新颖的甘露聚糖酶变体的制作方法

专利名称：：新颖的甘露聚糖酶变体的制作方法
技术领域：
：本文提供的技术涉及微生物甘露聚糖酶的经改进的变体，更具体地，涉及展示出甘露聚糖酶活性作为其主要酶活性的微生物酶；涉及编码所述甘露聚糖酶的核酸分子，含有所述核酸的载体、宿主细胞，以及生产甘露聚糖酶的方法；包含所述甘露聚糖酶的组合物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品和饲料加工，用于咖啡萃取和咖啡废料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于纸浆的酶辅助漂白，在纺织工业中作为漂白和/或脱衆剂，用于通过水力压裂(hydraulicfracturing)进行油井和气井增产(oilandgaswell)，作为去垢剂，作为烘焙成分，用于除去生物膜以及用于递送系统中，用于谷粒加工，或用于用以生产生物燃料的可再生资源的加工，以及用于纺织、探油、清洁、洗涤、去垢剂以及纤维素纤维加工工业的方法。
背景技术：
：内-i3_l，4-D-甘露聚糖酶(β-甘露聚糖酶；EC3.2.I.78)在基于甘露聚糖的多糖中催化甘露糖苷键的随机水解。大多数甘露聚糖酶将寡糖降解为DP4(Biely和Tenkanen(1998)Enzymologyofhemicellulosedegradation,页25-47,在Harman和Kubiceck(ed)TrichodermaandGliocladium,卷2,Taylor和FrancisLtd.London中)，但是，其已在甘露三糖上显示出残余活性，这指示了针对甘露糖结合在蛋白质上的至少四个亚位点。水解的主要终产物通常是甘露二糖和甘露三糖，虽然也产生显著量的甘露糖。一些甘露聚糖酶能降解结晶甘露聚糖。除水解外，若干甘露聚糖酶(包括来自里氏木霉的β_甘露聚糖酶)已显示出作为糖苷键受体的甘露糖或甘露二糖形成转糖苷产物。甘露聚糖酶已分离自多种广泛的生物，包括细菌、真菌、植物和动物。虽然大多是细胞外的，一些β_甘露聚糖酶看起来是与细胞关联的。它们的表达通常是在甘露聚糖或半乳甘露聚糖上的生长所诱导的，但是，来自里氏木霉的β_甘露聚糖酶还可被纤维素诱导，虽然其表达被葡萄糖和其它单糖遏制。经常在相同生物中发现具有不同等电点的多种甘露聚糖酶，它们分别代表了来自不同基因的产物或来自相同基因的不同产物。通常，甘露聚糖酶具有40°C至70°C之间的温和的温度最优值，除了来自嗜热生物的一些β_甘露聚糖酶(Politz等人(2000)Ahighlythermostableendo-1,4-β-mannanasefromthemarinebacteriumRhodothermusmarinus；Appl.Microbiol.Biotechnol.53:715-721)。pH最优值在中性或酸性区中，例如对于来自里氏木霉的β-甘露聚糖酶而言ρΗ5·O(Arisan-Atac等人(1993)Purificationandcharacterisationofaβ-mannanaseofTrichodermareeseiC-30；Appl.Microbiol.Biotechnol.39:58-62)。酶的分子量在30kD和80kD的范围内。WO002008009673公开了里氏木霉甘露聚糖酶的变体，其改进了热稳定性和低PH/胃蛋白酶抗性，以用于水解含有半乳甘露聚糖的植物材料(例如，棕榈仁渣(palmkernelexpelIer,PKE))以及用于动物饲料。例如，热稳定性是在包含高温的造粒流程之前掺入饲料混合物中的饲料添加剂所需要的。此外，作为饲料添加剂应用的甘露聚糖酶需要是低PH稳定和胃蛋白酶稳定的，其必须在低pH下具有活性，以在(例如单胃动物的)胃中高效工作。但是，在饲料工业中的趋势是日益增加造粒温度。目前，目标是在90°C至95°C造粒温度左右的酶稳定性，以使得能在所有工业相关的饲料生产车间使用酶。因此，具有改进的热稳定性的甘露聚糖酶的可用性将是高度有利的，因为其允许在具有高操作温度的车间中也使用该酶。
发明内容在第一个方面，本文公开内容的实施方式提供了甘露聚糖酶变体，其具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNOI)不同的氨基酸序列，并且具有一种或多种有利的性质。此类性质可包括但不限于有益的热稳定性；温度/活性曲线；PH/活性曲线；比活性；以及pH/蛋白酶-敏感性。在另一方面，本文公开内容的实施方式涉及包含下述甘露聚糖酶的甘露聚糖酶变体，所述甘露聚糖酶在选自66、215或259构成的组的一处或多处位置上含有取代，其中每个位置对应于亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNOI)的位置。在另一方面，本文公开内容的实施方式涉及具有下述氨基酸序列的甘露聚糖酶变体，所述氨基酸序列与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNOI)不同，其较之SEQIDNO1的氨基酸序列包含变异201S、207F和274L以及位于对应于位置66、215或259的一处或多处位置上的至少一种变异。在还一方面，本文公开内容的实施方式提供了编码本文公开的甘露聚糖酶变体的核酸，以及包含此类核酸的载体和宿主细胞。在其它一些实施方式中，序列被用于生产甘露聚糖酶变体的工艺中。此外，本文公开内容的实施方式一般地涉及甘露聚糖酶变体用于消化半乳甘露聚糖的用途，特别是催化基于甘露聚糖的多糖中甘露糖苷键的随机水解。有利地，本文公开内容的甘露聚糖酶变体可用于工业应用，包括例如，用于淀粉液化和用于增强半乳甘露聚糖在食品和动物饲料中的消化的方法。有利地，根据本文公开内容的实施方式的甘露聚糖酶变体可用于并且用于酒精发酵工艺和/或生产，用于咖啡萃取和咖啡废料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于纸浆的酶辅助漂白，在纺织工业中作为漂白和/或脱浆剂，用于通过水力压裂进行油井和气井增产，作为去垢剂，作为烘焙成分，用于除去生物膜以及用于递送系统中，用于谷粒加工，或用于用以生产生物燃料的可再生资源的加工，以及用于纺织、探油、清洁、洗涤、去垢剂以及纤维素纤维加工工业。在其它一些方面，本文公开内容涉及包含本文所述的甘露聚糖酶变体的酶组合物，其中所述酶组合物可用于或用于商业应用。在一种实施方式中，酶组合物可以是动物饲料组合物。在其它一些实施方式中，酶组合物可用于淀粉水解(例如液化)工艺。在一种有利的实施方式中，变体和/或酶组合物可用于酒精发酵工艺。在另一些实施方式中，包含本文公开内容所包括的甘露聚糖酶的酶组合物将包括另外的酶，例如植酸酶、葡糖淀粉酶、α淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶及其组合。在另一方面，本文公开内容的实施方式涉及在宿主细胞中生产甘露聚糖酶变体的方法，所述方法通过这样来进行用DNA构建体转化宿主细胞，所述DNA构建体有利地包括在宿主细胞中具有转录活性的启动子，在允许所述甘露聚糖酶表达的合适的培养基中培养经转化的宿主细胞，以及生产所述甘露聚糖酶。该方法还可包括回收生产的甘露聚糖酶。在一种实施方式中，宿主细胞是真菌，例如木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉)，酵母，细菌或植物细胞。在本文公开内容的一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶变体具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8或SEQIDNO9的序列或其变体、经修饰的形式、同源体、融合蛋白、功能等同物或片段。在详细描述本文公开内容之前，应当理解，本文公开内容不仅限于所描述的设备的特定组成部分或者所描述的方法的工艺步骤，因为此类设备和方法是可变的。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，其并不意味着限制。应当注意，在用于本申请文件和所附权利要求中时，单数形式“一个/种”和“这个/种”(“a”、“an”和“the”)包括单数和复数指代，除非上下文有明确其它指示。此外还要理解，当给出数值界定的参数范围时，所述范围被视为包括这些界定值。为在不过度加长申请文件的情况下提供全面的公开内容，申请人在此通过引用并入上文提到的每篇专利和专利申请，特别是WO2008/009673的公开内容。附图简述图I显示了野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)。图2显示了WO2008/009673中公开的里氏木霉甘露聚糖酶变体V_31的氨基酸序列(SEQIDNO2)ο图3显示了WO2008/009673中公开的另一里氏木霉甘露聚糖酶变体V-31/S3R的氣基酸序列(SEQIDNO3)ο图4显示了根据本文公开内容的一种有利的甘露聚糖酶变体TM-I的氨基酸序列(SEQIDNO4)ο图5显示了根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体TM-I(SEQIDNO4)的核酸序列(SEQIDNO5)ο图6显示了根据本文公开内容的另一有利的甘露聚糖酶TM-100变体的氨基酸序列(SEQIDNO6)。图7显示了根据本文公开内容的另一有利的甘露聚糖酶变体TM-108的氨基酸序列(SEQIDNO7)ο图8显示了根据本文公开内容的另一有利的甘露聚糖酶变体TM-CBD-148的氨基酸序列(SEQIDNO8)ο图9显示了根据本文公开内容的另一有利的甘露聚糖酶变体TM-144的氨基酸片列(SEQIDNO9)。图10显示了在热稳定性和活性方面对亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶与S3R变体的比较。图11显示了纤维素结合结构域(CBD)的氨基酸序列。发明详述本文公开了里氏木霉甘露聚糖酶(EC3.2.I.78)的变体以及编码可用于工业应用(包括用于蛋白水解、生物质降解和用于增强食品和/或动物饲料中含有的半乳甘露聚糖的消化的方法)的甘露聚糖酶的核酸。特别地，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体较之所用的亲本甘露聚糖酶，显示出特别改进的热稳定性、PH/胃蛋白酶稳定性以及同时改进的或保持的比活性。这些特征使得它们特别有用于动物饲料、食品中的工业应用以及一般而言的植物材料中的半乳甘露聚糖降解。本文公开内容揭示了具有源于SEQIDNO:I所示氨基酸序列的氨基酸序列的酶或其变体、经修饰的形式、同源体、融合蛋白、功能等同物或片段，或包含一种或多种插入、缺失或突变或其任何组合的酶。根据本文公开内容的同源甘露聚糖酶包含优选与SEQIDNOI、更优选与SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8或SEQIDNO9具有至少70%的序列同一性或优选至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性的任何酶。本文公开内容的甘露聚糖酶变体具有甘露聚糖酶活性，并且具有由于包含一处或多处变异(包括取代、插入和缺失)而不同于亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNO:I)的氨基酸序列。在一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶变体的氨基酸序列较之SEQIDNO:1的氨基酸至少包含变异201S、207F和274L，以及位于对应于位置66、215或259的一处或多处位置上的至少一种变异。例如，有利地，甘露聚糖酶变体中的变异可选自66P、215T和259R构成的组。本文公开内容的一种有利的实施方式是根据SEQIDNO:4的甘露聚糖酶变体或其变体、经修饰的形式、同源体、融合蛋白、功能等同物或片段，或包含一种或多种插入、缺失或突变或其任何组合的甘露聚糖酶变体，以及与SEQIDNO4的甘露聚糖酶至少具有最小百分比序列同一性和/或百分比同源性的甘露聚糖酶，其中所述最小百分比同一性和/或同源性为至少50%，至少60%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少93%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%。在另一些有利的实施方式中，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体除包含变异201S、207F和274L之外以及对应于位置66、215或259的一处或多处位置上的变异之外还包含位置3和/或181上的变异(对应于SEQIDNO1的氨基酸序列的位置而言)。例如，位置3上的变异是3R，位置181上的变异是181A或181H(181/A/H)。在另一些有利的实施方式中，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体包含变异201S、207F和274L以及至少还包含位于位置66、215和259上的变异(较之SEQIDNO1的氨基酸序列而言)。在一种有利的实例中，位置66、215和259上的变异分别是66P、215T和259R。在另一实施方式中，较之SEQIDNO:I的氨基酸序列，甘露聚糖酶变体除包含变异201S、207F和274L以及位置66、215和259上的变异之外，还包含位置上的变异，优选地，181A/H。在一种有利的实施方式中，甘露聚糖酶变体还包含位置3上的变异，例如3R。在一种有利的实施方式中，根据本文公开内容的甘露聚糖酶变体的氨基酸序列至少包含变异201S、207F和274L，以及至少还包含在对应于位置66、215或259的一处或多处位置上的变异，以及下述一种或多种额外的变异，其中变异位置是31、97、113、146、149、173、181、280、282、331或344(较之SEQ.IDNO1的氨基酸序列)。例如，变异是31Y、97R、113Y、146Q、149K、173H/T、181H/A、280S/L/R、282D、331S或344D。本文公开内容的一些有利实施方式是下述甘露聚糖酶变体,所述变体与根据本文公开内容的甘露聚糖酶至少具有最小百分比序列同一性和/或百分比同源性，其中所述最小百分比同一性和/或同源性为至少50%，至少60%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少93%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%。一些有利的实施方式是下述甘露聚糖酶变体，所述变体具有甘露聚糖酶活性，以及具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNOI)不同的氨基酸序列，其中所述甘露聚糖酶变体的氨基酸包含变异201S、207F和274L，以及至少还包含选自下组的变异，所述组由1)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S2)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S3)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D4)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S5)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D6)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L7)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R8)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S9)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R10)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D11)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S12)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L13)F3IY/S66P/Q97R/N173H/V181H/A2I5T/Q259R/N282D14)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D15)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R16)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D17)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D18)F3IY/S66P/N173H/V181H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度(在给定的离子强度、PH和核酸浓度下)。(因为靶序列通常过量存在，在Tm下，平衡时探针的50%被占据)。通常，严格条件将是下述这些，其中，盐浓度低于大约I.OMNa离子，通常，于pH7.O至8.3大约O.01至I.OMNa离子(或其它盐)，温度为针对短探针(例如10至50个核苷酸)至少大约30°C和针对更长的探针至少大约60°C。严格条件还可通过添加去稳定试剂(例如甲酰胺等等)来获得。术语“核酸分子的片段”意欲表示包含根据要求保护的序列之一的核酸分子的亚组(subset)的核酸。这同样适用于术语“核酸分子的片断(fraction)”。术语“核酸分子的变体”在本文中指与根据要求保护的序列之一的核酸分子结构和生物活性上基本相似的核酸分子。术语“核酸分子的同源体”指下述核酸分子，其序列较之根据要求保护的序列之一的核酸分子而言具有一个或多个添加的、缺失的、取代的或经化学修饰的核苷酸，并且一直存在如下前提同源体保持了与后者(即根据要求保护的序列之一的核酸分子)基本相同的结合性质。术语“衍生物”在本文中使用时指与靶核酸序列(如根据要求保护的序列之一的核酸分子)具有相似的结合特征的核酸分子。表I:氨基酸缩写缩写__氨基酸「AAla丙氨酸-;------CCys半胱氨酸PAsp天冬氨酸_EGlu谷氨酸_FPhe苯丙氨酸GGly甘氨酸_HHis组氨酸_IHe异亮氨酸KLys赖氣酸_LLeu亮氨酸_MMet甲疏氨酸NAsn天冬酰胺PPro脯氨酸_QGIn谷氨酰胺RArg精氨酸_SSer丝氨酸_TThr苏氨酸_VVal缬氛酸_WTrp色氨酸_YTyr酪氨酸_使用下述命名规则来描述突变或变异位置；取代的氨基酸残基。根据该命名规贝U，例如，在位置20用甘氨酸残基取代丙氨酸残基被表示为20G。当给定位置的氨基酸残基被两个或多个备选氨基酸残基取代时，这些残基被逗号或斜线分开。例如，在位置30用甘氨酸或谷氨酸取代丙氨酸被表示为20G/E，或20G，20E。此外，还可使用下述命名规则蛋白骨架中的氨基酸残基；位置；取代的氨基酸残基。根据该命名规则，例如，在位置20用甘氨酸残基取代丙氨酸残基被表示为Ala20Gly或A20G，或20G。在同样的位置缺失丙氨酸被显示为Ala20*或A20插入另外的氨基酸残基(例如甘氨酸)被表示为Ala20AlaGly或A20AG。缺失连续一段氨基酸残基(例如位置20的丙氨酸和位置21的甘氨酸之间)被表示为Λ(Ala20-Gly21)或Λ(A20-G21)。当序列较之用于编号的亲本蛋白含有缺失时，在此类位置(例如缺失的位置20中的丙氨酸)的插入被表示为*20Ala或*20A。多个突变被加号或斜线分开。例如，位置20和21中分别取代丙氨酸和谷氨酸为甘氨酸和丝氨酸的两个突变被表示为A20G+E21S或A20G/E21S。当给定位置上的氨基酸残基被两个或多个备选的氨基酸残基取代时，这些残基被逗号或斜线分开。例如，用甘氨酸或谷氨酸取代位置30的丙氨酸被表示为A20G，E或A20G/E或A20G，、A20E。当本文中鉴定了适于修饰的位置但没有建议任何特定的修饰的话，应当理解，任何氨基酸残基可取代该位置存在的氨基酸残基。因此，例如，当提到位置20的丙氨酸的修饰但无特指时，应当理解，丙氨酸可被缺失或取代为任何其它氨基酸残基(即，R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中的任一)。术语“保守突变”或“保守取代”分别表示本领域技术人员将认为是对第一突变来说保守的氨基酸突变。“保守”在本文上下文中表示在氨基酸特征方面相似的氨基酸。如果，例如，突变导致特定位置上产生脂肪族氨基酸残基(例如Leu)对非脂肪族氨基酸残基(例如Ser)的取代，则用不同的脂肪族氨基酸(例如Ile或Val)在相同位置进行取代被称为保守突变。其它氨基酸特征包括残基的大小、疏水性、极性、电荷、PK值和本领域已知的其它氨基酸特征。因此，保守突变可包括取代，例如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性，等等。由此衍生的氨基酸的组可能由于结构原因而是保守的。这些组可被描述为Venn图表的形式(LivingstoneC.D.和BartonG.J.(1993)"Proteinsequencealignmentsastrategyforthehierarchicalanalysisofresidueconservation〃Comput.ApplBiosci.9:745-756；TaylorW.R.(1986)"Theclassificationofaminoacidconservation"J.Theor.Biol.119;205_218)。保守取代可例如根据下表来进行，下表描述了通常被接受的氨基酸Venn图表分组。表2Venn图表分组的氨基酸权利要求1.甘露聚糖酶变体，其较之甘露聚糖酶SEQIDNO3而言具有至少3°C的改进的热稳定性。2.权利要求I的甘露聚糖酶变体，其中所述改进的热稳定性在大约4°C至大约9.3°C的范围内。3.权利要求I或2的甘露聚糖酶变体，其中所述改进的热稳定性在大约5.7V至大约9.3°C的范围内。4.甘露聚糖酶变体，其较之甘露聚糖酶SEQIDNO:3而言具有至少107%的改进的比活性。5.权利要求4的甘露聚糖酶变体，其中所述改进的比活性在大约107%至大约212%的范围内。6.甘露聚糖酶变体，其具有甘露聚糖酶活性，并且具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)不同的氨基酸序列，其中，所述甘露聚糖酶变体的氨基酸包含变异201S、207F和274L，以及位于对应于位置66、215或259的一处或多处位置的变巳升。7.权利要求6的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体还包含变异3R。8.权利要求6或7的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体还包含变异181A/H。9.权利要求6至8中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体至少包含位于对应于位置66、215和259的位置处的变异。10.权利要求6至8中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体至少包含位于对应于位置3、66、215和259的位置处的变异。11.权利要求6至8中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体至少包含位于对应于位置3、66、181、215和259的位置处的变异。12.权利要求6至11中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中位于位置66、215或259中一处或多处的变异分别是66P、215T和259R。13.权利要求6至12中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中位于位置3、66、215或259中一处或多处的所述变异分别是3R、66P、215T和259R。14.权利要求6至13中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中位于位置3、66、215或259中一处或多处的所述变异分别是3R、66P、181A/H、215T和259R。15.权利要求6至14中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述甘露聚糖酶变体还包含一处或多处另外的变异，其中所述变异位置是31、97、113、146、149、173、181、280、282、331或344。16.权利要求6至15中任意一项的甘露聚糖酶变体，其中所述变异是31Y、97R、113Y、146Q、149K、173H/T、181H/A、280S/L/R、282D、331S或344D。17.甘露聚糖酶，其与权利要求I至16的甘露聚糖酶具有至少最小百分比序列同一性和/或百分比同源性，其中所述最小百分比同一性和/或同源性为至少50%，至少60%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少93%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%。18.甘露聚糖酶变体，其具有甘露聚糖酶活性，并且具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)不同的氨基酸序列，其中，所述甘露聚糖酶变体的氨基酸包含变异201S、207F和274L，以及至少地选自下组的变异，所述组由DF31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S2)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S3)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D4)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S5)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D6)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L7)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R8)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S9)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R10)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D11)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S12)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L13)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D14)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D15)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R16)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D17)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D18)F31Y/S66P/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D19)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L20)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D21)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D22)F31Y/S66P/Q97R/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D23)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D24)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D25)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S26)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D27)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N331S28)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S29)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S30)S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181A/A215T/Q259R31)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S32)F3IY/S66P/Q97R/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R33)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S34)F3IY/S66P/Q97R/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R/Q280L35)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L36)F31Y/S66P/Q97R/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D37)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D38)F3IY/S66P/Q97R/V181H/A2I5T/Q259R/N282D39)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S40)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S41)S66P/V181H/A215T/Q259R/N282D42)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N331S43)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D44)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D45)S66P/V181H/A215T/Q259R46)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D47)F3IY/S66P/N173T/V181H/A2I5T/Q259R/N282D48)F3IY/S66P/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R/Q280R/N344D49)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D50)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S51)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S52)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R53)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S54)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D55)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D56)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R57)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S58)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S59)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S60)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S61)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S62)S66P/A215T/Q259R63)S3R/S66P/A215T/Q259R构成。19.核酸分子，其选自下组，所述组由i)编码根据权利要求1-18中任意一项的甘露聚糖酶的核酸分子；j)编码根据权利要求1-18中任意一项的经修饰的甘露聚糖酶的衍生物的核酸分子，优选地所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基被保守取代；k)核酸分子，其是SEQIDNO:5所示的核酸分子的片断、变体、同源体、衍生物或片段；I)核酸分子，其能在严格条件下与a)_d)中任何核酸分子杂交；m)核酸分子，其能在严格条件下与a)-d)中任何核酸分子的互补序列杂交；n)核酸分子，其与a)-f)中任何核酸分子具有至少95%的序列同一性，并且编码甘露聚糖酶；0)核酸分子，其与a)_f)中任何核酸分子具有至少70%的序列同一性，并且编码甘露聚糖酶；P)或a)_h)中任何核酸分子的互补序列构成。20.包含权利要求19的核酸分子的载体。21.宿主细胞，其用权利要求20的载体转化和/或包含权利要求19的核酸分子。22.SEQIDNO5的核酸分子。23.用于制备根据权利要求I至18中任意一项所述的经修饰的甘露聚糖酶的方法，所述方法包括培养权利要求21的宿主细胞以及从培养物中分离所述经修饰的甘露聚糖酶。24.组合物，其包含根据权利要求I至18中任意一项所述的经修饰的甘露聚糖酶。25.权利要求24的组合物，其适用于食品和饲料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于酶辅助的纸浆漂白，用于通过水力压裂的油井和气井增产，作为去垢剂，用于除去生物膜，或者用于递送系统中。26.根据权利要求I至9中任意一项所述的经修饰的甘露聚糖酶的用途用于食品和饲料加工，用于咖啡萃取，用于咖啡废料加工，籲作为食品和饲料的补充剂，用于酶辅助的纸浆漂白，籲作为纺织工业中的漂白剂和/或脱浆剂，用于通过水力压裂的油井和气井增产，籲作为去垢剂，用于除去生物膜，用于递送系统中，和/或用于加工意欲用于生产生物燃料的可再生资源。全文摘要本文公开内容提供了新颖的甘露聚糖酶变体，其具有不同于亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列，并且其具有一种或多种有利的性质，例如改进的热稳定性；温度/活性曲线；pH/活性曲线；比活性；以及pH/蛋白酶敏感性。新颖的甘露聚糖酶变体可用于并且用于酒精发酵工艺和/或生产，用于咖啡萃取和咖啡废料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于酶辅助的纸浆漂白，在纺织工业中作为漂白和/或脱浆剂，用于通过水力压裂进行油井和气井增产，作为去垢剂，作为烘焙成分，用于除去生物膜以及用于递送系统中，用于谷粒加工，或用于用以生产生物燃料的可再生资源的加工，以及用于纺织、探油、清洁、洗涤、去垢剂以及纤维素纤维加工工业。文档编号C12N5/00GK102712881SQ201080061452公开日2012年10月3日申请日期2010年11月24日优先权日2010年1月13日发明者O·肯施申请人:巴斯夫欧洲公司