利申请案、专利和其它参考文献的全部内容都以引用方式并入本文中。如果出现冲突，则以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅具有阐释性而非限制性。本发明的其它特征和优点从下列实施方式和权利要求书将显而易见。


图IA-B是绘示10，OOOcfu、IOOOcfu和IOOcfu鼠伤寒沙门氏菌在未裂解下(IA)或碱裂解之后(IB)检测的线形图。图2是绘示未裂解(无裂解)、用变溶菌素和溶菌酶(ML/LZ)处理、用PlyC(PLYC)处理或用变溶菌素、溶菌酶和PlyC(ML/LZ/PLYC)处理的Str印A的检测的线形图。图3是绘示用0、1、2或3个单位溶葡萄球菌素处理的患者试样中的金黄色葡萄球菌的检测的线形图。图4是绘示煮沸45分钟(煮沸)、用溶葡萄球菌素处理并煮沸5分钟(溶葡萄球菌素)、或于室温下在水中培育45分钟的患者试样中的金黄色葡萄球菌的检测的线形图。将试样与具有50或1000个靶核酸拷贝的阳性对照比较。图5是绘示未裂解(Unlysed)或用溶葡萄球菌素裂解并提取(清洁)的患者试样中的金黄色葡萄球菌的检测的线形图。将试样与具有50或1000个靶核酸拷贝的阳性对照进行比较。图6是绘示未裂解的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)试样的检测的线形图，所述试样具有约10个有机体(10个细菌)或约100个有机体(100个细菌)。将试样与具有50个靶核酸拷贝(50个PCT产物拷贝)的阳性对照或作为阴性对照(NTC)的水进行比较。图7是绘示50cfu、IOOcfu或IOOOcfu未裂解支原体或培养基对照的检测的线形图。
具体实施例方式本发明提供粗基质中的核酸的等温扩增方法，其用于检测核酸靶标。在一些实施例中，使粗基质与靶核酸物质的等温核酸扩增反应(例如，RPA)的组份接触以提供混合物。随后在足以进行扩增反应的条件下培育混合物并产生经评估以确定是否存在靶核酸物质的指示物的产物。如果在产物中发现靶核酸物质的指示物，则可推断原始粗基质中存在靶核酸物质。在一些实施例中，粗基质包括生物试样，例如从植物或动物个体获得的试样。如本文所用生物试样包括可用于检测个体中的核酸的所有临床试样，其包括但不限于细胞、组织(例如，肺、肝和肾组织)、骨髓吸出物、体液(例如，血液、血液衍生物和血液馏份(例如血清或黄层)、尿、淋巴、泪、前列腺液、脑脊液、气管吸出物、痰、脓、鼻咽吸出物、口咽吸出物、唾液)、眼拭子、颈部拭子、阴道拭子、直肠拭子、大便和大便悬浮液。其它适宜试样包括从中耳液、支气管肺泡灌洗液、气管吸出物、痰、鼻咽吸出物、口咽吸出物或唾液获得的试样。在特定实施例中，生物试样是从动物个体获得。可获得获取所述试样的标准技术。参见(例如)施拉格(Schluger)等人，实验医学杂志(J. Exp. Med.) 176 =1327-33 (1992);比格比(Bigby)等人，美国呼吸疾病评论(Am. Rev. Respir. Dis.) 133 =515-18 (1986);科瓦克斯(Kovacs)等人，新英格兰医学杂志(NEJM) 318 :589-93 (1988);和奥尼贝内(Ognibene)等人，美国呼吸疾病评论129 :929-32 (1984)。在一些实施例中，粗基质包括环境试样，例如表面试样(例如，通过擦拭或真空处理获得)、空气试样或水试样。在一些实施例中，粗基质包括分离的细胞，例如动物、细菌、真菌(例如，酵母)或植物细胞和/或病毒。可使用常规方法和适于所培养细胞类型的条件培养分离的细胞。可使粗基质与基本上原样使用或经受一个或一个以上不包括核酸提取和/或纯化的预处理步骤的核酸扩增组份接触。在一些实施例中，利用例如洗涤剂和/或裂解酶制剂使粗基质经受裂解。在一些实施例中，粗基质未经受利用离液剂、洗涤剂或裂解酶制剂进行的处理，且粗基质未经受高温(例如，高于80°C、高于85°C、高于90°C或高于95°C )。在任一或所有上述条件下，粗基质中存在的靶核酸可接近等温核酸扩增机器以便可发生扩增。已知各种核酸扩增技术，包括例如重组酶聚合酶扩增(RPA)、转录介导的扩增、基、于核酸序列的扩增、信号介导的RNA扩增技术、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA等温扩增、等温多重置换扩增、解链酶依赖性扩增、单引物等温扩增、环解链酶依赖性扩增以及切口和延长扩增反应(参见US 2009/0017453)。聚合酶链反应是最广泛已知的方法，但区别在于其需要使用热循环以引起核酸链分离。这些扩增方法和其它扩增方法论述于以下中例如，凡尼思(VanNess)等人，美国科学院院报(PNAS) 2003，第100卷，第8期，第4504至 4509 页；谭(Tan)等人，分析化学(Anal. Chem.) 2005，77，7984-7992 ;利泽德(Lizard)等人，自然生物技术(Nature Biotech.) 1998,6,1197-1202 ;纳富(Notomi)等人，核酸研究(NAR) 2000，28，12，e63 ;和克恩(Kurn)等人，临床化学杂志(Clin. Chem.) 2005, 51 10，1973-1981。有关这些常用扩增技术的其它参考文献包括例如美国专利第7，112，423号、第 5, 455, 166 号、第 5, 712, 124 号、第 5, 744, 311 号、第 5, 916, 779 号、第 5, 556, 751号、第 5，733，733 号、第 5，834，202 号、第 5，354，668 号、第 5，591，609 号、第 5，614，389号、第5，942，391号；和美国专利公开案第US20030082590号、第US20030138800号、第 US20040058378号和第US20060154286号。所有上述文件都以引用方式并入本文中。RPA是一种例示性等温核酸扩增方法。RPA采用称作重组酶的酶，其能够使寡核苷酸引物与双螺旋DNA中的同源序列成对。以此方式，DNA合成涉及试样DNA中的界定点。如果存在靶序列，则使用两种基因特异性引物开始指数式扩增反应。反应快速进展且在20到40分钟内从数个靶拷贝特异性扩增到可检测水平。RPA方法揭示于(例如)US 7, 270,981,US 7, 399, 590,US 7, 777, 958,US 7, 435, 56UUS 2009/0029421 和 PCT/US2010/037611 中，所有案件都以引用方式并入本文中。RPA反应含有蛋白质与所需用以支持系统的重组元件的活性的其它因子以及支持从与互补底物成对的寡核苷酸的3'末端DNA合成的因子的掺合物。重组系统的关键蛋白组份是重组酶自身，其可源自原核、病毒或真核来源。另外，然而，需要单链DNA结合蛋白质以在各种在反应中进行的交换交易期间使核酸稳定。由于许多底物的特征仍为部分双螺旋，所以特别需要具有链置换特征的聚合酶。在反应能够从痕量水平的核酸扩增的一些实施例中，可使用包括使用拥挤试剂(例如，聚乙二醇)和负载蛋白的活体外条件。已报告包含噬菌体T4UvsX重组酶、噬菌体T4UvsY负载试剂、噬菌体T4gp32和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)聚合酶I大片段的例示性系统。可以溶液和/或干燥(例如，冻干)形式提供等温扩增反应的组份。在以干燥形式提供一种或一种以上组份时，还可使用再悬浮或重构缓冲液。基于扩增反应的特定类型，反应混合物可含有缓冲液、盐、核苷酸和进行反应必需的其它组份。可在适合于反应的特定温度下培育反应混合物。在一些实施例中，将维度维持于80°C或以下，例如，70°C或以下、60°C或以下、50°C或以下、40°C或以下、37°C或以下或30°C或以下。在一些实施例中，将反应混合物维持于室温下。在一些实施例中，在整个反应时间内将混合物的摄氏温标温度改变小于25% (例如，小于20%、小于15%、小于10%或小于5% )和/或在整个反应时间内将混合物的温度改变小于15°C (例如，小于10°C、小于5°C、小于2°C或小于1°C )。靶核酸可为存于动物(例如，人类)、植物、真菌(例如，酵母)、原生动物、细菌或病毒物质中的核酸。例如，靶核酸可存于目标有机体的基因组中(例如，在染色体上)或存于染色体外核酸上。在一些实施例中，靶核酸是RNA，例如mRNA。在特定实施例中，靶核酸对目标有机体具有特异性，也就是，在其它有机体中未发现靶核酸或者在与目标有机体类似的有机体中未发现靶核酸。靶核酸可存于细菌(例如格兰氏(Gram)阳性或格兰氏阴性细菌)中。例示性细菌种类包括不动杆菌属(Acinetobacter sp.)菌株ATCC 5459、乙酸I丐不动杆菌属、绿浅气球菌(Aerococcus viridans)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特菌(Bordetellaparapertussis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、难辨梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体、弗氏梓樣酸杆菌属(Citrobacter freundii)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、鹁鸡肠球菌属(Enterococcus gal I inarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、类肠球菌(Enterobacter faecalis)(例如，ATCC29212)、埃希氏大肠杆菌(例如，ATCC 25927)、阴道加德纳氏菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(例如，ATCC 49247)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)(例如，ATCC 33495)、单核细胞增生李斯成氏菌(Listeria monocytogenes)(例如，ATCC7648)、微球菌(Micrococcus sp.)菌株 ATCC 14396、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、偶然分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)、肺炎支原体、人型支原体、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitis)(例如，ATCC 6250)、奈瑟氏淋病双球菌、尿道寡源杆菌(Oligella urethralis)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、绿胺杆菌(Pseudomonasaeruginosa)(例如，ATCC 10145)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、沙门氏菌菌株ATCC31194、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)(例如，ATCC 8101)、金黄色葡萄球菌(例如，ATCC 25923)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(例如，ATCC 12228)、里昂葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、肺炎链球菌(例如，ATCC 49619)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(例如，ATCC 13813)、苍白密螺旋体(Treponemapalliduma)、草绿色链球菌(Viridans group streptococci)(例如，ATCC 10556)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、錯状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、蜃楼弗朗西丝氏菌(Francisella philomiragia) (GA01-2810)、土拉热弗朗西丝菌(Francisellatularensis) (LVSB)、假结核病耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis) (PB1/+)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、0:9血清型或鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis) (P14-)。在一些实施例中，祀核酸存于选自以下的细菌属物质中不动杆菌属、气球菌属(Aerococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、博德特菌(Bordetella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭状芽抱杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、衣原体(Chlamydia)、梓檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、李斯成氏菌属(Listeria)、微球菌属(Micrococcus)、动弯杆菌(Mobilincus)、莫拉菌属(Moraxella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体、奈瑟球菌、寡源杆菌属(Oligella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、红棕色单胞菌属(Porphyromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属、粘质沙雷菌属(Serratia)、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属(Treponema)、芽胞杆菌属(Bacillus)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)或耶尔森菌属(Yersinia)。在一些实施例中，在A组链球菌或B组链球菌中发现靶核酸。例示性衣原体靶核酸包括在衣原体隐性质粒上发现的序列。例示性结核分枝杆菌(M. tuberculosis)祀核酸包括于IS6110 (参见US5，731，150)和/或IS1081(参见巴哈德(Bahador)等人，2005，农业生物科学研究杂志(Res. J. Agr. Biol. Sci.)，I :142-145)中发现的序列。例示性奈瑟氏淋病双球菌靶核酸包括于NG00469 (参见皮耶卡罗维奇 (Piekarowicz)等人，2007，BMC 微生物(BMC Microbiol.) 7 :66)和 NG00470 中发现的序列。例示性A组链球菌靶核酸包括于Spyl258 (参见刘(Liu)等人，2005，微生物研究(Res. Microbiol)，156 :564-567)、Spy0193、lytA、psaA 和 ply (参见 US 2010/0234245)中发现的序列。例示性B组链球菌靶核酸包括于Cfb基因(参见波德别尔斯基(Podbielski)等人，1994，微生物与免疫医学杂志(Med. Microbiol. Immunol.)，183 :239-256)中发现的序列。在一些实施例中，靶核酸是病毒核酸。例如，可在人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒或登革病毒中发现病毒核酸。例示性HIV靶核酸包括于Pol区域中发现的序列。在一些实施例中，靶核酸是原生动物核酸。例如，可在疟原虫属(Plasmodiumspp.)、利什曼原虫属(Leishmania spp.)、网比亚布氏锥虫(Trypanosoma bruceigambiense)、罗德西亚布氏维虫(Trypanosoma brucei rhodesiense)、克氏维虫(Trypanosoma cruzi)、内阿米巴属(Entamoeba spp.)、弓形虫属(Toxoplasma spp.)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和肠形鞭毛虫(Giardia duodenal is)中发现原生动物核酸。在一些实施例中，靶核酸是哺乳动物(例如，人类)核酸。例如，可在循环肿瘤细胞、上皮细胞或成纤维细胞中发现哺乳动物核酸。在一些实施例中，靶核酸是真菌(例如，酵母)核酸。例如，可在念珠菌属(Candidaspp.)(例如，白色念珠菌)中发现真菌核酸。检测扩增产物通常包括使用经标记探针，其足够互补且与对应于靶核酸的扩增产物杂交。因此，可通过使与扩增产物互补的经标记探针(例如荧光标记探针)杂交来检测扩增产物的存在性、量和/或特性。在一些实施例中，目标靶核酸序列的检测包括组合使用等温扩增方法和经标记探针，以便实时测量产物。在另一实施例中，目标扩增靶核酸序列的检测包括将扩增靶核酸转移到固体载体(例如膜)，和用与扩增靶核酸序列互补的探针(例如经标记探针)探测膜。在又一实施例中，目标扩增靶核酸序列的检测包括将经标记扩增靶核酸与探针杂交，所述探针以具有可寻址位置的预定阵列排列且与扩增靶核酸互补。通常，扩增反应中利用一种或一种以上引物。靶核酸的扩增涉及使靶核酸与一种或一种以上引物接触，所述引物能够使靶核酸杂交并引导靶核酸扩增。在一些实施例中，使试样与一对引物接触，所述引物包括均与靶核酸杂交的正向和反向引物。实时扩增监测反应期间发射的荧光作为与终点检测相反的扩增子产生的指示物。可在一些系统中观察反应的实时进展。通常，实时方法涉及荧光报告子的检测。通常，荧光报告子的信号与反应中扩增产物的量成正比例增加。通过记录每一循环时荧光发射的量，可监测指数期期间的扩增反应，其中扩增产物的量的首次显著增加与靶模板的初始量相关。核酸靶标的起始拷贝数越高，就越快观察到荧光显著增加。在一些实施例中，突光标记的探针取决于试样的突光共振能量转移(FRET)或荧光发射波长变化，其作为实时检测DNA探针与扩增靶核酸杂交的方法。例如，在不同探针(例如，使用HybProbes)上的荧光标记间或在相同探针(例如，使用分子信标或TAQMAN 探针)上的荧光团与非荧光猝灭剂间发生 的FRET可辨别与目标DNA序列特异性杂交且以此方式可检测试样中靶核酸的存在性和/或量的探针。在一些实施例中，用于辨别扩增产物的荧光标记的DNA探针具有光谱差异发射波长，由此可在同一反应管内(例如在多工反应中)对其加以区分。例如，多工反应容许同时检测两种或两种以上靶核酸、甚至另一核酸(例如对照核酸)的扩增产物。在一些实施例中，利用同位素或非同位素标记以可检测方式标记对靶核酸具有特异性的探针；在替代实施例中，标记扩增靶核酸。探针可检测为靶核酸物质(例如靶核酸物质的扩增产物)的指示物。非同位素标记可(例如)包含荧光或发光分子、或酶、辅因子、酶底物或半抗原。可将探针与RNA、DNA的单链或双链制剂或二者的混合物一起培育，并测定杂交。在一些实例中，杂交导致(例如)经标记探针的可检测的信号变化，例如信号增加或减少。因此，检测杂交包含检测杂交期间或之后的经标记探针的信号相对于杂交之前的标记的信号的变化。在一些方法中,可使用试纸条(flow strip)检测扩增产物。在一些实施例中，一种可检测标记产生颜色且第二标记是由固定抗体识别的表位。含有两种标记的产物将附接到固定抗体且在固定抗体的位置处产生颜色。基于此检测方法的分析可为(例如)可施加到整个等温扩增反应的试纸条(浸量尺)。阳性扩增将在试纸条上产生带，作为靶核酸物质扩增的指示物，而阴性扩增将不产生任何彩色带。在一些实施例中，可使用本文所揭示的方法对靶核酸的量(例如，拷贝数)进行近似定量。例如，可在平行反应中使已知量的靶核酸扩增且可比较从试样获得的扩增产物的量与在平行反应中获得的扩增产物的量。在一些实施例中，可在多重平行反应中使若干已知量的靶核酸扩增且可比较从试样获得的扩增产物的量与在平行反应中获得的扩增产物的量。假定试样中的靶核酸与平行反应中的靶核酸以类似方式可为反应组份所利用，那么可使用所述方法对试样中的靶核酸的量进行近似定量。本文所揭示方法的反应组份可以用于检测靶核酸的试剂盒的形式供应。在所述试剂盒中，适当量的一种或一种以上反应组份提供于一个或一个以上容器中或固持在衬底上。还可提供对靶核酸具有特异性的核酸探针和/或引物。例如，反应组份、核酸探针和/或引物可悬浮于水溶液中或呈冷冻干燥或冻干粉末、丸粒或珠粒形式。供应所述组份等的容器可为能够保持所供应形式的任何常规容器，例如，微量离心管、安瓿瓶，或小瓶或综合测试装置，例如微流体装置、侧向流动或其它类似装置。试剂盒可包括经标记或未经标记的核酸探针，以用于检测靶核酸。在一些实施例中，试剂盒可进一步包括在本文所述方法(例如，使用粗基质而不进行核酸提取和/或纯化的方法)中使用所述组份的说明书。在一些应用中，一种或一种以上反应组份可以预先测量的一次使用量提供于个另IJ、通常一次性管或等效容器中。利用所述布置，可向个别管中添加待测试靶核酸的存在性的试样并直接实施扩增。试剂盒中供应的组份的量可为任何适当量，且可取决于产品所针对的目标市场。用于测定适当量的一般指南可参见音尼斯(Innis)等人、萨姆布鲁克(Sambrook)等人和奥苏伯尔(Ausubel)等人。实例实例I.耜.基质中的细菌的检测研究扩增粗试样中的核酸的能力。使鼠伤寒沙门氏菌在LB培养液中生长。将指数期中期培养物稀释到Iu I中lOOcfu、IOOOcfu或10，OOOcfu。通过将试样与2.5 yl0. 2Na0H、0. 1%曲拉通(Triton)X-IOO混合5分钟来使稀释的培养物裂解，之后用I yl IM乙酸中和。将对照培养物(未裂解)与再悬浮缓冲液混合用于扩增。使用200个拷贝的invAPCR产物作为阳性对照，且使用LB培养基作为阴性对照。向每一试样中添加正向和反向扩增引物(INVAF2, ccgtggtccagtttatcgttattaccaaaggt, SEQ ID N0:1,和 INVAR2, ccctttccagtacgcttcgccgttcgcgcgcg, SEQ ID NO 2)的 6 u M 溶液各 3. 5 u I ;8. 5 U I 20% PEG35K ；2. 5 ill 乙酸镁(280mM);含有 I. 25 y g 肌酸激酶、23 y gUvsX,5u gUvsY、24. 25 u gGp32、6. 65u gExoIIIU4. 65u gPolI.PEG 35000(最终浓度为 5. 5% w/v) ,Tris pH8. 3(最终浓度为50mM)、DTT (最终浓度为5mM)、磷酸肌酸(最终浓度为50mM)、ATP (最终浓度为2. 5mM)、海藻糖(最终浓度为5. 7% w/v)和dNTP (各自最终浓度为300mM)的冻干反应丸粒；检测探针 attttctctggatggtatgcccggtaaacagaQgHgFattgatgccgatt (Q = BHQ-l-dT ；H = THF ；F =荧光素_dT;3'=生物素_TEG(15原子三甘醇间隔剂)；SEQ ID NO :3)和水，达到50 y I的总反应体积。在裂解试样中，根据细胞的数量检测所有试样中的鼠伤寒沙门氏菌(图1B)。IOOOcfu下的信号强度远强于所用200个拷贝的对照靶DNA，而IOOcfu试样比对照物略弱。此数据表明非常多的(绝大多数，如果并非全部)细菌通过所述方法裂解且其DNA完全可用作扩增反应中的模板。在裂解步骤不存在下(图1A)，在使用10，OOOcfu的一种情形中检测到靶的扩增(可能由于极少裂解引起的偶然基因组DNA污染)，但其它情形并不如此。此实例证实可在简单碱裂解后以高敏感性直接检测生长培养基中的细菌。实例2.简单裂解之后唾液中的细菌的检测此实例证实可检测而无需核酸提取的另一靶标和试样。在此实验中，使用研发用于检测链球菌A基因的引物和探针(引物PTSF31，CAAAACGTGTTAAAGATGGTGATGTGAITGCCG，SEQ ID NO 4 ;PTSR25，AAGGAGAGACCACTCTGCTTTTTGTTTGGCATA，SEQ ID NO 5 ;探针PTSP3，CAAAACGTGTTAAAGATGGTGATGTGATTGCCGTQAHFGGTATCACTGGTGAA G, Q = dT_BHQ2， H = THF,F = dT-塔姆拉(TAMRA)，3' = C3-间隔剂，SEQ ID NO 6)来研究用以检测直接来自唾液试样的Strep A的能力。从已知携带Strep A的多个个体汇集唾液并以1000cfu/ml唾液的靶拷贝数使用。混合以下物质20微升唾液(lOOOcfu/ml)与I ill 0. 1%曲拉通X-100 和 a)水，b) I ill 变溶菌素(50U/ ill)和 0. 5 ill 溶菌酶(100mg/ml), c) 2 u I PlyC (2. 2mg/ml)(尼尔森(Nelson)等人，2006，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，103 10765-70)，或d)变溶菌素、溶菌酶和PlyC (量与b和c中相同)。如实例I中制备反应物，只是体积为100 ill。在将试样与已知对Str印A具有裂解效应的PlyC酶一起培育时，可直接检测唾液中的Str印A(图2)。即使在五分之一(100微升最终反应体积中的20微升)反应物是由唾液构成时都有如上情形，且在此情形下可在反应物内仅含有约50个微生物。此实例证实即使在包含20%唾液而无核酸纯化的粗基质中，RPA也可提供显著敏感性和稳定动力学。
_0] 实例3.未裂解试样中的细菌的检测

使用研发用于检测金黄色葡萄球菌nuc基因的引物和探针检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 或 S. aureus)。使用植绒拭子(考潘(Copan)第 5O3CSOl 号)从已知金黄色葡萄球菌载体的鼻前孔取试样。将拭子浸泡于500 Ul再悬浮缓冲液中且随后丢弃。向Iyl O、1、2和3个单位溶葡萄球菌素中添加46. 5 ill此拭子液体的等份试样。随后使用47.5 Ul拭子液体/溶葡萄球菌素使冷冻干燥'nuc' RPA反应物再悬浮，所述反应物如实例 I 中所述且还含有引物 nucF10(CTTTAGITGTAGITTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCA，SEQID NO 7)和 nucR6 (CATTAAITTAACCGTATCACCATCAATCGCTTTAA，SEQ ID NO 8)和探针 nuc 探针 I (agtttcaagtctaagtagctcagcaaaRgHaQcacaaacagataa,其中 R =塔姆拉 dT,H = THF 或D-间隔剂(无碱基位点模拟物)，Q = BlackHole猝灭剂2dT,3/ =生物素-TEG，SEQ IDNO 9)。向每一反应物中同时添加2. 5iil 280mM MgAc以使其开始。使反应物在38°C下运行20分钟，4分钟后通过涡流搅拌试样。令人惊奇的是，在完全不向试样中添加溶葡萄球菌素时，观察到最强信号(图3)。溶葡萄球菌素的添加可导致总信号强度稍许降低。此实例证实在一些情况下扩增可能不需裂解。
_2] 实例4.扩增反应不需热处理使用植绒拭子(考潘第516CS01号)从已知金黄色葡萄球菌载体的鼻前孔取试样。将拭子浸泡于350 Ul水中且随后丢弃。随后混合拭子液体并等分成三批，每批99 yl。两份等份试样添加有I. 65 Ul水且第三份添加有I. 65 Ul溶葡萄球菌素(43个单位/ yl)。将添加有水的等份试样煮沸45分钟或于室温下静置45分钟。将溶葡萄球菌素等份试样加热到37°C并保持40分钟且随后煮沸5分钟以破坏任何核酸酶。向27 ill 20% PEG, 9 u Inuc 正向引物 10 (SEQ ID NO 7),9u I nuc 反向引物 6(SEQ ID N0:8)和 3yl nuc 探针 1(SEQID NO 9)中添加91. 5 ii I每一等份试样以产生反应混合物。随后一式两份地使用46. 5 ii I每一反应混合物使如实例I中所述的冷冻干燥的无引物的RPA反应物再悬浮。同时向每一反应物中添加2. 5 ill 280mM MgAc以使其开始。使反应物在38°C下运行20分钟，4分钟后通过涡流搅拌试样。同时运行使用相同引物和探针和已知拷贝数的nucPCR产物的两种阳性对照反应物。令人感兴趣的是，在此情形下，在未经受煮沸或先后溶葡萄球菌素处理和煮沸的试样中发现最强信号(图4)。在此情形下可能由于对DNA的损害或一些抑制组份的释放，煮沸的作用实际上导致总体敏感性降低。此外，在短时间煮沸之前与溶葡萄球菌素一起培育一段时间，使得敏感性进一步降低。在单独煮沸的情形下，起始的时间与未裂解试样类似，认为可获得的拷贝数相同，但可能释放一些抑制剂，从而抵消最终荧光信号的强度。在溶葡萄球菌素预处理的情形下，信号也更迟，此表明可能由于在培育期间DNA降解，可获得的靶标拷贝数减少。笼统地，所述数据认为在将试样放置于RPA中时大多数或所有潜在靶DNA可用于RPA试剂，且如果存在，通过加热或酶的预裂解仅降低可用拷贝数或释放不期望抑制剂。此实例进一步证实与需要初始变性的其它技术相比，RPA可为适用于直接检测生物试样中的金黄色葡萄球菌的技术。实例5.扩增反应不需DNA钝化使用植绒拭子(考潘第516CS01号)从已知金黄色葡萄球菌载体的鼻前孔取试样。将拭子浸泡于300 u I水中且随后丢弃。随后混合拭子液体并等分成两批，每批100 Ul。第一等份试样添加有2 u I溶葡萄球菌素(43个单位/ iU)，且第二批不做处理。将溶葡萄球菌素等份试样加热到37°C并保持45分钟且随后煮沸5分钟以破坏任何核酸酶。向裂解拭子液体中添加3 u g人类基因组DNA (载体DNA)且随后使用QIAgen的Dneasy Mini方案提取所有DNA并在100 ill水中洗脱。向9 ill 20%PEG,3u I nuc正向引物10 (SEQ ID NO:7)、3ii I nuc 反向引物 6 (SEQ ID NO 8)和 I y I nuc 探针 I (SEQ ID NO 9)中添加 30. 5 y I未裂解和裂解等份试样以产生反应混合物。随后使用46. 5iU每一反应混合物使如实例I中所述的冷冻干燥的无引物的RPA反应物再悬浮。同时向每一反应物中添加2. 5 ii I 280mMMgAc以使其开始。使反应物在38°C下运行20分钟，4分钟后通过涡流搅拌试样。同时运行使用相同引物和探针和已知拷贝数的nuc PCR产物的一式两份的阳性对照反应物。类似于未裂解/未处理试样实施纯化和洗脱DNA (尽管稍微更迟起始指示更低拷贝数)(图5)。 由于清除步骤消除了仅在煮沸下观察到的弱扩增曲线，故表明煮沸可从金黄色葡萄球菌释放抑制剂，所述抑制剂随后可通过清除方案予以移除。然而，如早期实验中所述，如果试样直接用于RPA反应中，则绝不会遇到此损害试剂，同时靶DNA似乎可完全利用，这是因为在进行处理时，拷贝数可能降低，如DNA提取之后更迟起始所指示。实例6.未裂解细胞中核酸的检测稀释来自分子诊断面板的质量控制(Quality Control for MolecularDiagnostics panel)的灭活的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)并以已知量直接添加到RPA反应物中。使用以下物质使如实例I中所述的冷冻干燥的无引物的RPA反应物再悬浮27. I 水、I ii I DNA/细菌/H2O、9 ii I 20% PEGU. 6 u I orfX_ 正向引物 10+6 (CGTCTTACAACGCAGTAACTACGCACTATCATTCA, SEQ ID NO :10)、I. 6 y I orfX_正向引物 I (CAAAATGACATTCCCACATCAMTGATGCGGGTTG, SEQ ID NO : 11)、I. 6 y I mrej-i_ 反向引物 4 (CTGCGGAGGCTAACTATGTCAAAAATCATGAACCT, SEQ ID NO :12)、I. 6 y I mrej-ii_ 反向引物 4-1 (ACATTCAAAATCCCTTTATGAAGCGGCTGAAAAAA, SEQ ID NO 13) ,1. 6u lmrej-iii_ 反向引物 5 (ATGTAATTCCTCCACATCTCATTAAATTTTTAAAT, SEQ ID NO 14)和 I u ISAFAM 探针 3 (5' -TGACATTCCCACATCAAATGATGCGGGTbGxGfTAATTGARCAAGT-3'，其中 f = FamdT，x = THF 或 D-间隔剂(无碱基位点模拟物)，b = BHQl dT，且3'=生物素_TEG，SEQ ID NO : 15)(都为I. 6 y M)。向每一反应物中同时添加2. 5 ill 280mM MgAc以使其开始。使反应物在38°C下运行20分钟，4分钟后通过涡流搅拌试样。在包括100个细菌靶标时按常规检测靶核酸，且在包括10个细菌靶标时周期性检测靶核酸(图6)。所述数据与如下观念一致试样中的大多数或所有潜在DNA靶标可用-实际上，来自100个靶标的信号比来自50个拷贝模板对照的信号更早开始，且10个拷贝稍微更迟，且因此，所有靶标都可能可用。一种10靶标试样的失败可能是由于细菌结块，在不存在提取下此影响任何靶标的存在或不存在，或由于nuc的此RPA测试的总体临界敏感性为约10个拷贝。实例7.未裂解的支原体核酸的检测图7显示在不存在任何初始裂解处理下另一细菌靶标的直接检测。在此情形下，使用研发用于检测猪支原体的引物和探针(正向引物Mhyl83F36GCAAAAGATAGTTCAACTAATCAATATGTAAGT (SEQ ID NO :16)，反向引物Mhyl83R124ACTTCATCTGGGCTAGCTAAAAITTCACGGGCA (SEQ ID NO :17)、探针Mhyl83P2TMR5' -TCATCTGG
GCTAGCTAAAATTTCACGGGCACTTQGHCFAAGATCTGCTTTTA-3'，F =塔姆拉 dT，H = THF (无碱基位点模拟物)，Q = BHQ-2dT(SEQ ID NO :18)来评定其检测支原体的能力。从英国支原体经验公司(Mycoplasma Experience UK)获得热灭活的支原体MEVT W61,存于(经滴定)琼脂糖上。使用植绒拭子取试样，将其直接浸泡于RPA再水合缓冲液中。将缓冲液稀释到lOOOcfu、IOOcfu和50cfu支原体并用于使如实例I中所述的RPA反应物再水合，所述反应物经构造以使特异性支原体靶标扩增。此实验中包括另一荧光通道中测量的内部对照，所述通道靶向放置于反应环境中的人工质粒序列。在所有情形下，且甚至低至50cfu的敏感性下，测试能够有效地检测猪支原体序列(图7)。实例8.结核分枝杆菌的检测 为测试患者中结核分枝杆菌的存在性，从患者获得痰试样并将其与再悬浮缓冲液混合。混合物按原样使用或经受裂解。使混合物经受RPA反应以使对应于IS6110(参见US5，731，150)和/或IS 1081(参见巴哈德等人，2005，农业生物科学研究杂志，I :142-145)的核酸物质扩增。对应于IS6110或IS 1081的扩增产物的检测指示患者试样中结核分枝杆菌的存在性。实例9. A组链球菌的检测为测试患者中A组链球菌的存在性，从患者获得咽拭子或唾液试样并将其与再悬浮缓冲液混合。混合物按原样使用或经受裂解。使混合物经受RPA反应以使对应于Spyl258 (参见刘等人，2005，微生物研究(Res. Microbiol)，156 :564-567)和 / 或 Spy0193的核酸物质扩增。对应于Spyl258或Spy0193的扩增产物的检测指示患者试样中A组链球菌的存在性。实例10.奈瑟氏淋病双球菌的险测为测试患者中奈瑟氏淋病双球菌的存在性，从患者获得阴道拭子或尿试样并将其与再悬浮缓冲液混合。混合物按原样使用或经受裂解。使混合物经受RPA反应以使对应于NG00469 (参见皮耶卡罗维奇等人，2007，BMC微生物，7 66)和/或NG00470的核酸物质扩增。对应于NG00469或NG00470的扩增产物的检测指示患者试样中奈瑟氏淋病双球菌的存在性。实例11.衣原体的检测为测试患者中衣原体的存在性，从患者获得阴道拭子或尿试样并将其与再悬浮缓冲液混合。混合物按原样使用或经受裂解。使混合物经受RPA反应以使对应于衣原体隐性质粒(参见哈特(Hatt)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res. 16 :4053-67)的核酸物质扩增。对应于隐性质粒的扩增产物的检测指示患者试样中衣原体的存在性。实例12. B组链球菌的检测为测试患者中B组链球菌的存在性，从患者获得阴道或直肠拭子并将其与再悬浮缓冲液混合。混合物按原样使用或经受裂解。使混合物经受RPA反应以使对应于cfb基因(参见波德别尔斯基等人，1994，微生物与免疫医学杂志，183 =239-256)的核酸物质扩增。对应于cfb基因的扩增产物的检测指示患者试样中B组链球菌的存在性。
实例13. HIV的检测为测试患者中HIV的存在性，从患者获得血液(例如，全血或黄层)并将其与再悬浮缓冲液混合。混合物按原样使用或经受裂解。使混合物经受RPA反应以使对应于Pol区域的核酸物质扩增。对应于Pol区域的扩增产物的检测指示患者试样中HIV的存在性。其它实施例 上文已阐述本发明多个实施例。然而，应了解，可在不违背本发明精神和范围的情 况下作出各种修改。因此，其它实施例都属于所附权利要求书的范围。
权利要求
1.一种方法，其包含 使粗基质与靶核酸物质的等温核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物； 在足以进行所述等温核酸扩增反应的条件下培育所述混合物，由此提供产物；和 确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
2.—种方法，其包含 使粗基质与靶核酸物质的核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物； 将所述混合物维持在低于80°C的温度一段足以进行所述核酸扩增反应的时间，由此提供产物；和 确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
3.一种方法，其包含 使粗基质与靶核酸物质的核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物； 使所述混合物的摄氏温标温度改变小于25%或15°C—段足以进行所述核酸扩增反应的时间，由此提供产物；和 确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
4.一种方法，其包含 实施混合物的等温反应以提供产物，所述混合物包含粗基质和靶核酸物质的核酸扩增反应的组份；和 确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
5.一种方法，其包含 使混合物于最高80°C的温度下反应以提供产物，所述混合物包含粗基质和靶核酸物质的核酸扩增反应的组份；和 确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
6.一种方法，其包含 使混合物反应，同时使所述混合物的摄氏温标温度改变至多25%或15°C以提供产物，所述混合物包含粗基质和靶核酸物质的核酸扩增反应的组份；和确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
7.根据权利要求I到6中任一权利要求所述的方法，其中所述粗基质是生物试样。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物试样包含至少一种选自由以下组成的群组的试样血液、尿、唾液、痰、淋巴、血浆、精液、肺吸出物和脑脊液。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物试样包含至少一种选自由以下组成的群组的试样咽拭子、鼻拭子、阴道拭子或直肠拭子。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物试样包含活检试样。
11.根据权利要求I到10中任一权利要求所述的方法，其中所述粗基质未经受裂解处理。
12.根据权利要求I到11中任一权利要求所述的方法，其中所述粗基质未经离液剂、洗涤剂或裂解酶制剂处理。
13.根据权利要求I到12中任一权利要求所述的方法，其中所述粗基质未经受高温热处理步骤。
14.根据权利要求I到13中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸物质是葡萄球菌(Staphylococcus)核酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述葡萄球菌是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林(methicillin)的金黄色葡萄球菌MRSA。
17.根据权利要求I到13中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸物质是支原体核酸。
18.根据权利要求I到10中任一权利要求所述的方法，其中所述粗基质经受裂解处理。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述裂解处理包含用洗涤剂处理所述粗基质。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述裂解处理包含用裂解酶处理所述粗基质。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述裂解酶是PlyC。
22.根据权利要求I到10和18到21中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸物质是链球菌(Streptococcus)核酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述链球菌是A组链球菌StrepA。
24.根据权利要求I到10和18到21中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸物质是沙门氏菌(Salmonella)核酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)。
26.根据权利要求I到13和18到21中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是细菌核酸。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述细菌选自由以下组成的群组沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、奈瑟氏淋病双球菌(Neisseria gonorrhea)、A 组链球菌、B组链球菌、难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、活动弯曲杆菌属(Mobiluncus spp.)、普雷沃氏菌属(Prevotella spp.)和红棕色单胞菌属(Porphyromonas spp.)。
28.根据权利要求I到13和18到21中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是哺乳动物核酸。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述靶核酸与肿瘤细胞有关。
30.根据权利要求I到13和18到21中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是病毒核酸。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述病毒选自由HIV、流感病毒和登革(dengue)病毒组成的群组。
32.根据权利要求I到13和18到21中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是真菌核酸。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述真菌是白色念珠菌(Candidaalbicans)。
34.根据权利要求I到13和18到21中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是原生动物核酸。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述原生动物是毛滴虫(Trichomonas)。
36.根据权利要求I到35中任一权利要求所述的方法，其中所述等温核酸扩增反应是重组酶聚合酶扩增。
37.根据权利要求I到35中任一权利要求所述的方法，其中所述等温核酸扩增反应选自由以下组成的群组转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增、信号介导的RNA扩增、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA等温扩增、等温多重置换扩增、解链酶依赖性扩增、单引物等温扩增、环解链酶依赖性扩增以及切口和延长扩增反应。
38.根据权利要求I到37中任一权利要求所述的方法，其中所述反应条件包含聚乙二醇 PEG。
39.根据权利要求38所述的方法，其中PEG是以大于I%的浓度存在于所述反应条件中。
40.一种检测特定DNA或RNA物质的方法，其中使试样在未经离液剂、洗涤剂预先裂解处理、无高温热处理步骤或裂解酶制剂的情况下与反应再水合缓冲液或水合反应系统接触，并且扩增到可检测水平。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述靶核酸物质包含金黄色葡萄球菌或MRSA的基因组DNA。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述扩增方法是重组酶聚合酶扩增RPA方法。
43.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述再水合缓冲液或完全再水合扩增环境中包括浓度大于I%的聚乙二醇。
44.一种试剂盒，其包含 等温核酸扩增反应的组份；和 裂解酶。
45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述等温核酸扩增反应的组份包含重组酶。
46.根据权利要求44或45所述的试剂盒，其中所述裂解酶包含噬菌体溶菌素。
47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述噬菌体溶菌素包含链球菌Cl噬菌体溶菌素(PlyC)。
48.一种试剂盒，其包含 等温核酸扩增反应的组份；和侧向流动装置。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述等温核酸扩增反应的组份包含重组酶。
50.—种试剂盒，其包含 等温核酸扩增反应的组份；和 拭子。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述等温核酸扩增反应的组份包含重组酶。
52.根据权利要求44到51中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒不包含用于核酸纯化或提取的试剂。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述用于核酸纯化或提取的试剂包括离液剂。
54.根据权利要求44到53中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含在无核酸纯化或提取步骤的等温核酸扩增方法中使用所述试剂盒的说明 书。
全文摘要
一种方法包括使粗基质与靶核酸物质的等温核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物；在足以进行所述等温核酸扩增反应的条件下培育所述混合物，由此提供产物；和确定所述产物中是否存在所述靶核酸物质的指示物。
文档编号C12P19/34GK102666872SQ201080042456
公开日2012年9月12日 申请日期2010年9月24日 优先权日2009年9月25日
发明者尼尔·A·阿姆斯 申请人:艾利尔圣迭戈公司