专利名称：用于诱变检测的测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及诱变测定法和可用于其中的细胞和试剂盒。
背景技术：
公认化学剂的诱变潜力大致与该化学剂的致癌潜力大概成比例。早期确定特定试剂是否存在诱变性的危害对于开发用于化学、化妆品、食品添加剂和制药工业的产品开发是至关重要的。诱变剂是导致突变率(即，生物体的遗传物质中可检测和可遗传的结构改变)提高的试剂。这种改变可以包括整个染色体的添加或缺失，染色体的结构改变(例如，易位)以及一部分基因组序列的结构改变(例如，点突变、多个连续核苷酸的突变和部分基因组序列的缺失)。由于遗传改变可以损害或以其他方式干扰基因的作用，诱变剂被表征为基因毒素，即，对基因有毒性的作用剂。
发明内容
本发明提供了一种包含营养缺陷型基因的构建体，所述营养缺陷型基因被生色酶(colorigenic enzyme)基因破坏,所述生色酶基因被编码选择标记的多核苷酸破坏。在一个实施方案中，所述营养缺陷型基因包括His3基因。在另一个实施方案中，所述选择标记包括Ura3基因。在又一个实施方案中，所述构建体包括质粒。在一个实施方案中，所述构建体被重组引入至宿主细胞基因组中。还在另一个实施方案中，所述生色酶基因包括LacZ。还在另一个实施方案中，所述构建体包含选自由下列各项组成的组的序列(a) SEQ ID NOI ; (b)与SEQ ID NO : 195%相同的序列；(c) (a)或(b)的互补体；以及(d) (a)、(b)或(c)的序列，其中T可以是U。本发明还提供了一种被重组改造为包含上述构建体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母。本发明还提供了一种表征试剂的诱变性的方法，包括使包含上述构建体的宿主细胞与试剂接触，并测量￠-半乳糖苷酶的活性，其中与对照相比￠-半乳糖苷酶活性的提高指示试剂具有诱变潜力。
本发明提供了一种表征测试试剂的方法，包括用测试试剂处理包含DEL选择标记的真核细胞；以及在用所述测试试剂处理所述真核细胞后测量线粒体活性。在一个方面，本发明利用MTT或MTS试剂来检测线粒体活性。在另一个方面，所述细胞是酵母细胞。本发明提供了一种表征测试试剂的方法，包括提供包含DEL选择标记的真核细胞培养物；用或不用测试试剂处理所述真核细胞培养物；在合适的选择培养基存在的情况下测量所述细胞培养物的被处理部分的线粒体活 性；以及在所述选择培养基存在的情况下测量所述细胞培养物的未处理部分的线粒体活性。在一个方面，本发明利用MTT或MTS试剂来检测线粒体活性。在又一个方面，所述细胞是酵母细胞。本发明还提供了一种包含细胞和线粒体活性检测试剂的试剂盒，所述细胞包含DEL选择标记。在下面的附图和说明书中列举了本发明的一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。
图I显示了通过向-His培养基中的100，000个本底RS112细胞添加不同稀释度的RS112His+回复体来模拟DEL测定。对12、18和24小时时间点作图。在第12小时，对应于每10，000个细胞25、50和100次DEL事件的RS112His+添加可感知地显著。到了第18和24小时，均可明显地检测到每10，000个细胞少至2. 5次DEL事件。而在第24小时，尽管25-1000个RSl 12细胞仍然与本底显著不同，但在-His培养基中的生长变得饱和并且丧失反应模式。对于每个处理组使用至少6次重复来进行实验，并且结果表示为均值土SD。显著性 * (p < 0. 05)。图2A-C显示基于孔的DEL测定，其通过测量添加MTS后14h的0. D. (490nm)评价13种致癌物的细胞毒性和基因毒性。经处理样品的细胞毒性通过与标记为“RS112”的未处理酵母相比在+13培养基中的减弱生长来表示。基因毒性通过与未处理酵母相比在-HIS培养基中的生长增加来表示。在图A中，化合物先前使用DEL测定进行测试；图B，以前未由DEL测定表征的交联剂；图C，以前未由DEL测定表征的交联剂。在图A、B和C中进行的实验各自在单个384孔板中完成；对于每个处理组使用4次重复，并且结果表示为均值土 SD。每次产生相似结果时以96孔板和386孔板两种形式均重复实验至少3次。图3A-D是显示酵母染色体内重组(DEL)系统的结构和可能的回复突变机制的示意图。A :姐妹染色单体转换；B :单链复性；C :染色体内交换；D :不等性姐妹染色单体互换。
具体实施例方式如在本文中和在附带的权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a/an) ”和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非文中另外清楚地说明。因此，例如，提及“一个/种细胞”时包括多个/种这样的细胞，并且提及“该/所述试剂”时包括提及本领域技术人员已知的一种或多种试剂，等等。此外，除非另外指明，“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包括”、“包含”、“含有”、“具有”可互换使用并且不旨在是限制性的。还要进一步理解的是当对各个实施方案的说明使用术语“包括”时，本领域技术人员要理解在一些具体情况下，实施方案可选地可以使用“基本上由......组成”或
“由......组成”的表述来描述。除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术人员普遍理解的相同含义。尽管在公开的方法和组合物的实施中可以使用与本文所述的那些类似或等效的方法和材料，但在本文中仅说明示例性的方法、装置和材料。上文和全文中讨论的出版物仅因为它们在本申请申请日之前公开而提供。本文中的任何内容不应被解释为承认本发明人由于在先公开而没有权利占先于这些公开。最初作为研究DNA重组和修复机制的工具而开发的DEL测定已经经受了时间的考验，并且已经证明其本身在各个研究领域中是无价的工具-癌症、毒理学、环境科学、公共卫生、放射生物学和药理学。尽管仍然是研究DNA重组/修复途径和长期遗传不稳定性的优良模型，DEL测定法在早期就已经显示在试剂的致癌性检测方面非常敏感和准确，所述试剂在广泛接受的沙门氏菌属测定(Ames)中无法检测到。DEL测定法识别92%的已知致癌 物，而Ames测定仅识别60%。DEL测定法有效地预测具有截然不同的诱变活性机制的各种试剂和应激源的基因毒性和细胞毒性性质。其可以检测经由氧化应激、单链和双链DNA断裂、诱裂活性、UV-诱导的碱基二聚化、DNA交联、DNA堆积和低LET y辐射诱导遗传改变的试剂。最近DEL测定法还被用来研究内源性氧化应激诱导剂NHO并且证明了检测氧化应激中和剂诸如NAC (N-乙酰胺)的能力。HNO具有基因毒性，但其机制还未被充分阐明。存在HNO可以攻击DNA的许多可能机制。由于HNO是亲电子的，因此其可能与DNA碱基上的环外胺基反应并且通过一系列随后的反应形成脱胺产物。可选地，HNO可以通过0(2)-依赖性(或可能0(2)-非依赖性)化学诱导自由基化学。在无细胞系统中，实验已经显示HNO不与DNA反应，导致碱基氧化和链断裂。使用酵母酿酒酵母中的全细胞系统,利用Angeli盐作为HNO供体，研究HNO诱导的DNA损害的机制。酵母DEL测定法提供了一种对导致DNA缺失的染色体内重组的测量手段。HNO是DNA缺失和重组的有效诱导物，但其不诱导点突变。这提示HNO导致DNA链断裂而不是导致碱基损害。在有氧和缺氧条件下均观察到基因毒性，并且NAC保护免受HNO诱导的DNA缺失。由于HNO在缺氧条件下具有基因毒性，NAC可能不依赖于氧而保护免受HNO生成的自由基影响。由于DNA双链断裂可高度地诱导DEL测定法，进行了研究以检验DEL测定法检测断裂剂的效用。使用DEL测定法检验具有不同的基因毒性机制的10种模型化合物对DNA缺失频率的作用。测试的化合物为放线菌素D、喜树碱、甲氨蝶呤和5-氟脱氧尿苷，它们是抗癌剂，那可丁和呋塞米是治疗剂，吖啶、丙烯酸甲酯和间苯二酚是工业化学品，且二嗪磷是杀虫剂。对相同的化合物进行体外CHO细胞中的微核测定(IVMN)(—种检测断裂剂的常用工具)，并对两种测定法的结果进行比较。研究结果显示存在代谢激活(大鼠肝S9)时DEL测定和标准的体外微核测定之间存在70%的一致性，并且在缺少代谢激活时存在80%的一致性。对所检测10种化合物中的4种观察到无细胞毒性，表明亲脂性化合物跨越酵母细胞壁的扩散受限。因此，期望开发一种透过性更高的酵母测试株以极大地提高DEL测定与IVMN测定的一致性。与IVMN相比，酵母DEL测定法廉价，易于自动化并且其实施需要较少的专业技能。因此，其具有作为体外检测断裂剂的稳健的、快速的和经济的筛选方法的很大潜力。
DEL测定法在环境卫生科学和公共卫生实验室领域中的纯研究环境之外也可应用。DEL测定法已经被用于显示自来水加氯处理、柴油机尾气和苯暴露的诱变后果。DEL测定法已经适用于高通量形式(HTS)从而使目的化合物的基因毒性和细胞毒性的检测过程容易进行，并且作为筛选化学文库获得辐射诱导的损害改性剂的手段。本发明描述了将酵母DEL测定法改良为使用MTS四唑偷化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯基)-2H-四唑傷,内盐)的比色测定法，从而允许有效地检测化学基因毒性。其已经被微型化，并且可以以96-孔或384孔形式进行。利用以前用基于板的DEL测定法表征的化学品来测试新的基于孔的形式，并且使用此新测定形式对以前未被DEL测定法表征的一组交联剂进行基因毒性的评分。这些化合物诱导了一系列采用基于孔的DEL测定法可检测到的基因毒性，并且发现仅在由基于板的DEL测定法所确定的极低基因毒性水平时缺乏灵敏度。通过DEL HTS鉴定的辐射调制剂-辐射防护剂、辐射缓和剂和辐射敏化剂-可以被转化至高等真核细胞体外模型和可能整个生物体 中。最近，被DEL HTS鉴定为具有辐射保护/缓和活性的化合物已经在动物中进行了测试并且已经显示在小鼠中减轻致死性辐射暴露损害方面具有极大作用，并且被进一步开发成药物疗法。DEL测定法还存在另一种药理学应用筛选制药中作为副产物产生的基因毒性药物杂质。药物合成和/或配制可以产生基因毒性杂质。例如，在形成药物盐的工艺期间的强酸/醇相互作用产生烷化剂诸如烷基卤和烷基磺酸的烷基酯。少数经典的烷化剂诸如甲磺酸甲酯和乙酯的基因毒性以前已经被充分表征，而此类化合物的大多数仅在沙门氏菌回复突变测定(Salmonella reversion assay)中被测试过。因此，本发明提供了可用于研究诱裂性的方法和组合物，并且使用一系列细胞和分子测定完成了 22种卤代烷烃以及硫酸和烷基-、芳基-磺酸的烷基酯的DEL重组谱。在酿酒酵母中的DEL测定提供了对DNA缺失的测量手段。甲基化剂在DEL测定中最有效，并且在该研究中评价的烷基氯是阴性的。总之，此研究有助于更好的理解具有烷基化活性的常见烷基卤和烷基酯的基因毒性性质，并且可能对控制药物物质和广品的基因毒性工艺相关的杂质风险提供指导。除了本发明的比色DEL测定法以外，本发明还提供了另一种DEL测定法。本文所述的LacZ DEL测定法利用了被破坏基因在诱变化合物或事件(X-射线、y射线等)的存在下经历重组的相同概念。与半乳糖启动子融合的LacZ被插入至生长必需基因(例如，生长选择标记诸如基因组His3基因座)中，并且被具有Gal-LacZ构建体的内部片段的质粒破坏。结果是两个拷贝的具有末端缺失的被URA3基因(用于选择)破坏的Gal-LacZ构建体，它们在暴露于基因毒性化合物和事件时回复为功能性Gal-LacZ表型(参见，例如，图3)。向培养基中添加溴-氯-D引哚基-吡喃半乳糖苷(X-gal)底物并在暗处经历一段短的孵育期来检测功能性Gal-LacZ表型是有可能的。结果读为在诱导自发回复突变的化合物的存在下转变成蓝色的集落的比例(指示基因毒性/致癌性)。在HTS适应中，将使用分光光度计来指不吸光度的差异。LacZ DEL构建体相对于经典的DEL构建体具有许多优势。首先，其将为基因毒性的检测提供甚至更灵敏的工具，因为该基因构建体较大。其次，基因毒性的检测将快6倍，因为新的测定法将不基于生长(至少生长18小时)，而是基于集落颜色的变化(在少于3小时内从白色转变为蓝色)。第三，该测定法将是便携的，并允许在野外进行基因毒性筛选。最后，其可易于采取HTS形式，并且更为成本有效，因为MTS指示剂底物可用但较昂贵。除了上面提到的在减少成本和时间方面的优势以外，新的DEL-LacZ构建体为探寻通过各种途径的DNA修复机制提供了工具。例如，DEL-LacZ构建体使我们能够区分已经通过非同源末端连接(NHEJ)途径经历过重组事件的那些克隆与已经经历过同源重组事件的那些克隆。这有可能观察到，因为如果所选择的克隆已经经历过同源重组并且丢失了 URA3中断序列(interruption sequence),则其在X-gal底物的存在下转变成蓝色,并且将不能够在具有FOA (5-氟-乳清酸，在完整的URA3基因的存在下其转变成有毒性的5-氟尿嘧啶)的培养基中存活。然而，如果所选择的克隆仍然是白色但丢失了 URA3基因，则这将表明非同源末端连接事件。“生物发光”意指在活细胞中的光发射，其中所述光发射依赖于并响应于代谢活性。“生物发光标志物”意指这样的核苷酸序列，当其被掺入至细胞中并被表达时，在细胞的代谢活性期间导致生物发光。术语“比色的”是指生成有色组合物的组合物，或在与另一种物质相互作用时(例如，与生物化合物或金属离子结合时，与另一分子反应时或被酶代谢时)表现出其吸收光谱改变的有色组合物。在一些方面，比色标记物产生可检测的沉淀物。“基因”意指表达特定蛋白的染色体片段，包括在编码序列之前(5,非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。术语基因包括处于基因组中其天然位置的内源基因或在宿主生物体中通常不存在但通过重组分子生物学技术被引入至所述宿主生物体中的外源基因。“诱变剂”是导致缺失或基因重组比率增加的试剂。诱变剂通过损害或以其他方式干扰基因的作用而可具有基因毒性作用。“突变”是生物体的遗传物质的可检测的和可遗传的结构改变，并且可以包括整条染色体的添加或缺失，染色体的结构改变(例如，易位)和一部分基因组序列的结构改变(例如，点突变，多个连续核苷酸的突变和部分基因组序列的缺失)。“DEL选择标记”意指被破坏的基因座，其中(I)所述破坏包括在基因座内插入异源多核苷酸；(2)所述异源多核苷酸包括一部分基因座的一个副本；(3)所述异源多核苷酸 的重复部分的头对尾(即，5'端至3'端)定向与该基因座的定向相同；以及(4)当细胞在合适的选择培养基中生长时该基因座可用于细胞的表型选择。DEL选择标记的各种实施方案描述如下。“选择培养基”意指可以用于细胞的表型选择的组合物。例如，缺少组氨酸的营养素组合物可以用来选择性地筛选能够产生组氨酸的酵母细胞。包含抗生素G418的营养素组合物可以用来选择性地筛选具有neo抗性基因的细胞。其他常用的选择培养基对本领域技术人员是容易显而易见的。“合适的选择培养基”是指具有可以基于选择标记用于细胞的表型选择的组合物的选择培养基。一般来说，这种培养基将包含导致适宜细胞类型的阳性或阴性选择的组合物。如上所述，已经广泛接受的是化学试剂的致癌潜力可以至少部分地由其诱变性来预测(Grossblatt，N.，1983)。这已经使工业诸如化学工业、化妆品工业、食品添加剂工业和制药工业能够通过使它们的产品的致诱变性质最小化而减少产品的致癌危险。DEL测定法，也已知为染色体内重组测定法，首先由Schiestl等人(1988)记述，该测定法使用酿酒酵母测量由诱变剂在靶基因序列中诱导的部分基因组序列的缺失。因此，该测定能够评价测试化合物的致诱变潜力。Schiestl等人(1988)报道了一种用于酵母酿酒酵母中的染色体重组的阳性选择系统，该系统通过将包含HIS3基因的内部片段的质粒整合至HIS3基因座处，产生该基因的两个拷贝，在一个拷贝的3'处和另一 个拷贝的5'端处有末端缺失。在DEL测定法中使用的靶基因序列是其功能已经通过外源DNA片段的整合而被破坏的基因。例如，Schiestl等人(1988)记述了使用称为"RSY6"的酿酒酵母株(可获自ATCC，保藏号201682)，其中HIS3基因通过整合外源DNA片段而被破坏。得到的his-酵母株需要其生长培养基中具有组氨酸以便生长。在无组氨酸培养基中，非常少的细胞将自发地回复至his+。然而，当细胞用诱变剂处理时，回复率提高超出正常本底水平。在一些情况下，诱变剂导致形成双链DNA断裂。当这种断裂发生在被破坏的基因中时，细胞的自身修复机制可以导致外源DNA的清除和序列的修复(例如，通过单链复性)，因此，本发明的测定法选择重复序列之间由重组导致的缺失和基因回复至其野生型形式。DEL测定法相对于其他诱变性测定法具有某些优势。例如，已经报道DEL测定法比更普遍使用的沙门氏菌回复突变Ames测定法具有更好的致癌性的预测。使用Ames测定得到阴性结果的许多致癌化合物被DEL法判断为阳性(Bishop和Schiestl，2000)。然而，现有DEL测定法的一个缺点是其不能够对潜在诱变剂进行大规模和自动化筛选(即，高通量筛选)。例如，现有测定法要求给予细胞以足够的时间生长成可见的集落以便确定测试化合物是否是潜在致癌物。此外，由于需要看到生长集落，现有测定法不能被小型化，例如，成为多孔板系统，所述多孔板系统将能够减少测试作用剂的需要量。本发明通过设计液体形式的DEL测定克服了这个问题。在本发明的一个实施方案中，酵母生长可以在不形成克隆的定量比色测定中鉴定，所述比色测定测量增殖细胞将MTT (溴化3-4，5- 二甲基噻唑-2-基)_2，5- 二苯基四唑，一种黄色四唑偷盐)还原为紫色甲歴(formazan)沉淀物的能力。然而，此反应需要淬灭并溶解细胞以便测量甲層沉淀物。由Mosmann在1983首先记载的MTT [溴化3_ (4，5_ 二甲基噻唑_2_基)_2，5_ 二苯基四唑]测定法基于来自活细胞的线粒体脱氢酶裂解浅黄色MTT的四唑输环并且形成深蓝色甲層晶体(其大部分不能透过细胞膜，由此导致其在健康细胞内积累)的能力。通过添加去垢剂溶解细胞导致被溶解的晶体释放。存活细胞的数目与形成的甲廳产物的水平成比例。然后使用简单的比色测定就可以对颜色进行定量。结果可以在多孔扫描分光光度计(ELISA读数仪)上读数。通过用替代以MTS四唑徽化合物[3-(4，5_ 二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯基)]-2H-四唑偷(内盐)和电子偶联试剂PES (吩嗪乙基硫酸盐)可以对MTT测定进行改进。MTS化合物被细胞还原为在组织培养基中可溶的有色甲層.产物。此反应不需要被淬灭并且可以通过记录490nm处的吸光度可直接测量细胞增殖。细胞增殖与甲If产物的量成比例。因此，MTS测定适合作为可以用于高通量应用的比色测定法。在此，MTS用来构建基于液体形式的酵母DEL测定，其能够以96孔板和384孔板两种形式对DNA缺失进行评分。在有代谢活性的细胞中MTS四唑输化合物被还原为有色的甲磨产物;因此其是对活细胞数目的测定。数值的减少暗示细胞杀伤作用。本发明提供了用于测定试剂的致诱变性质的方法和系统。在一个实施方案中，包含DEL选择标记的重组细胞与怀疑具有诱变性的试剂在其中所述作用剂与所述细胞相互作用的条件下接触。然后在选择性培养基中测量细胞的活力。使用比色MTT或MTS测定法或其他线粒体细胞活力测定法测定细胞的活力。诱变剂提供改进的重组和在选择性培养基中的存活能力。例如，在使细胞与测试试剂接触后，可以通过向孔中添加MTS溶液并使细胞与MTS溶液孵育(在孵育期间在活细胞中产生有色的甲謂产物)来测量细胞的活力。MTS测定的一个优势是甲If产物在组织培养基中是可溶的，避免了 MTT测定的溶解步骤。然后通过在Dynex微量滴定板读数仪中读取490nm处的吸光度来测量活细胞数。细胞活力表示 为以百分比表示的时刻“x”时的吸光度(添加药物后)减去“空白”读数(含药物不含细胞的培养基)与零时刻时的吸光度(添加药物前)减去空白读数(不含药物或细胞的培养基)的比率。100%反映实验开始时的活细胞数；大于100%的值反映细胞增殖，小于100%的值反映细胞消失(细胞毒性)。由于数值表示为零时刻时的数值的百分比，而不是相对于已在中期增殖的对照细胞群(因此细胞数增加)的百分比，因此可以做出这些解释。在一个实施方案中，诱变性与DEL提高量直接成比例。例如，DEL是下述比率选择培养基(-HIS)上酵母的生长与完全培养基上的生长的比率。而且，本发明的DEL测定的一个有益效果是可以采用一个测定测量两个终点；可以测量细胞毒性(例如，试剂导致细胞的细胞杀死量)和基因毒性(试剂导致细胞的诱变量)。通过本发明，可以以先前不可得的方式快速地和廉价地测试对于DEL重组具有未知致癌潜力的试剂。本发明涉及使用具有被破坏的DEL型选择标记作为组分的细胞。该标记用来选择那些经历了由测试诱变剂诱导的重组事件的细胞。例如，如果测试诱变剂是致诱变的或致癌的，则缺失或基因重组的速率相对于对照增加，赋予细胞在选择培养基中提高的存活能力。使用包括线粒体酶活性的比色测定法测量细胞的活力(例如，MTS或MTT测定)。本发明证明了相对于以往DEL测定的提高的灵敏度。本发明的方法能够在用测试试剂处理后不久检测单个细胞回复体或这些细胞的小集落，而不用在长时间生长后鉴定生长集落。这避免了使细胞生长成大集落以便检测的需要。与现有的DEL测定相反，本发明的方法和细胞基于对选择培养基上回复突变细胞的比色检测(例如，MTT或MTS还原)，这允许多孔高通量筛选技术用于测试试剂。本发明的方法和细胞能够显著地减少诱变性测试所必需的测试试剂的量。当在测试试剂仅能小量获得时这是一个显著的优势。另外，MTT和MTS还原的使用使得能够使用平板读数仪装置，该装置可以测量比色信号的吸光度。还在另一个实施方案中，比色测定法包括测量P -半乳糖苷酶活性。此实施方案利用在致诱变化合物或事件(X-射线，Y-射线等)的存在下经历重组的被破坏的基因。在一个实施方案中，ZacZ基因与半乳糖启动子融合并且插入至真核细胞诸如酿酒酵母中的基因组His3基因座中，并且被具有Gal-LacZ构建体内部片段的质粒破坏。结果是两个拷贝的具有末端缺失的被例如URA3基因(用于选择)破坏的Gal-LacZ构建体，该Gal-LacZ构建体在暴露于基因毒性化合物和事件时回复突变为功能性Gal-LacZ表型。在此实施方案中，通过向培养基中添加溴-氯-n引哚基-批喃半乳糖苷(x-gal)底物并在暗处经历一段短的孵育期有可能检测功能性Gal-LacZ表型。结果读为在诱导自发回复突变化合物的存在下转变成蓝色的集落的比例(指示基因毒性/致癌性)。在HTS适应中，将使用分光光度计来指示吸光度的差异。如本领域技术人员基于本发明理解的那样，任何合适的真核细胞可以用于实施本发明。例如，细胞可以来源于脊椎动物生物体，诸如哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物和两栖动物以及无脊椎动物(例如，昆虫、线虫)和单细胞真核生物。对于多细胞真核生物，细胞可以来自任何器官或组织，包括血液、内皮、胸腺、脾、骨髓、肝、肾、心脏、睾丸、卵巢、心肌和骨骼肌，并且可以是原代细胞或来自永生化细胞系的细胞。典型的细胞包括人类类淋巴母细胞细胞系诸如6116804(参见，例如，] 0111^丨，1 .了.等人(1992) Aubrecht, J.等人(1995))和例如酿酒酵母的酵母细胞。用于本发明的方法中的细胞和细胞系可以例如，获自ATCC，Manassas，Va. 20110-2209。 如上所定义的那样，DEL选择标记意指被破坏的基因座，其中(I)所述破坏包括在基因座内多核苷酸的插入；(2)所述多核苷酸包括部分基因座的一个复制；(3)所述多核苷酸的重复部分的头对尾(即，5'端至3'端)定向与该基因座的定向相同；以及(4)该基因座可用于细胞的表型选择。例如，当基因座包含元件A-B-C-D-E-F-G时，基于此基因座的合适的DEL选择标记可以包含序列A-B-CK-D-E-F-G。基于本发明，本领域技术人员要理解的是，在本发明的实施中，任何合适的表型选择标记都可以用于DEL选择标记。还要理解的是使用的选择标记的类型可以部分地取决于在本发明的实施中使用的细胞的类型。在本发明的一个实施方案中,DEL选择标记包括对营养素标记基因的功能的破坏，使得由于此破坏，细胞需要特定的营养素以便维持其活力、代谢活性或生长。在此实施方案中，可以测试试剂的引起所述营养素标记回复突变至其未破坏形式，由此使得细胞能够在缺少相应的营养素的培养基中生长的能力。示例性的营养素标记包括酵母细胞中的his3，其改变细胞对组氨酸的需求。基于本发明，其他营养素标记对于本领域技术人员是显而易见的。在另一个实施方案中，DEL选择标记是赋予对特定物理或化学试剂的抗性的基因，否则所述试剂将对细胞是有毒性的(即，妨碍活力、代谢活性或生长)。这种“抗性标记”赋予细胞对包括例如抗生素、抗代谢药或除莠剂的化学试剂具有抗性。抗性标记基因的功能的破坏导致当细胞暴露于毒剂时对细胞的毒性。因此，此实施方案包括测试试剂引起基因回复突变至其未破坏形式，由此使细胞能够在含有毒性物质的培养基中生长的能力。示例性的抗性标记包括dhfr ( 二氢叶酸还原酶)，其赋予对甲氨蝶呤的抗性；neo，其赋予对氨基糖甙类、新霉素和G418的抗性；以及als和pat，它们分别赋予对氯磺隆和草铵膦乙酰基转移酶的抗性(参见，Wigler, M.等人(1980) ；Colbere-Garapin, F.等人(1981))。其他抗性标记是本领域技术人员已知的或基于本发明对本领域技术人员是显而易见的。用被破坏的抗性标记转染或转化细胞可以使用本领域技术人员已知的技术进行。还要理解的是可选择标记可以是酶，所述酶可以将底物转变为可检测的底物(例如，比色沉淀物)。例如，包含将底物转变为有色沉淀物的酶的可选择标记可以被多核苷酸破坏，其中修饰DNA的试剂可以通过将破坏回复突变并且在该酶的底物的存在下产生有色沉淀物被检测。这种比色酶的实例是由LacZ基因编码的￠-半乳糖苷酶。基于本发明，本领域技术人员要理解，在本发明的范围内，DEL选择标记还可以包含未被破坏的营养素或抗性标记，其可以由次级遗传元件控制，其中所述次级遗传元件的功能被破坏。这种次级遗传元件可以包括编码转录激活物蛋白的基因，所述转录激活物蛋白结合至激活结构域，从而启动或加速营养素或抗性标记的转录速率。因此，根据此实施方案，可以测试试剂的导致所述次级遗传元件回复至其功能形式，从而能够表达营养素标记或抗性标记基因的能力。示例性的转录激活物和激活结构域序列组合包括Tet-控制的反式作用子，其是 BD Tet-Off 基因表达系统(BD Biosciences, Palo Alto, Calif.)的一部分。其他转录激活物和激活结构域序列是本领域技术人员已知的或基于本发明，对于他们来说是显而易见的。如基于本发明本领域技术人员要进一步理解的那样，DEL选择标记还可以包含未被破坏的阴性选择性标记基因，其可受转录阻遏物遗传元件控制，其中所述转录阻遏物的功能被破坏。当有活性时，阴性选择性标记对细胞有毒性。因此，根据此实施方案，可以测试试剂的导致所述转录阻遏物回复至其功能形式，从而能够表达所述阴性选择性标记基因 的能力。示例性的阴性选择性标记是单纯疱疹病毒基因，胸苷激酶，其在药物丙氧鸟苷的存在下导致细胞毒性(Moolton (1986))。其他阴性选择性标记包括Hprt (在6-硫代鸟嘌呤或6-硫代黄嘌呤的存在下具有细胞毒性)，以及白喉毒素、蓖麻毒蛋白毒素，和胞嘧啶脱氨酶(在5-氟胞嘧啶的存在下具有细胞毒性)。转录阻遏物遗传元件当被表达时将阻止阴性选择性标记的表达。示例性的转录阻遏物通过使用例如，Fire等人(1998),Brummelkamp等人(2002)中所述的方法以及本领域技术人员已知的其他方法来使用RNA干扰(RNAi)。如基于本发明对于本领域技术人员显而易见的，组成本发明的方法和细胞中使用的DEL选择标记的被破坏的基因或遗传元件可以是内源的基因或遗传元件或其可以是基于本发明通过本领域技术人员已知的重组方法被引入至祖细胞中的外源的基因或遗传元件。此外，本发明中使用的细胞可以是单倍体，其具有一个拷贝的每种类型的染色体，或二倍体，其具有两个拷贝的每种类型染色体。因此，当在本发明的方法和细胞中使用二倍体细胞并且组成DEL选择标记的被破坏的基因或遗传元件是外源的基因或遗传元件时，或当以其他方式存在多于一个拷贝的内源存在的基因或遗传兀件时，为了实施本发明的方法和利用本发明的细胞，一般所有拷贝的基因或遗传元件均被破坏。在一个实施方案中，用于酵母酵母细胞中的DEL选择标记包括HIS3基因，其如Schiestl等人(1988)所述通过插入质粒pRS6而被破坏，并且其如专利号为4，997，757的美国专利所述包含在酿酒酵母菌株RSY6和RSl 12中(所有这些文献的全部内容通过援引加入至本文中)。本发明利用基于线粒体酶的生色/比色的可检测信号来检测细胞活力。在本发明的方法中可以使用许多其他的酶比色测定法。在另一个实施方案中，可以使用可检测信号的组合。例如，可以使用生物发光和比色法的组合。基于本发明，本领域技术人员要理解的是，任何合适的生物发光标记可以用于实施本发明。要进一步理解的是，使用的生物发光标记的类型可以部分地取决于在本发明的实施中使用的细胞的类型。用于酵母细胞中的示例性生物发光标记是由组成性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子驱动的萤火虫萤光素酶(Iuc)基因(GeneBank登记号AAA89084)。被Iuc基因催化的生物发光需要底物(萤光素)和内源性ATP形式的能量。只要其中生长细胞的培养基含有萤光素作为补充剂，则酵母细胞的生物发光唯一地取决于细胞内ATP的利用度。由于细胞内ATP浓度取决于能量代谢，因此生物发光输出代表了酵母细胞的代谢活性水平。在本发明的方法中，引起缺失重组事件以恢复DEL选择标记的功能的测试化合物允许细胞在缺少可适用营养素或存在具有潜在细胞毒性的物质的情况下保持代谢活性和繁殖。在本发明的方法和细胞中可以使用的其他生物发光标记是本领域技术人员已知的或基于本发明对于他们是显而易见的。例如，Bronstein等人(1994)记述了可以在本发明中使用的生物发光标记。对于组合测定，用于本发明的方法和细胞中的生物发光标记和DEL选择标记可以通过将编码这些标记的多核苷酸插入至适宜的载体中而被结合至细胞中。这样的载体可以被设计成使得它们被稳定地结合至细胞的染色体DNA中或它们可以被设计成表达可适用的标记而无需染色体整合。 含有对于被插入的编码序列在细胞中的转录和翻译控制必需的元件的表达载体可以用来将生物活性酶(用于生成比色信号)、生物发光标记或在用测试试剂处理后回复突变时将变成生物活性的DEL选择标记掺入细胞中。转录和翻译控制元件包括调控序列，诸如增强子、组成性和诱导性启动子，以及载体中和编码可适用标记的多核苷酸序列中的5'和3'非翻译区。此类元件的强度和特异性可以发生变化。还可以使用特殊的起始信号来实现编码所述标记的序列的更有效翻译。此类信号包括ATG起始密码子和邻近序列，例如，Kozak序列。在编码标记的序列及其起始密码子和上游调控序列插入至适宜的表达载体中的情况下，可以不需要额外的转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其片段的情况下，包括框内ATG起始密码子的外源翻译控制信号应当由载体提供。外源翻译元件和起始密码子可以是各种来源的，天然和合成的两者。表达效率可以通过包含对使用的特定宿主细胞系统适宜的增强子来增强(参见，例如，Scharf，D.等人(1994))。基于本发明本领域技术人员熟知的方法可以用来构建包含编码比色酶的多核苷酸、生物发光标记或DEL选择标记以及适宜的转录和翻译控制元件的表达载体。对于其中DEL选择标记涉及破坏内源基因的本发明的实施方案，结合DEL选择标记的典型方法通过同源重组进行。用于将工程基因构建体结合至细胞的染色体DNA中的同源重组方法是本领域技术人员熟知的和/或基于本发明对于他们将进一步是显而易见的。在包含DEL选择标记的细胞的制备中，DEL选择标记靶向载体被引入至具有未被破坏的靶基因的细胞中。被引入的载体使用载体中的与靶基因同源的核苷酸序列靶向该基因。同源序列促进载体和靶基因序列之间的杂交。杂交通过交换事件使载体序列整合至靶基因中，导致靶基因的破坏。关于用于祀向的载体的构建的通用原理见Bradley等人(1992)的综述。基于本说明书，关于选择和使用有效用于同源重组的序列的指导记载在文献(参见，例如，Deng和Capecchi (1992) ;Bollag 等人(1989);以及 Waldman 和 Liskay (1988))中。如本领域技术人员基于本发明将认识到，大量的克隆载体可以在本发明的DEL选择标记祀向载体的构建中用作载体骨架，包括pBluescript-相关质粒(例如，BluescriptKS+11)、pQE70、pQE60、pQE_9、pBS、pDIO、phagescript、phiX174、pBK 噬菌粒、pNH8A、pNH16a、pNH18Z、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540 和 pRIT5PWLNE0、pSV2CAT、pXTl、pSG (Stratagene)、pSVK3、PBPV, PMSG 和 pSVL、pBR322 和基于 pBR322 的载体、pMB9、pBR325、pKH47、pBR328、pHC79、phage Charon 28、pKBll、pKSV-10、pK19 相关质粒、pUC 质粒、以及pGEM系列质粒。这些载体可获自广泛的商业来源(例如，Boehringer MannheimBiochemicals, Indianapolis, Ind. ；Qiagen, Valencia, Calif. ；Stratagene, La Jolla,Calif. ；Promega, Madison, ffis.;以及 New England Biolabs, Beverly, Mas. ) 然而，可以使用任何其他的载体，例如，质粒、病毒或它们的部分，只要它们在所需的宿主中可以复制并能存活。载体还可以包含使其能够在基因组将要被更改的 宿主细胞中复制的序列。这种载体的使用可以延长期间可以发生重组的相互作用时期，增加靶向的效率(参见Ausubel等人(2003) ,9. 16 单元，图 9. 16. I)。用于扩增本发明的靶向载体的具体宿主细胞不是至关重要的。实例包括大肠杆菌K12RR1 (Bolivar 等人，(1977))、大肠杆菌 K12HB101 (ATCC No. 33694)、大肠杆菌 MM21 (ATCCNo. 336780)、大肠杆菌DHl (ATCC No. 33849)、大肠杆菌菌株DH5a和大肠杆菌STBL2。可选地，可以使用宿主细胞诸如酿酒酵母或枯草芽孢杆菌。上面提及的示例性宿主，以及其他合适的宿主可商业获得(例如，Stratagene, La Jolla, Calif.;和 Life Technologies,Rockville, Md.)。一般来说，用于破坏靶基因的靶向构建体还包含编码抗性标记蛋白的外源核苷酸序列。如上文关于各种可能类型的DEL选择标记所述，抗性标记赋予对特定的物理或化学因子的抗性，所述物理或化学因子否则对细胞是有毒性的。抗性标记基因位于两个侧翼同源区之间，使得其在交换事件后以下列的方式整合至靶基因中，所述方式使得抗性标记基因被定位成在整合后表达。通过施加可选择条件，可以基于活力将稳定表达抗性标记编码载体序列的细胞与没有成功整合该载体序列的其他细胞分离。抗性标记的上述使用不区分已经通过靶向的同源重组在靶基因座处整合所述载体而非通过载体序列的随机、非同源整合至任何染色体位置的细胞。因此，当使用用于同源重组的取代载体来制备本发明的细胞时，包含编码阴性选择性标记蛋白的多核苷酸也是有用的。如上文关于各种可能类型的DEL选择标记所述，阴性选择性标记是当被表达时对细胞有毒性的蛋白。编码阴性选择性标记的核苷酸序列位于取代载体的两个同源区的外部。假定采取这种定位，如果通过随机的、非同源重组发生整合，细胞将仅整合和稳定表达阴性选择标记；靶基因与靶向构建体中的两个同源区之间的同源重组将从整合中排除编码阴性选择标记的序列。因此，通过施加阴性条件，已经通过随机的、非同源重组整合靶向载体的细胞丧失活力。包含比色酶标记和/或生物发光标记和DEL选择标记(或它们的靶序列)的载体可以根据本领域技术人员熟知的标准方法或基于本发明对他们显而易见的那些方法被引入至细胞中。如本领域技术人员要理解的是，选择的转化方案将取决于，例如，细胞类型和目的基因的性质，并且可以基于常规的实验来选择转化方案。几种转化方案见Kaufman (1988)的综述。方法可以包括电穿孔、磷酸I丐沉淀、逆转录病毒感染、微注射、生物弹道技术(biolistics)、脂质体转染、DEAE-葡聚糖转染或转铁蛋白转染(transf err infect ion)(参见，例如，Neumann 等人(1982) ;Potter 等人(1984) ;Chu 等人(1987) ;Thomas 和 Capecchi (1987) ;Baum 等人(1994) ;Biewenga 等人,(1997) ;Zhang 等人，(1993) ;Ray 和 Gage(1992) ；Lo(1983) ;Nickoloff 等人(1998) ;Linney 等人(1999)；Zimmer和Gruss, (1989);以及Robertson等人,(1986))。在本发明的实施中用于将外来DNA引入至酵母细胞中的经典方法涉及使用乙酸锂/PEG，如Gietz和Woods (2002)中所述。将要在本发明的方法的实施中使用的细胞可以基于本公开内容根据本领域技术人员熟知的方法进行保存和培养。例如，哺乳动物细胞可以根据Bonifacino等人(2003)，第I章中所述的方法进行培养。酵母细胞可以根据Ausubel等人(2003)，第13章中所述的通用方法进行培养。在本发明的方法的实施中，用测试试剂对细胞的处理可以基本本公开内容根据本领域技术人员已知的方法进行。使用的方法将取决于许多变量，包括使用的细胞类型、DEL选择标记的特性和使用的测试试剂的特性。在一个实施方案中，具有his基因的破坏作为DEL选择标记的酵母细胞(酿酒酵母)用测试试剂在25ml试管中处理，然后在30°C下平板培养约48h。处理后将细胞洗涤，例如，用PBS洗涤，并进行超声处理以确保细胞解离成单细胞悬液。然后将细胞以适宜的稀 释度(见下)在缺少组氨酸的培养基上以及包含组氨酸的标准培养基上平板接种。缺少组氨酸的培养基用来确定重组频率。标准培养基(包含组氨酸的培养基)用来确定测试试剂的总毒性。为了确定用于平板接种的最适细胞稀释度，可以使用细胞计数装置对细胞进行计数(例如，使用 Coulter Particle Counter, Coulter Corp.，Miami, Fla.)。然后制备 10倍连续稀释液(Dtl-D5，其中Dtl是初始细胞培养物)。最适细胞稀释度使得存在充足的细胞从而能够测量以下各项(a)测试试剂的毒性；(b)细胞的基线重组频率(未处理)；和(c)处理后的DEL重组水平。例如，当使用酿酒酵母细胞时的典型稀释度为I X IO5至I X IO7个细胞每mL。对于高通量检测，细胞可以接种至多孔板(例如，12,24或48、96或384孔)。细胞然后孵育充足的时间从而使回复突变菌落能够生长，一般96孔或384孔板在30°C孵育约17小时。如本领域技术人员要理解，基于本公开内容，使用MTT或MTS测定检测回复突变菌落。MTT或MTS测定测量经由线粒体酶的MTT或MTS的还原。线粒体酶存在于活细胞中，因此提供选择培养基中活细胞的指示。当使用组合测定时，可以通过测量在MTT或MTS的存在下由线粒体中的酶产生的比色信号以及生物发光测定两者进行检测。可以使用任何光检测装置，例如可用来鉴定多孔板中菌落的Lumi-lmager Fl光子计数装置(RocheDiagnostics, Indianapolis, Ind.)来可视化生物发光。可以使用的其他光检测装置包括NightOwl (Berthold 德国)和 Kodak IS1000 (Kodak, Rochester,Md.)。此外，细胞的生物发光菌落的数字图像适合使用图像分析软件进行自动化数据评价(例如，Image Plus PrO ,ver.4. I(Media Cybernetics, Inc. , Carlsbad, Calif.)。回复频率可以表示为每细胞总数中在测试试剂处理后存活的回复突变细胞的数目。例如，对于具有his—DEL选择标记的酿酒酵母，可以使用下列的公式来计算回复频率FR = (RxD)/(SxD/ );其中FR =回复频率；R =在缺少组氨酸的培养基上回复突变菌落的数目；S=标准培养基上的菌落数目；D =在缺少组氨酸的培养基上接种的细胞的稀释因子；和D'=在标准培养基上接种的细胞的稀释因子。
与对照相比回复频率的任何统计学显著的增加指示测试试剂具有潜在的基因毒性和/或致癌性。统计学显著性的确定是本领域技术人员熟知的或基于本公开内容将是显而易见的。典型的阳性结果得到的P-值不大于0.05，更典型地不大于0.01 (Brownlee (1960))。如对于本领域技术人员基于本公开内容将显而易见的是，与对照相比细胞群中回复频率的确定需要校正测试试剂的继发效应。例如，导致回复频率增加的某些测试试剂还可以降低细胞的生长和/或分裂速率。结果，在未处理的对照细胞中回复细胞的数目可能比经处理的细胞群中回复细胞数目增长得更快，使得对照中的总群体超过经处理细胞中的总群体。一种校正这种继发效应的方法通过固定各个经处理的细胞和对照细胞的群体来进行，例如，使用为固体或半固体的选择培养基，使得所述细胞形成单个菌落。然后基于可检测到的菌落或小菌落的数目确定回复频率。 上述测定方法仅用于说明的目的。本领域技术人员基于本公开内容会理解，在本发明的实施中可以利用多种测定形式。基于细胞类型、DEL选择标记、比色标记、比色标记和生物发光标记的组合以及使用的测试试剂、处理和培养细胞的方法和检测回复体的方法可以做出许多变化。尽管本发明的方法和细胞的所描述的一种用途是用于检测化学诱变剂/基因毒性剂，但本发明还可适用于可能引起诱变性/基因毒性的其他因素，例如，环境因素诸如电离辐射。下面的实施例旨在被解释为对本发明的实施仅是说明性的，并且无论如何不以任何方式限制本公开的其余内容。实施例包括DNA缺失的DNA重排参与致癌作用。筛选酵母中DNA缺失的测定(DEL测定)可以检测沙门氏菌/Ames测定阴性以及阳性的致癌物。在58种化合物(采用沙门氏菌测定法检测大部分是假阴性和假阳性)中，DEL测定准确地鉴定出86%的致癌活性，而相比之下在沙门氏菌测定中准确鉴定出36%。另外，已经报道致癌物在采用人细胞的体外相关测定和采用小鼠的体内相关测定中诱导DNA缺失。酿酒酵母的RS112酵母DEL测定测试株包含在基因组HIS3基因座处整合的具有HIS3基因内部片段的质粒，导致HIS3基因的整合性破坏。这种破坏产生两个拷贝的HIS3基因，每个拷贝具有一个末端缺失。两个his3缺失等位基因之间的重组导致回复突变为HIS3+并在缺少组氨酸的条件下生长。这种重组事件产生6kb DNA缺失，包括引起缺失(DEL)事件的被整合的质粒。利用DEL事件的测定涉及RS112株的单个菌落过夜生长，随后在存在或缺少被测试的化学品的情况下在30°C持续摇动继代培养17小时。然后酵母平板接种至SC培养基以测定存活细胞数目(计数单个菌落)，并平板接种至SC-HIS培养基以对DEL事件计分。如果测试有限数量的化学品，则传统的DEL测定是非常有效的，但对于筛选大量的化学品和化学文库则变得不实用。每600ml蒸馏水中酵母氮源0.67%、葡萄糖2%、琼脂2%以及下列的氨基酸和碱硫酸腺嘌呤、I-异亮氨酸、I-亮氨酸、I-赖氨酸-HC1、I-酪氨酸每种40mg，30mg I-精氨酸-HCl、I-组氨酸-HCl、I-甲硫氨酸、尿嘧啶，60mg I-色氨酸。对于基于孔的实验，不加入琼脂。在高压灭菌后每600ml蒸馏水中加入酵母氮源0. 67%、葡萄糖2%以及下列的氨基酸和碱12mg尿嘧啶，24mg硫酸腺嘌呤，12mg I-组氨酸。下列的化合物购自Sigma :溶解在0. 2 %丙酮中的放线菌素D (CASNo. 50-76-0)、甲磺酸乙酯(CAS No. 62-50-0)、喜树碱(CAS No. 7689-03-4)、溶解在 0. 2 % DMSO 中的4-硝基喹啉-I-氧化物(CAS No. 56-57-5)、丝裂霉素 C(CAS No. 50-07-0)、CrC13 (CASNo. 10025-73-7)、K2Cr207 (CAS No. 1333-82-0)、苯(CAS No. 71-43-2)、甲磺酸甲酯(CASNo. 66-27-3)、环磷酰胺一水合物(CAS No. 6055-19-2)、二甲亚砜(CAS No. 67-68-5)丙酮(CASNo. 67-64-1)。下列的化合物购自VWR :卡莫司汀(CAS No. 154-93-8)、苯丁酸氮芥(CASNo. 305-03-3)和顺钼(CAS No. 15663-27-1)。除了 4-硝基喹啉 _1_ 氧化物(0. 4%丙酮)、喜树碱(DMSO)和苯丁酸氮芥(I 50HCL-甲醇)以外，在水中制备每种化合物的储备溶液。测试约0. 1%的丙酮(例如，0.05-2% )、约1%的DMSO(例如，0. 1-2% )和HCL-甲醇的DEL诱导，因为它们用作溶剂。二倍体酿酒酵母株RSl 12用来测定DEL重组的频率MATa/MAT a ura3-52/ura3_52leu2-3,112/leu2- A 98 trp5_27/TRP5 arg4-3/ARG4ade2-40/ade2-101 ilvl-92/ILVlHIS3::pRS6/his3 A 200 LYS2/lys2_801。对于384孔板形式，对于每种化合物将I U I酵母( 100，000个细胞)吸入至微孔板的8个孔中，其中4个孔含有70 ill SC培养基，4个孔含有70 ill SC-HIS培养基；每孔补充以14iU MTS和5iil化合物。对于96孔板形式，除了培养基、MTS和化合物体积分别为IOOu 1.20U I和7iU以外均一致。对照孔的处理用水代替化合物。96孔板的最外侧列和每个384孔板的外侧两列不进行实验以免边缘蒸发效应改变数据。将板在30°C在标准大气压下孵育，期间酵母在测试化合物的存在下生长并且使用Molecular Devices SpectraMaxM5 microplate reader (Sunnyvale, CA)在 10_18h 后测量 490nm 吸光度。设立模拟实验以测量基于孔的DEL测定的灵敏度。在96孔板上，含有在IOOiUSC-HIS培养基中的100，000个RS112酵母细胞的孔一式六份地(six-plicate)补充以在0个细胞至1000个细胞范围内的5 ill RS112 His+回复突变细胞。20 ill MTS加入至每孔，将板在 30°C孵育，并使用 Molecular Devices SpectraMax M5 微孔板读数器(Sunnyvale,CA)在12小时和24小时之间每小时读取490nm吸光度一次。对于指定化合物处理的存活率通过将包括处于SC培养基中的4个处理孔的吸光度取平均值并将该平均值除以对照孔的平均吸光度来定量。DEL诱导通过将每个SC-HIS孔的吸光度除以相应配对的SC孔的吸光度来定量。因此对于以一式四份完成的每种化合物，每个板含有一组4个不同的DEL诱导的测量值。对于每种化合物，经处理培养物与对照培养物相比平均DEL诱导的比率作为DEL事件(HIS+生长)的倍数增加。对4个DEL诱导的测量值和来自对照孔的记录的相同测量值进行t-检验以确定倍数增加的显著性。应该注意这个倍数增加的值用于显著性的统计学分析，但不是绝对值；因此两个不同的化学品可能具有相同的倍数增加但显著性水平不同。在图和表中，给出了来自以一式四份进行的单个实验的数据；所有实验以96孔板和384孔板两种形式在至少3次不同的实验中独立地重复。DEL测定已经被修改成基于孔的形式。为了确定实验灵敏度，进行模拟实验，该模拟实验使用96孔板模拟DEL诱导。当在孵育后18小时测量吸光度时测定最灵敏，在该时间少至25个RS112His+回复突变细胞(对应于2. 5次DEL事件/10，OOO个细胞)可以与100, 000个RS112细胞中的自发本底水平明显地相区分。在分散至微孔中后12小时明显地检测到250个RS112His+回复突变细胞(图I)，提示使用基于孔的DEL测定可以快速地分辨DEL重组的强诱导物(诱导25-250或更多次DEL事件/10，000个细胞)。为了验证基于孔的DEL测定，在96孔板和384孔板两种形式中使用以前通过基于板的DEL测定表征的9种致癌物。在添加MTS后少至10-12h，所有高度和中度基因毒性处理(与通过基于板的测定所观察到的每100，000个细胞> 250次被诱导的DEL事件相当)均容易与对照相区分。对于大多数测试的化合物，浓度范围与采用基于板的DEL测定的前期研究中所报道的那些范围类似，然而丽S的浓度范围则降低以避免细胞毒性增加。对于在此使用的浓度，这些化合物在酵母中显示对DEL重组的不同诱导水平。以此方式，基于孔的测定的灵敏度可以使用以前使用基于板的测定获得的数据进行验证。另外，对以前未通过DEL测定表征的一组交联剂进行基因毒性诱导的测试。在图2中绘制了通过基于孔的DEL测定测试的13种不同的致癌物的生长测量值， 并且在表I中给出计算的细胞毒性和基因毒性。暴露于2、5和IOii g/ml EMS的酵母细胞显示在+13培养基中的生长减弱并且在-HIS培养基中的生长增加。EMS对存活的毒性作用是剂量相关的，因为在用g/ml EMS处理的样品中观察到较大的存活，而用IOii g/ml处理的那些产生最小的存活。尽管对于每种EMS处理，DEL倍数增加显著大于在未处理对照
中所观察到的，但与采用基于板的测定一样，没有分辨出与剂量的定量基因毒性关系。
DEL (倍数 DEL显著性2细胞毒性细胞毒性显著
化合物增加)1(%存活)3性
EIVlS4 (2昭/ml)1.59***38.2***
EMS (^iLigZml)3.19***8***
EMS (l()|ig/inl)2.(0***0.7()***
4NQ04 (0.08昭/ml)3,39***2o***
权利要求
1.一种构建体，包含被生色酶基因破坏的营养缺陷型基因，所述生色酶基因被编码选择标记的多核苷酸破坏。
2.权利要求I所述的构建体，其中所述营养缺陷型基因包括His3基因且所述选择标记包括Ura3基因。
3.权利要求I所述的构建体,其中所述构建体包括质粒。
4.权利要求I所述的构建体，其中所述构建体是被引入至宿主细胞基因组中的重组体。
5.权利要求I所述的构建体，其中所述生色酶基因包括LacZ。
6.权利要求4所述的构建体，其中所述宿主细胞包括真核细胞。
7.权利要求6所述的构建体，其中所述宿主细胞选自由哺乳动物淋巴样细胞；人类类淋巴母细胞；和酵母细胞组成的群组。
8.权利要求7所述的构建体，其中所述酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
9.权利要求I所述的构建体，其包含选自由下列各项组成的群组的序列(a)SEQID NO :1， (b)与SEQID NO :195%相同的序列； (c)(a)或(b)的互补体；和 (d)(a)、(b)或(C)的序列，其中T可以是U。
10.一种宿主细胞，其被重组改造为包含权利要求I所述的构建体。
11.权利要求10所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是真核细胞。
12.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述细胞是酿酒酵母。
13.—种表征试剂的诱变性的方法，包括使权利要求10所述的宿主细胞与所述试剂接触，并测量￠-半乳糖苷酶的活性。
14.一种表征试剂的方法,包括 用或不用试剂处理包含DEL选择标记的真核细胞培养物； 在合适的选择培养基的存在下测量所述细胞培养物的被处理部分的线粒体活性；以及 在所述选择培养基的存在下测量所述细胞培养物的未处理部分的线粒体活性。
15.权利要求14所述的方法，其中线粒体活性相对于对照的增加指示该测试试剂促进诱变。
16.权利要求14所述的方法，其中所述线粒体活性通过检测MTT或MTS的减少来测量。
17.权利要求14所述的方法，其中所述细胞培养物包含选自由哺乳动物淋巴样细胞；人类类淋巴母细胞；和酵母细胞组成的群组的细胞。
18.权利要求17所述的方法，其中所述细胞培养物包含酿酒酵母。
19.权利要求14所述的方法，其中所述检测通过检测比色沉淀物来测量。
20.权利要求14所述的方法，其中所述方法在多孔板中进行。
21.权利要求14所述的方法，其中所述DEL选择标记是代谢酶或途径。
22.权利要求14所述的方法，其中所述DEL选择标记是抗-微生物抗性基因。
23.权利要求14所述的方法，其中所述DEL选择标记是his基因。
全文摘要
本发明提供了用于测定试剂的致诱变性质的方法、系统和试剂盒。所述方法系统和试剂盒利用DEL选择标记和比色检测系统。还包括利用DEL选择标志物和检测线粒体活性的试剂的方法系统和试剂盒。
文档编号C12N15/79GK102741412SQ201080062755
公开日2012年10月17日 申请日期2010年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者伊里·奥布雷赫特, 叶连娜·O·里维纳, 尼科斯·霍恩特吉亚斯, 库尔特·M·哈弗, 罗伯特·H·席斯特尔 申请人:加利福尼亚大学董事会