选择具有确定分化能力的干细胞克隆的制作方法

专利名称：选择具有确定分化能力的干细胞克隆的制作方法
选择具有确定分化能力的干细胞克隆
背景技术：
本申请要求2009年12月2日提交的美国专利申请第61/266，072号的优先权，其全文通过引用具体纳入本文而无放弃声明。
1.技术领域 本发明一般涉及干细胞选择、干细胞分化和细胞治疗的领域。更具体地，本发明涉及选择具有确定分化能力的非遗传修饰克隆多能干细胞系的方法，和由本发明方法所生成干细胞克隆的应用。2.相关领域描述包括胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞在内的多能干细胞为研究早期发育、疾病建模和毒理学以及细胞治疗应用带来极大希望。成体和胚胎神经干细胞也如此。由于这种细胞可在培养中增殖并维持其分化成不同细胞类型的潜能，它们可提供几乎不受限制的细胞供给用于治疗各种疾病。一个活跃的研究领域是用细胞疗法治疗神经系统疾病和心血管病。治疗神经系统退行性疾病的一种方法是将中枢神经系统的细胞如多巴胺能神经元移植到神经系统的受影响区域。用于细胞治疗的潜在细胞源通过体外分化ES细胞、诱导多能干(iPS)细胞和其它类型干细胞来制备。就人、恒河猴和狨猴ES细胞描述了制备灵长类ES细胞培养物的方法(美国专利号 5，843，780; 6, 200，806; 7, 029，913)。不幸的是，尽管易通过培养获得衍生自多能干细胞的不同细胞类型异质混合物，但其靶向分化成特定谱系仍是难题。一般，培养中的ES细胞分化产生细胞的异质混合物，其中仅一些可能是适于细胞治疗的分化细胞，如神经细胞。更受控的分化过程会有力地帮助改善来自干细胞的神经细胞和组织工程改造。因此，需要从干细胞制备分化细胞用于细胞治疗的改良方法。

发明内容
本发明部分基于对提供具有特定或具体分化潜能的多能干细胞克隆群的方法的鉴定。本发明的方法具有提供分化细胞的富集群体的益处，所述细胞能应用于采用ESC的细胞治疗或生物技术。另外，在治疗性应用中采用纯化或高度纯化的分化细胞可减少对象中不良作用的风险，如将细胞移植入脑后畸胎瘤或神经上皮瘤的风险。此外，本发明的方法可提供未遗传修饰的细胞克隆群。本发明包括生成或产生细胞克隆群的方法，所述方法包括a)获得多能(pluripotent)或多潜能(multipotent)细胞群,所述细胞在体外扩增并维持于未分化或基本未分化状态山)将所述群中的个体细胞扩增成细胞克隆群；和c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞克隆群经确定能分化成对至少约50%均一的任一神经细胞类型、肝细胞、肌肉细胞或心肌细胞群体。在某些实施方式中，所述方法还可包括提供一个或多个选定细胞群的细胞或其后代。如以下实施例所示，某些克隆多能干细胞系中的肝细胞典型标记物在向拟胚体分化期间增加约100倍。“细胞克隆群”在本文中定义为指源自单个共同祖先细胞的细胞组。术语“多能干细胞”指能使细胞产生所有3个胚层即内胚层、中胚层和外胚层的细胞。尽管在理论上多能细胞可分化成任何机体细胞，实验测定多能性通常是基于多能细胞分化成各胚层中的数种细胞类型。在本发明的一些实施方式中，多能干细胞是从囊胚的内细胞团衍生的胚胎干(ES)细胞。在其它实施方式中，所述多能干细胞是通过分化细胞重编程衍生的诱导多能干细胞。在某些实施方式中，所述多能干细胞是通过体细胞核移植衍生的胚胎干细胞。所述多能干细胞可以是人胚胎干细胞。人胚胎干细胞的非限制性示例包括 Hl、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BGOI、BG02、BG03、HSFl、HSF6、Hl、H7、H9、Hl3B 和H14。多能细胞可以是如下更详细讨论的诱导多能细胞(iPSC)。iPSC的非限制性示例包括 iPS6. I、iPS 6. 6、iPS、iPS 5. 6、iPS 5. 12、iPS 5. 2. 15、iPS 5. 2. 24、iPS 5. 2. 20、iPS
6.2. I和iPS 5/3-4. 3。所述方法还包括扩增所选细胞克隆群。所述方法还包括确定细胞 是否能分化成对任一神经细胞、肝细胞或心肌细胞至少约50%同质的群体。所述方法还包括提供所选细胞克隆群。所述方法还包括制备用于储存或运输的选定细胞克隆群。所述制备用于储存或运输的细胞可包括冷冻细胞。术语“多潜能干细胞”指能分化成有限数量组织类型的干细胞。多潜能干细胞的非限制性示例包括神经干细胞和造血干细胞。“神经干细胞”是来自神经组织的未分化细胞，能产生更多的神经干细胞(即显示自我更新)和最终将分化成神经细胞的后代细胞。神经干细胞可以是成体或胚胎神经干细胞。本文所用的术语“心肌细胞”指(a)显示已知存在于成熟或未成熟心肌细胞中的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟或未成熟心肌细胞中的一种或多种标记物或其它蛋白的细胞。因此，本文所用的术语“心肌细胞”指成熟或未成熟心肌细胞。形态特征的非限制性示例包括形成跳动肌肉细胞，表达心特异性肌节蛋白，表达离子通道。标记物的非限制性示例包括心肌肌钙蛋白I (cTnl)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2. 5、N-钙粘蛋白、β I-肾上腺受体(β I-AR)、ANF、MEF-2 转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白和心钠素(Li等，2006)。本文所用的“神经细胞”指显示(a)显示已知存在于成熟神经元、未成熟神经元、成熟胶质细胞、未成熟胶质细胞或神经祖细胞的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟神经元、未成熟神经元、成熟胶质细胞、未成熟胶质细胞或神经祖细胞的一种或多种标记物、神经递质或其它蛋白的细胞。形态特征的非限制性示例包括小细胞体、树突和轴突样多重突起。标记物、神经递质或其它蛋白的非限制性示例包括a)神经元特征性的β 3-微管蛋白、微管相关蛋白2(ΜΑΡ-2)或神经丝；b)星状细胞中存在的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) ；c)少突细胞特征性的2’，3’ -环核苷酸3’ -磷酸二酯酶(CNPase)、半乳糖脑苷脂(GaIC)或髓磷脂碱性蛋白(MBP) ；d)未分化ES细胞特征性的0ct_4 ；e)神经前体和其它细胞特征性的Pax-6和巢蛋白；f)发育中的中枢神经系统特征性的Sox I ；g)存在于儿茶酚胺神经元中的酪氨酸羟化酶(TH) ；h)存在于含Y-氨基丁酸的神经元中的谷氨酸脱羧酶同种型67(GAD67) ；i)中间神经分化特征性的波形蛋白；和j)多巴胺分泌、放射性多巴胺摄取和多巴胺转运体表达，其是多巴胺能分化的特征。“胶质细胞”的非限制性示例包括星状细胞、少突细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞、施万(Schwann)细胞和卫星细胞。本文所用的“神经细胞”包括“神经元细胞”。本文所用的“神经元细胞”指成熟或未成熟神经元。例如，成熟或未成熟神经元可以是成熟或未成熟多巴胺能神经元。本文所用的术语“肝细胞”指(a)显示已知存在于成熟或未成熟肝细胞中的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟或未成熟肝细胞中的一种或多种标记物或其它蛋白的细胞。因此，本文所用的术语“肝细胞”指成熟或未成熟肝细胞。形态特征的非限制性示例包括嗜酸性胞质，大量线粒体和嗜碱性点彩，具有分散染色质和显著核仁的圆核。还可通过鉴定包括甲胎蛋白、白蛋白在内的肝特异性蛋白表达来识别肝细胞。可用于区分肝细胞的其他方法包括电子显微镜、免疫细胞化学、免疫荧光、定量PCR、蛋白质印迹和原位杂交。所选细胞克隆群可显示心原性分化潜能。所选细胞克隆群可显示肝细胞分化潜能。或者，所述细胞克隆群可显示神经原性分化潜能。表现出神经原性分化潜能的细胞克隆群可显示分化成任何特定神经细胞类型。非限制性示例包括神经元、少突细胞、星状细胞、小胶质细胞、卫星细胞和施万细胞。在具体实施方式
中，所述神经细胞是多巴胺能神经元。
在一些实施方式中，所选细胞克隆群可显示能分化成至少55%神经细胞、至少60%神经细胞、至少65%神经细胞、至少70%神经细胞、至少75%神经细胞、至少80%神经细胞、至少85%神经细胞、至少90%神经细胞、至少95%神经细胞、或至少99%神经细胞，或其中任何可派生范围。在其它实施方式中，所选细胞克隆群可显示能分化成至少55%心肌细胞，至少60%心肌细胞、至少65%心肌细胞、至少70%心肌细胞、至少75%心肌细胞、至少80%心肌细胞、至少85%心肌细胞、至少90%心肌细胞、至少95%心肌细胞、或至少99%心肌细胞，或其中任何可派生范围。在其它实施方式中，所选细胞克隆群可显示能分化成至少55%肝细胞，至少60%肝细胞、至少65%肝细胞、至少70%肝细胞、至少75%肝细胞、至少80%肝细胞、至少85%肝细胞、至少90%肝细胞、至少95%肝细胞、或至少99%肝细胞，或其中任何可派生范围。本文所示方法中考虑使用将群体的个体细胞扩增成细胞克隆群的任何方法。所述方法可包括分离群体的个体细胞。本发明的实施中可用各种免疫选择来分离细胞，包括但不限于流式细胞术(FACS)、免疫磁性技术、抗体柱、免疫沉淀和免疫抗体包被筛选(immunopanning)。下面说明书中讨论了其它示例。在特定实施方式中，分离在体外进行。细胞培养技术为本领域普通技术人员所熟知。这类技术的非限制性示例列于下面说明书。在一些实施方式中，细胞克隆群接触一种或多种分化剂以诱导分化成神经细胞类型或心肌细胞。本文所用的术语“分化诱导”或“诱导分化”指由于对干细胞直接或有意的影响而引起干细胞发育成特定分化细胞类型。影响因素可包括细胞参数如离子流入、PH改变和/或胞外因子如分泌蛋白，例如但不限于调节和引发分化的生长因子和细胞因子。这可包括将细胞培养至汇合且可受细胞密度影响。在一些实施方式中，分化剂由细胞提供。这种试剂的非限制性示例列于下面说明书。本领域普通技术人员已知的任何评价细胞分化方法可考虑应用于本发明方法。通过将未分化干细胞接触分化剂制备的分化细胞可以形态学、免疫化学和其他方式鉴定从而确认其状态为神经前体细胞、心肌细胞、肝细胞或其它细胞类型。关于形态分析，可根据一些表型标准鉴定细胞。所述标准包括但不限于显微镜观察形态特征、检测或定量表达的细胞标记物、酶活性、神经递质及其受体、和电生理功能。还可根据细胞是否表达特定种类细胞的特征性表型标记物来评价细胞的分化。可用任何合适免疫学技术检测本领域已知的组织特异性标记物以评价分化，所述技术如用于细胞表面标记的流式免疫细胞化学和荧光激活细胞分选，用于胞内或细胞表面标记物的免疫组化(例如，固定细胞或组织切片)，用于细胞提取物或分泌到培养基中产物的细胞提取物蛋白质印迹分析和酶联免疫测定。可在固定细胞后通过标准免疫细胞化学或流式细胞测定观察抗体与抗原的结合，用经标记二 抗或其它偶联物(如生物素-亲和素偶联物)来放大标记，或者用本领域熟知的其它免疫学方法。一般，检测免疫复合物形成为本领域熟知且可通过应用多种方法来完成。在一些实施方式中，提供细胞克隆群的方法还包括将体外扩增的细胞接触测试化合物并测量所述扩增细胞内与毒性相关的细胞参数。在特定实施方式中，细胞体外接触测试化合物。所述细胞克隆群可以是哺乳动物细胞。所述细胞来源的非限制性示例包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、绵羊、山羊、马、牛、灵长类动物或人。在特定实施方式中，所述细胞克隆群是人细胞。在某些实施方式中，在个体细胞扩增成细胞克隆群之前，所述多潜能或多能细胞传代至少一次。本发明还涉及制备或生成显示神经分化潜能提高的细胞克隆群的方法，包括步骤a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；b)从多潜能或多能细胞群个体化并扩增多个细胞；c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞群确定为能分化成就神经细胞类型而言至少约50%同质的群体；和d)提供一种或多种选定细胞群的细胞或其后代。所述扩增细胞显示能分化成至少55%神经细胞、至少60%神经细胞、至少65%神经细胞、至少70%神经细胞、至少75%神经细胞、至少80%神经细胞、至少85%神经细胞、至少90%神经细胞、至少95%神经细胞、或至少99%神经细胞，或其中任何可派生范围。在特定实施方式中，所述神经细胞是多巴胺能细胞。所述多能或多潜能细胞可以是上述任何细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括将神经细胞接触测试化合物并测量所述神经细胞内与毒性相关的细胞参数。提供细胞或其后代可包括用本领域普通技术人员已知的任何方法将细胞或其后代给予对象。本发明的一些实施方式涉及由本发明方法生成的多种克隆衍生心肌细胞，或多种克隆衍生神经细胞。本发明方法生成的心肌细胞或神经细胞可包含在组织中或可不包含于其中。所述组织可在合适容器用具中。在特定实施方式中，所述神经细胞是多巴胺能细胞。所述神经细胞可包含在组织中。所述组织和/或细胞可包括在容器用具中。本发明的其它实施方式涉及组合物和载体，所述组合物包括由本发明方法生成的多种克隆衍生神经细胞、肝细胞或心肌细胞。在一些实施方式中，所述组合物中的多种克隆衍生神经细胞、肝细胞或心肌细胞扩增自单一共同祖细胞。在其它实施方式中，所述细胞衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多共同祖细胞。所述组合物可以是配制用于给予哺乳动物对象的药物组合物。在一些实施方式中，所述组合物中的多种克隆衍生神经细胞、肝细胞或心肌细胞还定义为分离的克隆衍生神经细胞或分离心肌细胞。所述组合物可包括或不包括其它非分离的克隆衍生神经细胞或分离的克隆衍生心肌细胞。所述组合物中的细胞数量可以是至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018、至少1019、至少2(1或更多细胞，或本文可得细胞数量的任何范围。在一些实施方式中，所述组合物包括至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或更多或本文可得百分数的任何范围的神经细胞、肝细胞或心肌细胞。在一些实施方式中，所述组合物包括约90%神经细胞。在其它实施方式中，所述组合物包括约90%心肌细胞。所述组合物可包括本领域普通技术人员已知的任何药学上可接受载体。这类载体的非限制性示例在以下说明书中列出。在一些实施方式中，所述组合物包括一种或多种辅助治疗剂。辅助治疗剂的非限制性示例包括化疗剂。一些化疗剂示例在以下说明书中列出。 本发明还包括含合适容器用具的药盒，所述容器用具包含由本发明方法生成的多种克隆衍生细胞。所述细胞可以包括在组织中或可不包括于其中。其它可选药盒组成在以下说明书中列出。本发明还涉及筛选测试化合物的方法，包括a)将多种心肌细胞、肝细胞或神经细胞接触测试化合物；和b)测定由接触测试化合物引起的任何细胞表型或活性变化，其中所述细胞通过本文所示方法生成。在一些实施方式中，表型或活性是毒性的量度。可根据本领域普通技术人员已知的任何方法测定细胞表型或活性的任何变化。可应用的方法示例包括形态学分析、免疫化学分析和上述其它方法。在一些实施方式中，检测多种心肌细胞、肝细胞或神经细胞中的一种或多种基因表达。这类基因的非限制性示例包括胱天蛋白酶3、NF-kB、TNF-α、热诱导因子(HIF-1 α )、热激蛋白(Hsp)、细胞完整性基因(例如转氨酶)、Y-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶和氧化应激基因。可用本领域普通技术人员熟知的任何方法或方法组合检测基因表达。这类方法的非限制性示例包括高通量基因测序、蛋白质印迹、基因表达阵列、流式细胞术、免疫荧光、基于启动子/报道基因的试验、或比色分析。可检测的其它参数示例包括心肌细胞收缩、细胞死亡、动作电位模式和离子渗透性。本发明的其它实施方式涉及制备和生成显示心原性分化潜能的细胞克隆群的方法，包括步骤a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；b)从多潜能或多能细胞群个体化多个细胞并扩增细胞克隆群；c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞群确定为能分化成就心肌细胞而言至少约50%同质的群体；和d)根据步骤(C)中观察到的扩增细胞分化成心肌细胞的能力，使用扩增细胞用于细胞和组织工程改造、药物筛选或细胞治疗。发明的其它实施方式涉及提供显示肝细胞分化潜能的细胞克隆群的方法，包括步骤a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；b)从多潜能或多能细胞群个体化多个细胞并扩增细胞克隆群；c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞群确定为能分化成就肝细胞而言至少约50%同质的群体；和d)根据步骤(C)中观察到的扩增细胞分化成肝细胞的能力，使用扩增细胞用于细胞和组织工程改造、药物筛选或细胞治疗。
还考虑涉及通过本发明方法所生成细胞克隆群的治疗对象中疾病的方法。由本发明方法生成的细胞或其后代可用于移植、细胞治疗或基因治疗。本发明考虑使用由本发明方法生成的神经细胞、肝细胞或心肌细胞用于基于细胞的治疗。例如，所述细胞可用于再生因疾病或损伤而明显受损的成人中显著减弱的人组织。所述再生可体内或离体进行。例如，由本文所示方法生成的心肌细胞可用于再生对象中的心脏组织，其中所述对象的心脏组织由于心脏缺血而受损。可给予本发明的神经细胞以用于再生已受损或经历退化的神经系统细胞的目的。可给予本发明的肝细胞以用于再生受损或经历变性的神经系统细胞的目的。在一些实施方式中，本发明的细胞可直接给予对象。因此，本公开的方法可用于治疗多种疾病、损伤或者心脏或神经系统的其它有害病症。在一些实施方式中，本发明的心肌细胞、肝细胞或神经细胞可用于通过三维重建来建模人体器官。例如，人脑中的组织可通过本文所述方法所生成神经细胞的三维培养来建模。心脏组织可由本发明方法生成的心肌细胞衍生和重建。在一些实施方式中，本公开的神经细胞和心肌细胞还可用作要在人体各个位点递送的多种治疗活性分子或基因的载体载剂，例如通过所需基因操作细胞和使其分化，将细胞或组织递送到供体的靶位置用于基因治疗。
在一些实施方式中，所述方法包括将基本同质的神经细胞群给予对象；其中神经细胞通过本文所述方法生成或是通过本文所述方法所生成神经细胞的后代。在特定实施方式中，所述神经细胞是多巴胺能细胞。在其它实施方式中，给予的细胞是由本发明方法生成的心肌细胞。所述对象可以是已知或怀疑患有涉及神经系统的疾病或涉及心血管系统的疾病的对象。在一些实施方式中，所述疾病是神经退行性疾病。考虑治疗的神经退行性疾病的非限制性示例包括帕金森病，阿尔茨海默病，多发性硬化，中风，肌萎缩侧索硬化症(路格里克氏病)，额颞痴呆(皮克病)，朊病毒病，亨廷顿氏症，脑缺血，特发性帕金森病，局部或药物引起的帕金森综合征，不同起源的阿尔茨海默病和脑痴呆，亨廷顿氏舞蹈病，感染引起的神经退行性疾病如AIDS-脑病，克雅氏病，麻疹(rubiola)和疱疹病毒和螺旋体引起的脑病，代谢毒性神经退行性疾病如肝、酒精、缺氧、低血糖或高血糖所引起的脑病以及溶剂或药物引起的脑病，各种起源的视网膜退行性疾病，创伤引起的脑和骨髓损伤，脊髓损伤，不同起源如加入和/或停止药剂、毒素、病原和药物后的脑过度兴奋症状，精神和创伤引起的脑过度兴奋状态，周围神经系统的神经退行性综合征如代谢、药物、毒素和感染引起的多发性神经病变和多神经炎。在特定实施方式中，所述疾病是帕金森病。心血管病的非限制性示例包括心肌缺血、心肌症、充血性心力衰竭和心肌梗塞。发明的另一方面是治疗或预防心脏疾病或病症的方法。心脏病通常与心脏功能下降相关且包括病症例如但不限于心肌梗塞、心脏肥大和心律失常。在发明的此方面，所述方法包括将本发明所述分离的分化心肌细胞和/或能在用本发明方法处理时分化成心肌细胞的细胞引入对象的心脏组织。分离的分化心肌细胞可以是本文所述方法生成的心肌细胞的后代。分离的心肌细胞优选移植到对象的受损心脏组织内。更优选地，所述方法使得对象的心脏功能恢复。在一些实施方式中，所述对象是患缺血性心脏病或充血性心力衰竭的对象。所述细胞可用本领域普通技术人员已知的任何方法给予。非限制性示例包括静脉内给药、动脉内给药和心肌内给药。所述方法可选包括进行或给予一种或多种二级治疗形式用于治疗心脏病。这种治疗的非限制性示例讨论于下。本发明的另一方面提供修复心脏组织的方法，所述方法包括将本发明的分离心肌细胞或心脏祖细胞或由本文所述方法所生成心肌细胞的后代引入对象的受损心脏组织。本发明的另一方面是治疗或预防肝脏疾病或病症的方法。考虑治疗的肝病的非限制性示例包括肝炎、非酒精性脂肪肝病、硬化、肝癌、威尔逊氏病、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、小胆管自身免疫疾病、布-加综合征、吉尔伯氏综合征和II型糖原贮积症。
所述细胞可用本领域普通技术人员已知的任何方法给予。非限制性示例包括直接注射，皮内、鞘内、心脏内、透皮、胃肠外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下注入脑或中枢神经系统、经皮、气管内、腹膜内、灌注或灌洗。在特定实施方式中，通过将多巴胺能神经元注射入包括至少部分黑质致密部的区域来治疗帕金森病。给予已知或认为有益于治疗疾病的任何细胞数量。在一些实施方式中，每剂量给予约100，000-约10，000, 000个细胞。可给予单剂量，或可给予多剂量。特定实施方式中的对象是哺乳动物对象。哺乳动物对象的非限制性示例包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、山羊、绵羊、牛、马、灵长类动物和人。在一个特定实施方式中，所述对象是人。特别考虑到，关于发明的一个实施方式讨论的任何限制可应用于发明的任何其它实施方式。此外，本发明的任何组合物可用于发明的任何方法，本发明的任何方法可用于生成或利用本发明的任何组合物。尽管本公开支持的定义指仅择一以及“和/或”，但除非明确表明仅指择一或选项是互斥的，在权利要求中使用术语“或”用于指“和/或”。本申请中，采用术语“约”表明值包括用于测定该值的装置和/或方法的标准偏差。除非另有明确说明，本说明书所用的“一”或“一种”可指一个或多个。与单词“包括”联用时，本文权利要求书所用的单词“一”或“一种”可指一个或超过一个。本文所用的“另一(种)”可指至少第二(种)或更多。任何本方法、细胞和药盒的任何实施方式可由所述特征和/或步骤组成或基本由其组成-而不是包含/包括/含有/具有。因此，在任何权利要求中，术语“由…组成”或“基本由…组成”可替代上面引用的任何开放式系动词，用于改变原本使用开放式系动词的给定权利要求的范围。通过下列详细描述可以明了本发明的其它目标、特征和优点。然而应理解，尽管表明本发明的优选实施方式，详细描述和特定实施例仅以说明的方式给出，因为本领域技术人员通过此详细描述可清楚了解在本发明精神和范围内的各种变化和修改。


下列图形成本说明书的部分且被纳入以进一步证明本发明的某些方面。通过参考一张或多张这些图结合本文所示特定实施方式的详细描述可更好理解本发明。图IA-D。ESC亚群逃逸神经分化。ESC通过与PA6基质细胞共培养5天来经受神经分化。在头5天中进行早期分化。在细胞解离和再接种于多鸟氨酸后诱导晚期分化。(图1A)流式细胞仪分析早期分化中的巢蛋白和β -III-微管蛋白表达。(图1Β)流式细胞仪分析早期分化中的巢蛋白和Oct-4表达。(图1C)通过流式细胞仪分析早期和晚期ESC分化中的CFSE稀释。(图1D)分化ESC中的表型和CFSE稀释分析组合。在不同时间点对以下不同亚群评价CFSE稀释巢蛋白-阳性/ β -III-微管蛋白-阴性(神经上皮细胞)，巢蛋白-阴性/β-III-微管蛋白-阳性(神经元细胞)，巢蛋白-阴性/β-in-微管蛋白-阴性(非神经细胞)。图2Α-Ε。单个母本ESC所衍生后代的差异。(图2Α)-在一个集落衍生自一个母本ESC的实验设置中，细胞在72小时分化后就巢蛋白和β-III-微管蛋白染色。(图2Β)ESC-T a -I-GFP进行神经分化72小时并分析绿色荧光。(图2C)分析150个ESC衍生集落是否存在NeuN-阳性(成熟阶段神经元)、ΤΗ-阳性(多巴胺能神经元)和β-III-微管蛋白-阳性(神经元细胞)。(图2D)、(图2E)ESC-H2B-mRFPl进行神经分化并在头两天由实时成像监控。

图3A-B。ESC亚细胞系的mRNA表达概况。对各克隆ESC亚细胞系进行总mRNA表达概况分析(图3A)-建立与多能和/或早期内细胞团相关的mRNA表达。(图3B)-有6800个基因的表达在ESC克隆间显著不同。根据各克隆的基因表达概况，建立分层聚类分析以分类ESC克隆。最不同的2个克隆是克隆I和2，而克隆4和6高度相似。图4A-D。克隆ESC不共有神经原性和心原性潜能。(图4A，图4B,图4C)-克隆ESC通过在PA6基质细胞上共培养来进行神经分化。(图4A) 3天后评估包括巢蛋白_阳性神经上皮细胞的集落百分数。(图4B，图4C) I周后评估包括β -III-微管蛋白-阳性神经元细胞(图4Β)或(C)TH-阳性多巴胺能神经元的集落百分数。(图4D)ESC克隆1、2、3和4向拟胚体分化。通过不同时间点的跳动拟胚体百分数来评估心脏分化。图5A-H。克隆ESC不共有同一分化潜能。ESC克隆体外向拟胚体分化并通过对不同组织学类型和胚层特异性的基因表达的定量PCR来评价。图6A-B。来自D3ESC的克隆亚细胞系证实细胞多样性。对各克隆D3亚细胞系进行总mRNA表达概况分析(图6A)-建立与多能和/或早期内细胞团相关的mRNA表达。(图6B)-D3亚细胞系通过在PA6基质细胞上共培养来进行神经分化。I周后评估包括β III-微管蛋白+(神经元细胞)、neuN+成熟神经元和TH+多巴胺能神经元的集落百分数。图7A-B。β -III-微管蛋白启动子的特异性。ESC-H2B_mRFP 1-β IIIp-GFP在ΡΑ6基质细胞上神经分化I周后，针对神经细胞中巢蛋白(图7Α)和β-III-微管蛋白(图7Β)的免疫荧光。图8。单个母本ESC所衍生后代的系统发生。根据图2所述成像建立了系统发生树。显示系统发生树的5个示例。图9。克隆1、2、6和7中未鉴定衍生染色体(der)的呈现。对第16次传代的克隆
1、2、6和7进行标准核型分析。染色体是G显带并计数，显示超倍体41，XY优势群细胞O中存在额外染色体。图10。在ESC克隆I和2间差异性表达的基因的功能分类。用MetaCore鉴定路径。图表是基于在克隆I和2间的311个差异性表达mRNA。百分数指各路经中差异性表达的基因数相对具有GO设定的总基因数的百分数。
具体实施例方式本发明包括来自多能和多潜能干细胞 的神经细胞和心肌细胞的受控分化方法，产生所得细胞群的异质性降低。多能干细胞所分化细胞的异质性损害用于治疗性应用的细胞制品的质量和纯度，且可能危及受体对象。如以下实施例所示，建立表达内细胞团(ICM)和多能性的克隆ESC亚细胞系，观察到某些克隆亚细胞系显示随着时间稳定的不同分化潜能。例如，建立各种克隆多能干细胞系，其显示优选分化成外胚层(例如神经元)、内胚层(例如肝细胞)、或中胚层(例如肌肉细胞或心肌细胞)细胞谱系。诱导多能干细胞(iPS)或ESC可用于生成显示分化潜能改变的克隆多能干细胞系，iPS包括目前可用的iPS细胞和/或将来可发育的iPS。因此，本发明部分提供产生异质性降低并因而治疗潜能更大且副作用可能降低的细胞克隆群的方法。在各种实施方式中，通过本文所述方法生成的衍生自克隆多能细胞系的细胞可用于测试化合物的药理学或毒理学评价。A.多能和多潜能细胞本发明考虑了提供来自多能或多潜能细胞的细胞克隆群的方法。本方法考虑使用任何多能或多潜能细胞。下文讨论多能干细胞和多潜能干细胞的非限制性示例。I.哺乳动物胚胎干细胞哺乳动物胚胎干(ES)细胞是衍生自囊胚内部细胞团的多能细胞。通过移除发育中胚胎的滋养外胚层，然后将内部细胞团在非生长细胞的饲养层上培养，可分离ES细胞。合适条件下，产生增殖、未分化ES细胞的集落。所述集落可移出、解离成单独细胞，然后再接种于新鲜饲养层上。再接种细胞可继续增殖，生成新的未分化ES细胞集落。然后，所述新集落可移出、解离、再次重接种并允许生长。未分化ES细胞的这种“继代培养”或“传代”过程可重复数次以生成含未分化ES细胞的细胞系(美国专利号5，843，780 ;6，200，806 ；7，029，913)。“原代细胞培养物”是直接获自组织如囊胚内部细胞团的细胞培养物。“继代培养物”是衍生自原代细胞培养物的任何培养物。熟知获得小鼠ES细胞的方法。一种方法中，来自129系小鼠的植入前囊胚用小鼠抗血清处理以去除滋养外胚层，内部细胞团在培养基内化学灭活小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养，所述培养基含有胎牛血清。产生的未分化ES细胞集落在胎牛血清存在下于小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上继代培养生成ES细胞群。在一些方法中，通过在含血清培养基中添加细胞因子白血病抑制因子(LIF) (Smith, 2000)，小鼠ES细胞可在没有饲养层的情况下生长。在其他方法中，小鼠ES细胞可在骨形态发生蛋白和LIF存在下于无血清培养基中生长(Ying等，2003)。人ES细胞可用前述方法获自囊胚(Thomson等，1995 !Thomson等，1998 !Thomson和Marshall, 1998 ；Reubinoff等,2000)。一种方法中，将第5天的人囊胚接触兔抗人脾细胞抗血清，然后接触1:5稀释的豚鼠补体以裂解滋养外胚层细胞。从完整内部细胞团中移出经裂解滋养外胚层细胞后，所述内部细胞团在胎牛血清存在下于Y灭活小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上培养。9-15天后，获自内部细胞团的细胞团块可化学(即接触胰蛋白酶)或机械解离并再接种于含胎牛血清和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的新鲜培养基中。进一步增殖后，通过微量移液选择具有未分化形态的集落，机械分离成团块并再接种(参见美国专利号6，833，269)。ES样形态的表征为有明显高的核质比与显著核仁的密集集落。所得ES细胞可通过短暂胰蛋白酶消化或通过微量移液选择个体集落来常规传代。一些方法中，通过在碱性成纤维生长因子存在下于成纤维细胞饲养层上培养ES细胞，人ES细胞可无血清生长(Amit等，2000)。其他方法中，通过在含碱性成纤维生长因子的“条件”培养基存在下于蛋白基质如基质胶(Matrigel)或层连蛋白上培养细胞，人ES细胞可以无饲养细胞层生长(Xu等，2001)。先前通过与成纤维细胞共培养形成条件培养基。分离恒河猴和普通狨猴ES细胞的方法也已知(Thomson和Marshall, 1998;Thomson 等,1995;Thomson 和 Odorico, 2000)。另一 ES细胞来源是建立的ES细胞系。已知各种小鼠细胞系和人ES细胞并明确其生长和增殖条件。例如，小鼠CGR8细胞系从小鼠129系胚胎的内部细胞团建立，CGR8细胞培养物可在LIF存在下不需饲养层而生长。作为另一示例，人ES细胞系HI、H7、H9、H13 和H14由Thompson等建立。另外，开发了 H9细胞系的亚克隆H9. I和H9. 2。预期几乎所有本领域已知的ES或干细胞系都可用于本发明，如Yu和Thompson所述(2008),其通过引用纳入本文。可从对象建立其它iPS细胞以产生可治疗性给回病人的细胞。因此，iPS细胞可用于个体化医疗。与本发明联用的ES细胞源可以是囊胚，培养囊胚内部细胞团所得细胞，或已建立细胞系培养物所得细胞。因此，本文所用的术语“ES细胞”可指囊胚内部细胞团细胞，内部细胞团培养物所得ES细胞，ES细胞系培养物所得ES细胞。多能细胞能分化成任何机体细胞。以各种方式测定了 ES细胞的多能性(Martin，1982)。一个试验中，将囊胚内部细胞团衍生的小鼠ES细胞注入另一囊胚腔。所注入囊胚沉积于假孕雌性小鼠子宫中，产生的后代是注入和受体囊胚细胞的嵌合体。另一试验中,将小鼠ES细胞注入成年小鼠产生称为畸胎瘤的肿瘤。这种肿瘤可包含衍生自内胚层、中胚层和外胚层的多种细胞类型。在某些实施方式中，可根据本发明将一种或多种畸胎瘤衍生细胞培养或分化成神经或神经定向细胞。还可通过形成免疫缺陷小鼠中的畸胎瘤来测试人ES细胞的多能性。第三种试验是改变培养条件以允许ES细胞分化成更专门的细胞。例如，通过移出饲养层和添加LIF到培养基，小鼠ES细胞可自发分化成各种细胞类型。类似地，通过移出饲养层和在非粘附表面上悬浮培养ES细胞，人ES细胞可自发分化(Itskovitz-Eldor 等,2000; Reubinoff 等,2000; Roach 等,1993)。这些条件下，ES 细胞形成称为拟胚体的细胞聚集物，其包含具有神经元和心肌细胞特征的细胞。所有这些试验中，ES细胞的多能性通过其产生内胚层、中胚层和外胚层起源细胞的能力来显示。ES细胞可通过其产生的蛋白来鉴定。例如，下列标记蛋白已用于鉴定ES细胞阶段特异性胚胎抗原SSEA-I，阶段特异性胚胎抗原SSEA-3，阶段特异性胚胎抗原SSEA-4，肿瘤排斥抗原1-60 (TRA1-60)，肿瘤排斥抗原1-81(TRA1-81)，碱性磷酸酶(AP)和转录因子Oct-4。如表I所示，小鼠、人和灵长类动物细胞的差异在于这些标记物表达模式。例如，SSEA-I在小鼠ES细胞中表达，但在人或猴ES细胞中不表达，而TRA1-60在人和猴ES细胞中表达，但在小鼠ES细胞中不表达。表I. ES细胞标记物表达
标记物小鼠人猴
SSEA-I I^^
权利要求
1.一种生成细胞克隆群的方法，所述方法包括 a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞在体外扩增并维持于未分化或基本未分化状态； b)将所述群中的个体细胞扩增成细胞克隆群；和 c)选择一个或多个细胞克隆群，所选细胞克隆群确定能分化成对任一神经细胞、肝细胞、或心肌细胞至少约50%同质的群体。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述选定的细胞克隆群显示心原性分化潜能。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约65%心肌细胞。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约75%心肌细胞。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约90%心肌细胞。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是人胚胎干细胞。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述选定的细胞克隆群显示神经原性分化。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约65%神经细胞。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约75%神经细胞。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述神经细胞是多巴胺能神经元。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是人胚胎干细胞。
12.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞选自下列细胞H1、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BGOI、BG02、BG03、HSFl、HSF6、Hl、H7、H9、Hl3B 和 H14。
13.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是诱导多能细胞(iPSC)。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述iPSC选自下列细胞iPS6. I、iPS6.6、iPS、iPS 5. 6、iPS 5. 12、iPS 5. 2. 15、iPS 5. 2. 24、iPS 5. 2. 20、iPS 6. 2. I,和 iPS5/3-4. 3。
15.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括扩增所选细胞克隆群。
16.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括群确定细胞是否能分化成对任一神经细胞、肝细胞或心肌细胞至少约50%同质的群体。
17.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提供所选细胞克隆群。
18.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备用于储存或运输的选定细胞克隆群。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述制备用于储存或运输的细胞包括冷冻所述细胞。
20.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将扩增的细胞接触测试化合物并测量与所述扩增细胞内毒性相关的细胞参数。
21.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述克隆群可通过接触分化剂而分化成含有至少约50%心肌细胞的细胞群。
22.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述细胞克隆群是人细胞。
23.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多潜能或多能细胞在所述个体化前传代至少I次。
24.如权利要求I所述方法生成的多种克隆衍生心肌细胞。
25.如权利要求24所述的心肌细胞，其特征在于，所述心肌细胞包括在组织中。
26.如权利要求25所述的心肌细胞，其特征在于，所述组织包括在合适容器用具中。
27.如权利要求26所述的心肌细胞，其特征在于，所述多种克隆衍生心肌细胞组织包括在容器用具中。
28.一种组合物，所述组合物包括如权利要求I所述方法生成的多种克隆衍生心肌细胞和药学上可接受载体。
29.一种制备显示神经分化潜能提高的细胞克隆群的方法，所述方法包括步骤 a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态； b)从所述多潜能或多能细胞群个体化并扩增多个细胞； c)测试扩增自所述个体化细胞的细胞分化成神经细胞类型的能力；和 d)选择扩增细胞，所述细胞可通过接触分化剂而分化成至少约50%神经细胞。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述扩增细胞可分化成75%多巴胺能神经J Li ο
31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述多能或多潜能细胞是多能细胞。
32.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是人胚胎干细胞。
33.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞选自下列细胞H1、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BGOI、BG02、BG03、HSFl、HSF6、Hl、H7、H9、Hl3B 和 H14。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是诱导多能细胞(iPSC)。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述iPSC选自下列细胞iPS6.1、iPS6.6、iPS、iPS 5. 6、iPS 5. 12、iPS 5. 2. 15、iPS 5. 2. 24、iPS 5. 2. 20、iPS 6. 2. I 和 iPS5/3-4. 3。
36.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将神经细胞接触测试化合物并测量与所述神经细胞内毒性相关的细胞参数。
37.如权利要求I所述方法生成的多种克隆衍生神经细胞。
38.如权利要求37所述的神经细胞，其特征在于，所述神经细胞包括在组织中。
39.如权利要求38所述的神经细胞，其特征在于，所述组织包括在合适容器用具中。
40.如权利要求37所述的神经细胞，其特征在于，所述多种克隆衍生神经细胞组织包括在容器用具中。
41.一种组合物，所述组合物包括如权利要求I所述方法生成的多种克隆衍生神经细胞和药学上可接受载体。
42.一种筛选测试化合物的方法，所述方法包括 a)将多种心肌细胞、肝细胞或神经细胞接触测试化合物；和 b)测定由接触测试化合物弓I起的任何细胞表型或活性变化， 其中所述细胞通过权利要求I所述方法生成。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述表型或活性是毒性的量度。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，在多种心肌细胞或神经细胞中测量一种或多种基因的表达。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因包括至少一种选自下组的基因半胱天冬酶3、NF-kB，TNF_a、热诱导因子(HIF-1 a )、热激蛋白(Hsp)、转氨酶、Y-谷氨酰转移酶和碱性磷酸酶。
46.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述基因表达用高通量基因测序、蛋白质印迹、基因表达阵列、流式细胞术、免疫荧光、基于启动子/报道基因的试验或比色分析来测量。
47.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述测定任何表型或活性变化包括评价选自下组的参数心肌细胞收缩、细胞死亡、动作电位模式和离子渗透性。
48.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述多能或多潜能细胞是人细胞。
49.一种生成显示心原性分化潜能的细胞克隆群的方法，所述方法包括步骤 a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态； b)将所述群体的个体化细胞扩增成细胞克隆群； c)选择一种或多种细胞克隆群，所选细胞群确定为能分化成对心肌细胞至少约50%同质的群体；和 d)根据步骤(C)中观察到的扩增细胞分化成心肌细胞的能力，将所选细胞用于细胞和组织改造、药物筛选或细胞治疗。
50.一种治疗疾病的方法，所述方法包括给予对象基本同质的神经细胞群，其中生成所述神经细胞的方法包括 a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态； b)将所述群体的个体化细胞扩增成细胞克隆群； c)选择一种或多种细胞克隆群，所选细胞群确定为能分化成对神经细胞至少约50%同质的群体；和 d)提供一种或多种选定细胞群的细胞或其后代。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述神经细胞是多巴胺能神经元。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述疾病是帕金森病。
53.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述多巴胺能神经元注射入包括至少一部分黑质致密部的区域。
54.如权利要求50所述的方法，其特征在于，注射约100，000-约10，000,000个细胞。
55.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
56.一种治疗对象中心脏病的方法，所述方法包括给予对象由步骤I所述方法生成的多种克隆衍生心肌细胞，其中心脏病得以治疗。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述对象鉴定为患缺血性心脏病的对象。
58.如权利要求56所述的方法，其特征在于，包括静脉内、动脉内或心肌内给予所述心肌细胞。
59.如权利要求56所述的方法，其特征在于，还包括进行用于治疗心脏病的一种或多种辅助治疗形式。
60.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述对象的心脏功能得以改善。
全文摘要
公开了生成细胞克隆群的方法，所述方法包括a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞在体外扩增并维持于未分化或基本未分化状态；b)将所述克隆群中的个体细胞扩增成细胞克隆群；和c)选择一个或多个细胞克隆群，所选细胞克隆群确定能分化成对任一神经细胞类型、肝细胞、或心肌细胞至少约50%同质的群体。还公开了由本发明方法生成的细胞克隆群，和治疗对象中疾病的方法，所述方法包括将本发明的克隆细胞给予对象。还列出筛选测试化合物的方法，所述方法包括将测试化合物接触本发明方法生成的细胞克隆群。
文档编号C12N5/079GK102741397SQ201080062827
公开日2012年10月17日 申请日期2010年12月1日 优先权日2009年12月2日
发明者K·克劳斯, O·普雷纳特-西奥弗 申请人:研究发展基金会