专利名称：Imp-3寡肽及包含它们的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗极为有用的新寡肽，以及用于治疗和预防肿瘤的药物。优先权本申请要求2009年12月I日提交的美国临时申请No. 61/265，657和2010年8月6日提交美国临时申请No. 61/371，434的权益 ，通过述及将其全部内容收入本文。
背景技术：
已经证明，⑶8阳性CTL可识别主要组织相容性复合物(MHC) I类分子上出现的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从TAA的第一个例子一黑素瘤抗原(MAGE)家族被发现起，人们主要通过免疫学手段(NPL l:Boon T，Int J Cancer
1993May 8，54 (2) : 177-80; NPL 2:Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996MarI, 183(3) :725-9)已经发现了许多其它TAA。这些TAA中的一些目前正在作为免疫治疗靶标接受临床开发。能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定保证了针对各种类型癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发，临床考察正在进行(NPL 3, HarrisCC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20) : 1442-55; NPL 4, Butterfield LH etal., Cancer Res 1999 Jul 1，59 (13):3134-42;NPL 5,Vissers JL et al., CancerRes 1999 Nov 1，59 (21) : 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al. , J Immunol1996 May 1，156 (9) : 3308-14; NPL 7, Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct15, 57(20):4465-8;NPL 8，Fujie T et al. , Int J Cancer 1999Jan 18,80(2):169-72;NPL9, Kikuchi M et al. ,Int J Cancer 1999 May 5，81 (3):459-66;NPL 10，Oiso M etal. , Int J Cancer 1999 May 5，81 (3) : 387-94)。迄今为止，已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生的肽进行临床试验的报告。不幸的是，迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到较低的客观应答率(NPL Il1Belli F et al.，J Clin Oncol 2002 Oct15, 20(20):4169-80;NPL 12，Coulie PG et al. , Immunol Rev 2002 Oct, 188:33-42;NPL13，Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep, 10 (9) : 909-15)。因此，仍然需要鉴定能作为免疫治疗靶的新TAA。为此目的，通过用含有23040种基因的全基因组cDNA微阵列进行的表达谱分析，鉴定了 MP_3(胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3)为在肺癌和食道癌中上调的基因(NPL 14, T. Kikuchi et al. , Oncogene. 2003Apr 10;22(14):2192-205, PTL
1,W02004/031413, PTL 2, W02007/013665, PTL 3，TO2007/013671)。已经观察到頂P_3 在高于90%的癌症患者的肿瘤细胞中的表达特异性地上调，但在除睾丸和胎盘外的其他正常生命器官中不表达。此外，已经显示在表达MP-3的癌细胞系中利用RNA干扰法下调MP-3表达可遏制细胞生长。在先申请W02006/090810描述了自MP_3(又称K0C1)衍生的肽具有针对外源表达KOCl (IMP-3)和HLA-A24的肿瘤细胞的特异性的CTL诱导活性。虽然这些肽适用于HLA-A24型的患者，仍需要用于其他HLA型患者的CTL诱导肽。弓丨用表专利文献[PTL 1]W02004/031413[PTL 2]W02007/013665[PTL 3]W02007/013671[PTL 4]W02006/090810非专利文献
[NPL I]Boon T,Int J Cancer 1993 May 8, 54(2) :177-80[NPL 2]Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar I,183 (3):725-9[NPL 3]Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20):1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999 Jul I,59(13):3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999 Nov I, 59(21) :5554-9[NPL 6]van der Burg SH et al. , J Immunol 1996 May I, 156(9):3308-14[NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct 15, 57 (20):4465-8[NPL 8]Fujie T et al. , Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) :169-72[NPL 9]Kikuchi M et al. , Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :459-66[NPL 10]Oiso M et al. , Int J Cancer 1999 May 5,81 (3) :387-94[NPL IlJBelli F et al. , J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20):4169-80[NPL 12]Coulie PG et al. , Immunol Rev 2002 Oct, 188:33-42[NPL 13]Rosenberg SA et al. , Nat Med 2004 Sep, 10(9):909-15[NPL 14]T.Kikuchi et al. , Oncogene. 2003 Apr 10;22 (14):2192-20
发明内容
本发明部分地基于新的免疫治疗靶标的发现。由于TAA通常被免疫系统识别为“自身”并因此往往没有天然免疫原性，合适的靶标的发现是极为重要的。意识到MP-3已经被鉴定为在癌症如肺癌和食道癌中上调，本发明以頂P-3蛋白(SEQ ID NO:22)作为进一步分析的目标，该蛋白由 GenBank Accession No. NM_006547. 2 (SEQ ID N0:21)的基因编码。具体地，选择了含有可诱发针对相应分子特异性的强度惊人的CTL应答的表位肽的MP-3基因产物来进行研究。在本发明的语境中，使用本发明的肽刺激了从健康供体获得的外周血单个核细胞(PBMC)。建立了特异性地识别用相应的肽冲激过的HLA-A2(A*0201)阳性靶细胞的CTL，并鉴定了以及能够诱导针对肿瘤细胞表面上表达的MP-3的强而特异性的免疫应答的HLA-A2(A*0201)限制性表位肽。综合起来，这些结果显示頂P_3有强免疫原性，而且它的表位是肿瘤免疫疗法的有效靶标。因此，本发明的一个目的是提供具有CTL诱导能力以及选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列的寡肽。此外，本发明涵盖修饰肽，具有SEQ ID N0:l、3、5或6的氨基酸序列，其中一个、两个或数个氨基酸通过选自替换、缺失、插入和添加的至少一种突变方式而被突变或改变，只要所得的修饰寡肽保留原始肽的CTL诱导能力。当被施用于受试者时，本发明的寡肽被呈递于抗原呈递细胞的表面上，从而诱导出靶向相应肽的CTL。因此，本发明的一个目的是提供呈递任何本发明肽的抗原呈递细胞及外来体，以及用于诱导与之相关的抗原呈递细胞的方法。通过施用本发明的MP-3寡肽或编码所述寡肽的多核苷酸，以及呈递此类MP-3寡肽的外来体和抗原呈递细胞，诱导出抗肿瘤免疫应答。因此，本发明的另一个目的是提供含有所述寡肽或编码它们的多核苷酸、以及相关的外来体和抗原呈递细胞作为其活性成分的药剂或药物组合物。本发明的药剂或药物组合物尤其可以用作疫苗。本发明的另一个目的是提供用于选自治疗、预防(即防范)癌症(肿瘤)，以及防范它们的手术后复发中的至少一种目的的方法，以及用于诱导CTL的方法、用于诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括对受试者施用本发明的MP-3寡肽、编码MP-3寡肽的多核苷酸、呈递MP-3多肽的外来体或抗原呈递细胞，或药剂或药物组合物的步骤。此外，本发明的CTL还可以用作抗癌症疫苗。目标癌症的例子包括，但不限于，肺癌和食道癌。更具体地说，本发明提供了下述
[I], 一种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列，[2], 一种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID NO: 1、3、5和6的氨基酸序列，其中替换、缺失、插入和/或添加了 I个、2个或数个氨基酸，且其中所述寡肽具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力，[3], [2]的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者(a)从N端起的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和(b) C端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸，[4],分离的多核苷酸，其编码[1]_[3]中任一项的肽，[5],通过使用如[1]_[3]中任一项所述的寡肽来诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞的方法，[6], [5的方法，其中所述方法包括选自下组的步骤(a)使抗原呈递细胞与[1]_[3]中任一项的寡肽接触，和(b)将编码[1]_[3]中任一项的寡肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞，[7], [5]或[6]的方法，其中所述抗原呈递细胞在其表面上表达至少一种HLA-A2抗原，[8],通过使用如[1]_[3]中任一项所述的寡肽来诱导CTL的方法，[9], [8]的方法，其中所述方法包括选自下组的步骤(a)使⑶8-阳性T细胞接触在其表面上呈递[1]-[3]中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的抗原呈递细胞和/或外来体；和(b)向⑶8-阳性T细胞中导入编码能够形成T细胞受体(TCR)亚单位的多肽的多核苷酸，所述亚单位结合抗原呈递细胞表面上的[1]_[3]中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物，[10]. [9]的方法，其中所述HLA抗原为HLA-A2，[11], 一种分离的CTL，其靶向[1]_[3]中任一项的寡肽，[12]. [11]的CTL，其中所述CTL能够结合细胞表面上[1]-[3]中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物，[13]. [12]的 CTL，其中所述 HLA 抗原为 HLA-A2，
[14].分离的CTL，其是通过使用[1]_[3]中任一项的寡肽诱导的，[15], [14]的CTL，其中所述CTL是通过[8_10中任一项的方法诱导的，[16]. —种分离的抗原呈递细胞，该细胞在其表面呈递HLA抗原与[1]-[3]中任一项的寡肽的复合物，[17]. [16]的抗原呈递细胞，其中所述HLA抗原是HLA-A2，[18], [16]或17的抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞是通过[5]_[7]中任一项的方法诱导的，[19]. 一种在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法,包括对所述受试者施用疫苗的步骤，所述疫苗包含选自下组的至少一种活性成分
(a) 一种或多种[1]_[3]中任一项所述的寡肽，或其免疫学活性片段；(b) 一种或多种编码[1]_[3]中任一项所述的寡肽或其免疫学活性片段的多核苷酸；(c) 一种或多种[II]-[15]中任一项的分离的CTL ；(d) 一种或多种[16]或[18]的分离的抗原呈递细胞，[20], [19]的方法，其中所述受试者是HLA-A2阳性的，[21]. —种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药剂，其中该药剂包含可药用担载体以及选自下组的至少一种活性成分(a) 一种或多种[1]_[3]中任一项所述的寡肽，或其免疫学活性片段；(b) 一种或多种编码[1]_[3]中任一项所述的寡肽或其免疫学活性片段的多核苷酸；(c) 一种或多种在其表面上呈递[1]_[3]中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的抗原呈递细胞；(d) 一种或多种能够结合细胞表面上[1]_[3]中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的CTL，[22]. —种用于诱导CTL的药剂，其中该药剂包含可药用担载体以及选自下组的至少一种活性成分(a) 一种或多种[1]_[3]中任一项所述的寡肽，或其免疫学活性片段；(b) 一种或多种编码[1]_[3]中任一项所述的寡肽或其免疫学活性片段的多核苷酸；(c) —种或多种在其表面上呈递[1]_[3]中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的抗原呈递细胞，[23]. [21]或[22]的药剂，其中所述药剂配制为用于对HLA-A2阳性的受试者施用，[24]. [21]-[23]中任一项的药剂，其是疫苗，[25] 选自下组的活性成分(a) 一种或多种[I]_[3]中任一项所述的寡肽；(b) 一种或多种处于可表达形式的编码[1]_[3]中任一项所述的寡肽的多核苷酸；(c) —种或多种在其表面上呈递[1]_[3]中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的抗原呈递细胞；(d) 一种或多种能够结合细胞表面上[1]_[3]中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的CTL在制备用于治疗癌症的药物组合物或药剂中的用途，[26]. [25]的用途，其中所述药物组合物或药剂配制为用于对HLA-A2阳性的受试者施用，[27]. —种包含选自SEQ ID NO: 1、3、 5和6的氨基酸序列的分离的寡肽，其用于在HLA-A2阳性的受试者中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发，[28]. —种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列，其中替换、缺失、插入和/或添加了 I个、2个或数个氨基酸，且其中所述寡肽具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力，用于在HLA-A2阳性的受试者中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发，[29], [28]的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者(a)从N端起的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和(b) C端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。除了上述之外，在联系附图
和实施例阅读下面的详细说明时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，前面的发明概要和后面的详细说明都仅仅提出了示例性的实施方案，并不对本发明或本发明的其它可替换实施方案构成限制。尤其是，虽然在本文中就若干具体的实施方案对本发明进行了说明，应当理解这些描述对本发明而言是示例说明性的，不解释成对本发明的限制。在不背离如随附的权利要求所描述的本发明的精神和范围的前提下本领域技术人员将容易地想到本发明的多种修改和应用。类似地，本发明的其它目的、特征、好处和优势是从此处的概要和下文描述的特定实施方案可以容易地想到的，并且是本领域技术人员可以显见的。根据上文的内容并结合随附的实施例、数据、附图以及从中能够合理推断的内容，或者进一步考虑本文中引用的参考文献，这样的目的、特征、好处和优势是容易想到的。附图简述本领域技术人员在考虑了下文的附图简要说明及对本发明及其优选实施方案的详细说明后将清楚地得知本发明的各个方面的应用。[图I]图I描述了对在HLA-A2转基因小鼠中诱导的CTL进行的IFN-YELI SPOT测定的结果。与对照相比，用肽(SEQ ID N0:3，5和6)刺激的CTL显示了强的IFN-Y产生应答(上部小图)。误差棒代表标准偏差(SD)。统计学显著的差异用星号表示(*P〈0. 05)。还显示了三复孔的ELISP0T计数的示例性照片(下部小图)。CTL响应于用SEQ ID NO:6的肽冲激的BM-DC显示了 203-226个点/孔(左侧小图)，而它们在没有负载肽的BM-DC的存在下显示74-105个点/孔(右侧小图)。[图2]图2由一系列描绘对健康供体I的人CTL进行的IFN-y EU SPOT测定结果的条形图组成。用SEQ ID NO: 1、3、5、和6的肽刺激的人CTL针对用关联肽冲激的T2细胞与用无关的HIV肽冲激的T2细胞相比显示了强的IFN-Y产生应答(P〈0. 05)。误差棒表示SD0[图3]图3由一系列分布图⑷和线图⑶组成，描绘了从HLA-A2阳性肺癌患者和健康供体的⑶8+T细胞诱导MP-3特异性人CTL的情况。(A)部分呈现通过FACS (荧光活化细胞分选机)分析来检测用SEQ ID NO: 1、3或6的肽刺激后的健康供体I或肺癌患者I的人CTL的细胞表面上⑶107a的表达的结果。将用肽刺激的CTL用FITC(异硫氰酸萤光素)缀合的抗CD107a抗体(上部小图)或作为对照的FITC缀合的抗小鼠IgGl (中间小图)染色。作为刺激的阴性对照，用HIV肽刺激CTL并用FITC缀合的抗CD107a抗体染色(下部小图)。当用SEQ ID NO: 1、3或6的肽刺激CTL时，与对照相比，在CTL上检测到了⑶107a的表达。(B)部分描绘了 MP-3特异性CTL针对用关联的MP-3衍生肽冲激的T2细胞的细胞毒性。51Cr释放测定中CTL针对用SEQ ID NO: I的肽(空心三角，左部和中部小图)或用SEQ ID NO:6的肽(空心三角，右部小图)冲激的T2细胞，以及用无关的HIV-A2肽(实心三角)冲激的T2细胞的细胞毒性。每个值代表基于一式三份重复测定的平均值计算的特异性裂解百分比。[图4]图4由一系列条形图(A)和线图⑶组成，描绘从三名肺癌患者的PBMC诱导MP-3特异性CTL的情况。(A)部分描绘了从患者14的PBMC通过用SEQ ID NO: 5的肽刺激的CTL、以及从患者103的PBMC用SEQ ID NO:6的肽刺激而诱导的CTL针对用关联肽冲激的T2细胞相比于用无关HIV肽冲激的T2细胞显示了显著的IFN-Y产生。统计学上显著的差异用星号表示(*P〈0. 05)。误差棒表示SD。(B)部分描绘，用SEQ ID NO:3的肽从肺癌患者4的PBMC诱导的CTL针对用关联肽冲激的T2细胞相比于无关HIV肽冲激的T2细胞显示了细胞毒活性。[图5A-C]图5由一系列线图组成，描绘了使用CTL和内源表达IMP-3的肿瘤细胞系的51Cr释放测定的结果。(A)部分呈现了从健康供体2的PBMC通过使用SEQ ID NO: I、
3、5和6的肽刺激而诱导的CTL的细胞毒活性。这些CTL针对PANC-I (IMP-3+，HLA-A2+)显示了细胞毒活性，但针对MCF7 (MP-3-，HLA-A2+)和A549 (IMP-3+, HLA-A20不显示细胞毒活性。(B)部分呈现对于从肺癌患者14的PBMC通过用SEQ ID NO: 3和5的肽刺激而诱导的CTL、以及从患者4的PBMC通过用SEQ ID NO:6的肽刺激而诱导的CTL，通过51Cr释放测定检测到了细胞毒活性。这些CTL针对PANC-I (IMP-3+，HLA-A2+)显示了细胞毒活性，但针对MCF7 (MP-3-，HLA-A2+)和A549 (IMP-3+, HLA-A20不显示细胞毒活性。(C)部分呈现了通过51Cr释放测定分析的MP-3特异性CTL针对MCF7/MP3 (空心圆圈，頂P-3基因转染的MCF7细胞)或MCF7细胞(实心圆圈)的细胞毒活性。[图5D]⑶部分呈现了通过51Cr释放测定分析的MP-3特异性CTL针对SW620(空心三角)、SKH印I (空心菱形)、MCF7 (实心三角)或A549 (实心菱形)的细胞毒活性。从健康供体通过用SEQ ID NO: I的肽或SEQ ID NO:6的肽刺激而产生的CTL系针对SW620、31(拖？1显示了细胞毒活性，但针对4549 011^42-，IMP-3+)或MCF7细胞(HLA-A2+，IMPSl贝丨J不然。[图6A-B]图6由一系列条形图(A、B、D)和线图(C)组成，描绘了抗-HLAI类单抗(W6/32，IgG2a)或抗-HLA-A2单抗对CTL应答的抑制。通过IFN- y EU SPOT测定检测了从肺癌患者14的PBMC通过用SEQ ID NO: 1、3、5和6的肽刺激而诱导的CTL活性(A)。由CTL介导的IFN- y产生被W6/32显著抑制，而用抗-HLA-DR单抗处理未检出IFN- y产生的抑制(H-DR-1，IgG2a)。误差棒表示SD。统计学上显著的差异用星号表示(*P〈0. 05)。标示了由CTL介导的IFN-Y产生⑶和细胞毒性(C和D)。空心圆圈，PANCl ;实心圆圈，、PANC1+W6/32 ;方形，PANCl+对照单抗。条形表示当生成的CTL系与PANCl (空心条形)、PANCl+对照单抗(空心条形)或PANCl+封闭单抗(实心条形)共温育时的IFN- y生成(B)或细胞毒性(D)。显示了来自结果相似的两次独立实验的代表性数据。(B)中统计学显著的差异用星号标示。
[图6C-D]图6C-D是图6A-B的继续。实施方案的描述现在描述优选的方法、装置、和材料，不过在实施或检验本发明的实施方案时可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本发明材料和方法之前，要理解本发明不限于特定大小、性状、尺度、材料、方法学、方案等，因为它们可因循例行实验和优化而变化。还要理解，所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。通过提述明确地将本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开文本完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开文本。如果有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅为举例说明而不构成限制。I.定义如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非
另有明确说明。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在型残基(诸如相应的天然存在型氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在型氨基酸聚合物。本说明书中有时使用的术语“寡肽”用于指长度为20个残基或更少，典型地为15个残基或更少的本发明的肽，通常由约8个-约11个残基，经常为9个或10个残基组成。在本说明书全文中，术语“肽”以与术语“寡肽”相同的意义使用，除非另有特别指明。如本文中使用的，术语“氨基酸”指天然存在型和合成型氨基酸，以及具有与天然存在型氨基酸相似的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在型氨基酸指由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和0-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学结构(a碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过它们公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指称。术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中除非另有明确说明可互换使用，而且与氨基酸类似地通过它们普遍接受的单字母代码来指称。术语“(作用)剂”和“组合物”在本文中可以互换使用，指包含规定量的规定成分的产品，以及通过所述规定量的规定成分的组合直接或间接得到的任何产品。这些术语结合修饰词“药物”或“药”(pharmaceutical)意在涵盖包括活性成分以及任何组成担载体的惰性成分的产品，以及通过所述任何两种或更多种成分的组合、复合或聚集，或通过一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用而直接或间接得到的任何产品。相应地，在本发明的语境中，术语“药剂”或“药物组合物”可互换地用于指任何通过混合本发明的产品与药学或生理学上可接受的担载体而制备的作用剂、物质或组合物。本文中所用的短语“药学上可接受的担载体”或“生理学上可接受的担载体”意思是药学上或生理学上可接受的材料、组合物、物质或媒介，包括但不限于担载或运输主题的支架药效团从一个器官或身体部分到另一个器官或身体部分所涉及的液体或固体填充剂、赋形剂、溶剂或包埋材料。本发明的药剂或药物组合物具体可用作疫苗。在本发明的语境中，短语“疫苗”(又称“免疫原性组合物”)是指在接种到动物中时具有诱导抗肿瘤免疫的功能的物质。术语“活性成分”在本文中意指作用剂或组合物中具有生物学活性或生理学活性的物质。尤其是，在药剂或药物组合物中，“活性成分”是指显示客观的药理学效果的物质。例如，在用于治疗或预防癌症的药剂或药物组合物的场合，作用剂或组合物中的活性成分可直接或间接地导致对于癌细胞的至少一种生物学或生理学作用。优选地，这样的作用包括减少或抑制癌细胞生长、破坏或杀死癌细胞和/或癌组织，等等。典型地，活性成分的间 接效果是诱导可识别或杀死癌细胞的CTL。在配制之前，“活性成分”又称“原料药” (bulk)、“药物物质” (drug substance)或“技术产品” (technical product)。除非另有定义，术语“癌症”指过表达MP-3基因的癌症，过表达MP-3的癌症的实例包括但不限于肺癌和食道癌。除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，指能够识别非自身细胞(例如肿瘤细胞、病毒感染的细胞)并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。除非另有定义，如本文中所用的术语“试剂盒”是指试剂及其他材料的组合。考虑术语“试剂盒”可包括微阵列、芯片、标记物、等等。术语“试剂盒”不意图限于某种特定的试剂和/或材料组合。如本文中使用的，在受试者或者患者的语境中，短语“HLA-A2阳性”是指受试者或患者纯合地或者杂合地拥有HLA-A2抗原基因,且HLA-A2抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。以本发明的方法和组合物在“治疗”癌症的语境中有用为限，如果治疗导致临床上的收益，例如受试者体内IMP-3基因表达的减少、或者癌症的尺寸、普遍性(prevalence)或转移潜力的降低，则认为治疗是“有效的”。当预防性地进行治疗时，“有效的”意思是其阻碍或阻止癌症的形成，或者阻止或减轻癌症的临床症状。“有效性”结合用于诊断或治疗特定癌症种类的任何已知方法来确定。以本发明的方法和组合物可用于癌症的“预防”和“防范”的语境为限，此类术语在本文中可互换使用，指降低缘于疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病的进展与症状的出现、以及通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来降低已建立的疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范可包括旨在减轻特定病症的严重性(例如降低肿瘤的增殖和转移等)的广泛的预防性疗法。
在本发明的语境中，治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和阻抑癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防，包括10%、20%、30%或更多降低，或实现病情稳定。如本文中使用的，术语“抗体”意图包括可以与指定的蛋白或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长源化(primatized)抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、与其它蛋白或放射性标记物融合的抗体、和抗体片段。另外，在本文中，抗体以最广义使用，具体涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。“抗体”指示所有类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。II. At 为了证明来源于MP-3的肽发挥被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别的抗原的功能，对来源于頂P_3(SEQ ID N0:22)的肽进行了分析以确定它们是否为HLA-A2 (例如A*0201和A*0206)限制性的抗原表位，HLA-A2是经常遇到的HLA等位基因(Date Y et al. , Tissue Antigens 47:93-101，1996;Kondo A et al. , J Immunol155:4307-12, 1995; Kubo RT et al. , J Immunol 152:3913-24,1994)。基于它们对 HLA-A2的结合亲和力，鉴定了来源于MP-3的HLA-A2结合肽的候选者。用加载了这些肽的树突细胞(DC)体外刺激T细胞后，使用每个肽，尤其是SEQ ID勵:1、3、5和6，成功地建立了(11。这些建立的CTL针对经相应肽冲激的靶细胞，以及表达HLA_A*0201和MP_3的细胞显示强且特异性的CTL活性。本文中的这些结果证明MP-3是被CTL识别的抗原，且这些肽可能是頂P-3的受HLA-A2 (如A*0201和A*0206)限制的表位肽。由于IMP-3基因在大多数癌症组织(例如肺癌和食道癌)中过表达，它是良好的免疫治疗靶标。因此，本发明提供对应于IMP-3的被CTL识别的表位的寡肽，诸如九肽(由九个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由十个氨基酸残基组成的肽)。本发明的寡肽的特别优选的例子包括那些具有选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列的肽。一般而言，目前可以通过互联网访问的软件程序,如Parker KC et al. , J Immunol
1994Jan 1，152 (I) : 163-75等中描述的那些，可以用来在计算机上计算不同肽与HLA抗原之间的结合亲和力。与HLA抗原的结合亲和力可以按照例如Parker KC et al. , J Immunol1994Jan 1，152 (I) : 163-75 和 Kuzushima K et al. , Blood 2001，98 (6) : 1872-81 中描述的那样进行测定。用于测定结合亲和力的方法在例如Journal of Immunological Methods,
1995,185:181-190. ;Protein Science, 2000，9:1838-1846 中有描述。因此，本发明涵盖通过这些已知程序被确定为可与HLA抗原结合的MP-3的肽。此外，本发明的这些寡肽的侧翼可以具有额外的氨基酸残基，只要所述肽保持其CTL诱导能力即可。这样的具有CTL诱导能力的肽典型地少于约40个氨基酸，经常少于约20个氨基酸，通常少于约15个氨基酸。本发明的寡肽(例如由选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列组成的寡肽)的侧翼的氨基酸序列没有限制，可以由任何种类的氨基酸构成，只要其不损害原来的肽的CTL诱导能力。因此，本发明还提供具有CTL诱导能力和选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列的肽。一般而言，蛋白质中一个、两个、或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能，或者在有些情况下甚至会增强原蛋白质的期望功能。事实上，已知有经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中修饰(即替换、缺失、添加和/或插入)一个、两个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1984, 81:5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500;Dalbadie-McFarland et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的寡肽可既具有CTL诱导能力，又具有选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列中添加、插入、缺失、和/或替换一个、两个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列。
本领域技术人员认可，改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别添加或替换往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此，它们常规上称作“保守替换”或“保守修饰”，其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似的性质和功能的修饰蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R, D, N，C，E, Q, G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G，A, V，L, I, P);含羟基侧链(S，T，Y);含硫原子侧链(C, M);含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q);含碱侧链(R，K，H);和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。另外，下面的八组各自含有本领域公认互为保守替换的氨基酸I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins 1984)。此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不应排除MP-3的多态变体、种间同源物、和等位基因中的可诱导CTL的肽。为了保持所需的CTL诱导能力，可以修饰(插入、删除、添加和/或替换)少数(例如，I个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个以下的氨基酸，如3个以下。要被修饰的氨基酸的百分比优选为20%以下，更优选15%以下，进一步更优选10%以下或1-5%。当在免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选选择不仅诱导CTL而且拥有对HLA抗原的高结合亲和力的肽。为此，可通过替换、插入、缺失和/或添加氨基酸残基来对肽进行修饰，产生具有改良的结合亲和力的修饰肽。除了天然被展示的肽之外，由于已经知道通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; JImmunol 1994，155:4307)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。
例如，为了增加HLA-A24结合亲和力，理想的是将自N端起的第二个氨基酸替换为亮氨酸或甲硫氨酸，和/或将C末端氨基酸替换为缬氨酸或亮氨酸。因此，具有SEQ IDNO: 1、3、5和6的氨基酸序列，其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的自N端起的第二个氨基酸被替换为亮氨酸或甲硫氨酸和/或其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的C端被替换为缬氨酸或亮氨酸的肽涵盖在本发明之内。不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替换，而且可以在肽的潜在TCR识别位置处引入替换。数项研究已证明了肽中的氨基酸替换可等同于或好于原来，例如CAPl、p53(264_272)、Her-2/neu(369-377)或 gplOO(209_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T.K. Hoffimann et al. J Immunol. (2002) Feb I; 168 (3) : 1338-47. , S. 0. Dionne etal.Cancer Immunol immunother. (2003)52:199-206及 S. 0. Dionne et al. Cancer Tmmunology, Immunotherapy(2004)53, 307-314)。本发明还考虑向本文中公开的序列添加氨基酸。例如，还可以向本发明的肽的N 和/或C端添加一个、两个或数个氨基酸。此类具有高HLA抗原结合亲和力且保留CTL诱导能力的修饰肽也包含在本发明之内。然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能诱导副作用，诸如自身免疫性病症和/或针对特定物质的变应性症状。因此，优选的是，首先利用可用的数据库实施同源性搜索，以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比仅相差I个或2个氨基酸的肽亦不存在时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何发生此类副作用的危险。虽然预期如上所述的对HLA抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的，但还是对根据高结合亲和力的存在为指标选出的候选肽检查了 CTL诱导能力的存在。这里，短语“CTL诱导能力”指肽被呈递到抗原呈递细胞上时诱导细胞毒性淋巴细胞(CTL)的能力。另 外，“CTL诱导能力”包括肽诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL溶解靶细胞、和提高CTL IFN-y生成的能力。CTL诱导能力的确认如下来实现，诱导携带人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B-淋巴细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC))，或者更具体地说，来源于人外周血单核白细胞的DC，并且在用肽刺激后，与CD8-阳性细胞混合，然后测量由CTL针对靶细胞生成和释放的IFN-Y。作为反应系统，可使用已经制成的表达人HLA抗原的转基因动物(例如BenMohamedL, Krishnan R, Longmate J, Auge C，Low L,Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000Aug,61(8):764-79, Related Articles,Books, Linkout Induction of CTL response bya minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLAclass II restricted T(H)response中描述的那些)。例如,可以用51Cr等放射性标记革巴细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者，CTL诱导能力可以如下评估测量在携带固定化肽的抗原呈递细胞(APC)存在下由CTL生成和释放的IFN- y，并使用抗IFN-Y单克隆抗体显现培养基上的抑制区。作为如上所述检查肽的CTL诱导能力的结果，发现具有高的HLA抗原结合亲和力的肽不一定具有高的CTL诱导能力。然而，在被鉴定和评估的那些肽中，选自具有如SEQ IDNO: 1、3、5和6所示的氨基酸序列的肽的寡肽被发现不但具有对HLA抗原的高亲和力，还具有特别高的CTL诱导能力。因此，例举这些肽为本发明优选的实施方案。除上文所述修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它物质，只要所得的连接肽保留原始肽的必需的CTL诱导能力。合适物质的例子包括但不限于肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然的和合成的聚合物、等。肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋予额外的功能(例如靶向功能和投递功能)或使多肽稳定。例如，为了提高多肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如，可使用肽酶和各种生物学介质(诸如人血浆和血清)来测试稳定性(参见例如Verhoef etal. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。此外，本发明的肽可以藉由间隔物(spacers)或接头(linker)与其他的肽相 连。所述其他的肽的例子包括但不限于从其他TAA衍生的能诱导CTL的肽。或者，两个或更多个本发明的肽可以藉由接头或间隔物连接起来。这些由间隔物或接头连接起来的肽可以是彼此相同或不同的。接头或间隔物的种类没有特殊限制，包括由肽构成者，更优选的是由具有一个或多个能够被酶(如肽酶、蛋白酶和蛋白酶体等)切割的切割位点的肽构成者。接头或间隔物的例子包括但不限于AAY(P. M. Daftarian et al. , J Trans Med2007，5:26)，AAA, NKRK (R. P. M-SutmulIer et al. , J Immunol. 2000，165:7308-7315)或一个到数个赖氨酸残基(S. Ota et al. , Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al. , JImmunol. 2002, 168:5709-5715)。本发明的肽涵盖藉由间隔物或接头与其他的肽相连而成的肽。当本发明的肽包含半胱氨酸残基时，肽倾向于通过半胱氨酸残基的SH基团之间的二硫键形成二聚体。因此，本发明的肽的二聚体也包括在本发明的肽之内。本文中，本发明的肽也可以记为“MP-3肽”、“MP-3多肽”或“MP-3寡肽”。HL IMP-3 肽的制备本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，肽可以通过合成、使用重组DNA技术或化学合成来制备。本发明的肽可个别地合成，或合成为由两个或更多个肽构成的较长多肽。然后可以分离，即纯化或分离所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段或任何其它化学物质。本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。其他示例性的修饰包括掺入D-氨基酸或其他可用的氨基酸模拟物，以便例如增加肽的血清半寿期。可以根据选定的氨基酸序列，借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的常规肽合成法的例子包括但不限于(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976 ；(iii) Peptide Synthesis (日文)，Maruzen Co. , 1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文),MaruzenCo.,1985 ；(v) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol. 14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67288 ;和(vii)Barany G. & Merrifield R. B.，Peptides Vol. 2，" Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York，1980，100-118。或者，可应用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如Morrison J, J Bacteriology 1977,132:349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods inEnzymology (eds. Wu et al.) 1983，101:347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转化入合适的宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以釆用体外翻译系统在体外生产肽。IV.多核苷酸
本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。这些包括源自天然存在型MP-3/KIF20A 基因(GenBank Accession No. NM_006547. 2 (SEQ ID N0:21))的多核苷酸以及具有它们的经过保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短语“经过保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，对于任何给定蛋白质都有极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能上相同的分子。因而，每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。本领域公知，DNA由碱基诸如天然存在的A、T、C、和G合适地构成，而T在RNA中被U替换。本领域技术人员会意识到多核苷酸也会包括非天然存在的碱基。本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中它们之间有或无居间氨基酸序列存在。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。另外，多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者，可借助PCR技术或通过在合适宿主中的表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrook et al. , MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron1992，48:2223-311;Matthes et al. , EMBO J 1984，3:801-5 中记载的。含有本发明的多核苷酸的载体以及携带所述载体的宿主细胞也包含在本发明之内。V.夕卜来体(exosomes)本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合物。外来体可以通过，例如在日本专利申请公表公报平11-510507和W099/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从治疗和/或预防所针对的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。复合物中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的类型匹配。使用在日本人和白种人中高表达的HLA-A2型有利于获得有效的结果，且可以使用HLA-A2(A*0201和A*0206)等亚型。典型的，在临床上，预先考察需要治疗的患者的HLA抗原类型，这样就能够合适地选择对这种抗原具有高水平的结合亲和力、或者具有藉由抗原呈递的CTL诱导能力的肽。此外，为了获得具有高结合亲和力和CTL诱导能力二者的肽，可 以在天然存在的IMP-3部分肽的氨基酸序列的基础上进行I个、2个或数个氨基酸的替换和/或添加。当本发明的外来体使用HLA-A2(A*0201)抗原时，具有选自SEQ ID N0:l、3、5和6的序列的肽是特别有用的。VI.杭原旱递细朐(APC)本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的分离的APC。通过接触本发明的肽或导入处于可表达形式的编码本发明肽的多核苷酸而获得的APC可来源于作为治疗和/或预防对象的患者，而且可作为疫苗单独地或与其它药物(包括本发明的肽、外来体、或细胞毒性T细胞)组合来施用。APC不限于特定种类的细胞，包括树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知这些细胞可在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，以供淋巴细胞识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC，DC可以用作本发明的APC。例如，可通过自外周血单核细胞诱导DC，然后在体外、离体或在体内用本发明的肽接触(刺激)它们来获得APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。短语“诱导APC”包括用本发明的肽或编码本发明肽的核苷酸接触(刺激)细胞，以在细胞的表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物。因此，可以通过对受试者使用本发明的肽，然后从受试者收集APC本发明的APC，来获得本发明的APC。或者，可以通过使从受试者收集的APC与本发明的肽接触来获得本发明的APC。本发明的APC本身可以使用给受试者以诱导针对该受试者体内的癌症的免疫应答，例如作为疫苗。本发明的APC还可以与其他药物，包括本发明的肽、外来体或CTL组合施用。离体施用可包括下述步骤a :自第一受试者收集APC ；b 使肽接触步骤a的APC ；并c :对第二受试者施用加载了所述肽的APC。第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。或者，依照本发明，提供本发明的肽在制备用于诱导抗原呈递细胞的药剂或药物组合物中的用途。另外，本发明提供一种制备用于诱导抗原呈递细胞的药剂或药物组合物的方法或工艺，其中所述方法包括将本发明的肽与药学上可接受的担载体混合或配制的步骤。或者，本发明提供用于制备用于治疗癌症，包括肺癌和食道癌的药剂或药物组合物的方法或工艺，其中该方法包括将本发明的肽与药学上可接受的担载体混合或配制的步骤。另外，本发明还提供用于诱导抗原呈递细胞的本发明的肽。通过步骤b获得的APC可作为疫苗施用于受试者。通过步骤b获得的肽可以作为疫苗施用给受试者。本发明提供用于治疗癌症的肽，所述癌症包括肺癌和食道癌。依照本发明的一个方面，本发明的APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的CTL诱导能力”中，高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导CTL的肽接触的APC的该水平而言的。这样的具有高水平CTL诱导能力的APC可通过下述方法来制备，该方法包括在体外将含有编码本发明肽的多核苷酸的基因转移至APC的步骤。所导入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实施的各种方法，诸如可使用脂质体转染、电穿孔、和磷酸钙法。更具体的说，可以如Cancer Res
1996,56:5672-7; J Immunol 1998，161:5607-13; J Exp Med 1996, 184:465-72;国际公开文本No. 2000-509281的已
公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入APC，基因在细胞中经历转录、翻译、等等，然后得到的蛋白质被MHC I类或II类加工，并经由呈递途径呈递给本发明的肽。在一个优选的实施方案中，本发明的APC在其表面上呈递HLA抗原与包含选自SEQID NO: 1、3、5和6的氨基酸序列的寡肽的复合物。优选地，本发明的APC在其表面上表达HLA-A2抗原。换言之，本发明的APC优选在其表面上携带HLA-A2抗原。或者，将与HLA抗原形成复合物的寡肽可以是这样的寡肽，其具有选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列中替换、插入、删去和/或添加了一个、两个或者几个氨基酸残基，例如从N端起的第二个氨基酸可替换为亮氨酸或甲硫氨酸，和/或C端的氨基酸可以替换为缬氨酸或亮氨酸，而得到的氨基酸序列。VII.细胞毒件T细胞(细胞毒件T淋巴细胞CTL)被诱导的针对任何本发明肽的细胞毒性T细胞可在体内加强靶向肿瘤相关内皮的免疫应答，并且因此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本发明还提供由任何本发明肽特异性诱导或活化的、分离的细胞毒性T细胞。此类细胞毒性T细胞可通过下述步骤来获得(I)对受试者施用本发明的肽然后从该受试者收集细胞毒性T细胞，或(2)在体外用本发明的肽接触(刺激)受试者衍生的APC和CD8阳性细胞、或外周血单核白细胞，然后分离细胞毒性T细胞。可以从要进行治疗和/或预防的患者获取在来自呈递本发明肽的APC的刺激下诱导出的细胞毒性T细胞，而且可以将它们单独施用，或者与其它药物(包括本发明的肽或外来体)组合施用以调节效果。所得到的细胞毒性T细胞特异性针对呈递本发明的肽或例如与用于诱导的肽相同的肽的靶细胞起作用。换言之，细胞毒性T细胞可以通过T细胞受体来识别(即结合)靶细胞表面上的HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物，然后攻击该靶细胞以诱导该靶细胞死亡。靶细胞可以是内源表达頂P-3的细胞，或被MP-3基因转染的细胞；而且因本发明肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化CTL攻击的靶标。在优选的实施方案中，靶细胞在其表面上携带HLA-A2抗原，并在其表面上呈递、HLA-A2与本发明的肽之间形成的复合物。VIII. T 细朐等体(TCR)本发明还提供包含编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚单位的多肽的核酸序列的组合物，及使用该组合物的方法。TCR亚单位a和0具有形成TCR的能力，这些TCR赋予T细胞针对呈现MP-3的肿瘤细胞的特异性。通过使用本领域已知的方法，可分离出在用本发明的一种或多种肽诱导的CTL中表达的TCR a和0链的核酸序列，并用来构建能够介导对原代人淋巴细胞的高效率基因转移的合适载体(W02007/032255及Morganet al. , J Immunol, 171, 3288 (2003)) 例如，优选用PCR方法分析TCR。用于分析的PCR引物可以是，例如，作为5’侧引物的5’ -R引物(5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3 ')(SEQ ID NO:23)，以及作为3’侧引物的对TCR a链C区特异的3_TRa_C引物(5' -tcagctggaccacagccgcagcgt-3' ) (SEQ ID NO:24),对TCR0 链01 区特异的3_TRb_Cl引物(5' -tcagaaatcctttctcttgac-3 ' ) (SEQ ID NO:25)，或对 TCRP 链 C2 区特异的
3_TRbeta_C2 引物(5 ' -ctagcctctggaatcctttctctt-3 ' ) (SEQ ID NO:26),但不限于此。示例的载体包括，但不限于，逆转录病毒载体。有利的是，本发明提供一种即配即用型(off-the-shelf)组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。衍生的TCR能够以高亲合力展示頂P-3肽，并任选地在体内和体外介导针对呈递MP-3肽的靶细胞的高效杀伤。可以将编码TCR亚单位的核酸掺入合适的载体，例如逆转录病毒载体中。这些载体是本领域公知的。可以将所述核酸或者包含它们的载体有用地转入T细胞，例如来自患者的T细胞中。有利的是，本发明提供一种即配即用型组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。特异性的TCR是这样的受体，它能够特异性地识别本发明的肽与HLA分子的复合物，当TCR处于T细胞的表面上时给予T细胞针对靶细胞的特异性。上述复合物的特异性识别可以通过任何已知方法来确认，优选的方法包括，例如，利用HLA分子和本发明的肽的四聚体分析、以及ELISP0T测定。通过实施ELISP0T测定，可以确认在细胞表面上表达TCR的T细胞借助TCR识别细胞，且信号在细胞内被传递。也可以通过已知方法来确认上述复合物当存在于T细胞表面时能够给予T细胞以细胞毒活性。优选的方法包括，例如，测定针对HLA阳性靶细胞的细胞毒活性，例如铬释放测定。此外，本发明提供通过用编码在HLA-A2的背景下结合MP_3肽(例如SEQ IDN0:l、3、5和6)的TCR亚单位多肽的核酸转导而制备的CTL。经过转导的CTL在体内能够归巢(homing)到癌细胞,并且可以利用公知的培养方法体外扩增(例如Kawakami et al. , JImmunol.，142，3452-3461 (1989))。可以利用本发明的T细胞来形成免疫原性组合物，所述组合物可以用来在需要治疗或保护的患者中治疗或预防癌症(W02006/031221)。IX.药剂或药物组合物由于MP-3表达在数种癌症中与正常组织相比上调，本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可用于治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防它们的手术后复发。因此，本发明提供用于治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防它们的手术后复发的药剂或药物组合物，其包括一种或多种本发明肽或编码所述肽的多核苷酸作为活性成分。或者，可以在任何上述外来体或细胞诸如APC的表面上表达本发明的肽，以用作药剂或药物组合物。另外，上述靶向任何本发明的肽的细胞毒性T细胞也可用作本发明药剂或药物组合物的活性成分。在本发明的语境中，短语“靶向某个肽”，就细胞毒性T细胞的活性而言，是指细胞毒性T细胞通过其T细胞受体识别(即结合)靶细胞表面上的HLA抗原与肽之间形成的复合物，然后攻击该靶细胞以诱导该靶细胞的死亡。在另一个实施方案中，本发明还提供选自下组的活性成分在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物或药剂中的用途(a)本发明的肽， (b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，(C)本发明的 APCJP(d)本发明的细胞毒性T细胞。或者，本发明进一步提供用于治疗癌症或肿瘤的选自下组的活性成分(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，(C)本发明的 APCJP(d)本发明的细胞毒性T细胞。或者，本发明进一步提供一种制备用于治疗癌症的药物组合物或药剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受的担载体与选自下组的活性成分作为活性成分的步骤(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，(C)本发明的 APCJP(d)本发明的细胞毒性T细胞。在另一个实施方案中，本发明还提供一种制备用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物或药剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性成分与药学或生理学可接受的担载体的步骤，其中所述活性成分选自下组(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，(C)本发明的 APCJP(d)本发明的细胞毒性T细胞。或者，本发明的药物组合物或药剂可用于防范癌症或肿瘤和/或预防其手术后复发。本发明的药剂或药物组合物可用于在受试者或患者(包括人和任何其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒、和黑猩猩，特别是商业上重要的动物或驯养的动物)中治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防其手术后复发。依照本发明，已经发现具有选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列的寡肽是能诱导强且特异性的免疫应答的HLA-A2限制性表位肽。因此，包括任何这些具有SEQ IDNO: 1、3、5或6的氨基酸序列的寡肽的本发明药剂或药物组合物特别适合于对其HLA抗原为HLA-A2的受试者施用。如本文中使用的，“其HLA抗原为HLA-A2的受试者”是指纯合地或者杂合地拥有HLA-A2基因的受试者，且HLA-A2在受试者的细胞中作为HLA抗原表达。换言之，受试者为HLA-A2阳性。这同样适用于含有编码任何这些寡肽的多核苷酸的药剂或药物组合物。要用本发明的药剂或药物组合物治疗的癌症或肿瘤不受限制，包括其中涉及IMP-3的所有种类的癌症或肿瘤，包括例如肺癌或食道癌。特别是，本发明的药剂或药物组合物优选应用于胰腺癌。除上述活性成分之外，本发明的药剂 或药物组合物还可含有其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽、编码所述其它肽的其它多核苷酸、呈递所述其它肽的其它细胞等等。在本文中，其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽以癌症特异性抗原(例如已鉴定的TAA)为例，但是不限于此。如果需要，本发明的药剂或药物组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性成分，只要该物质不抑制活性成分(例如任何本发明肽)的抗肿瘤效果。例如，配制剂可包括抗炎剂或组合物、镇痛剂、化疗剂、诸如此类。除了在药物自身中包括其它治疗性物质之外，本发明的药物还可以与一种或多种其它药理学作用剂或组合物顺序或同时施用。药物和药理学作用剂或组合物的量取决于例如所使用的药理学作用剂或组合物的类型、所治疗的疾病、及施用的时序安排和路径。应当理解，除在本文中具体提及的组分之外，本发明的药剂或药物组合物可包括与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它制剂或组合物。在本发明的一个实施方案中，本发明的药剂或药物组合物可包括在制品和试剂盒中，该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病(例如癌症)的病理状况的材料。制品可包括任何本发明药剂或药物组合物的容器及标签。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该药剂或组合物用于治疗或预防一种或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。除上文描述的容器之外，包括本发明药剂或药物组合物的试剂盒还可任选进一步包括第二容器，其中装有药学可接受稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和载有使用说明的包装插页。如果期望的话，药剂或药物组合物可在药包或分配器装置中提供，该药包或分配器装置可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，药包可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽还可以作为可药用盐的形式施用。所述盐的优选实例包括与碱金属的盐、与碱土金属的盐、与有机碱的盐、与有机酸的盐、和与无机酸的盐。(I)含有肽作为活性成分的药剂或药物组合物本发明的肽可以作为药剂或药物组合物直接施用，或者如果必要，通过常规配制方法来配制。在后一种情况中，除本发明的肽之外，还可以视情况包括通常用于药物的担载体、赋形剂、等等，没有特别限制。此类担载体的例子有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液、等等。另外，药剂或药物组合物可在必要时含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等等。本发明的药剂或药物组合物可用于抗癌目的。
本发明的肽可制备成由两种或更多种本发明肽构成的组合以在体内诱导CTL。肽组合可采取鸡尾酒的形式，或者可使用标准技术彼此缀合。例如，可以将各个肽化学连接或表达成为单一融合多肽序列。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以通过从受试者分离APC (例如DC)，并用本发明的肽刺激它们，来获得在其细胞表面上展示任何本发明的肽的APC，通过将这些APC(例如DC)重新施用给受试者而在受试者体内诱导出CTL,结果,可提高针对癌细胞,诸如肺癌和食道癌细胞的攻击性。包括本发明的肽作为活性成分、用于治疗和/或预防癌症或肿瘤的药剂或药物组合物还可包括已知可有效诱导细胞免疫的佐剂。或者，所述药剂或药物组合物可以与其它活性成分一起施用，或者通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起(或顺序)施用时增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中记载的那些(Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89)。合适佐剂的例子包括但不限于磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素等等，但不限于此。
另外，可方便地使用脂质体配制剂、其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制齐U、和其中脂质结合至肽的配制剂。在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽还可以作为可药用盐的形式施用。所述盐的优选实例包括与碱金属的盐、与金属的盐、与有机碱的盐、与有机酸的盐、和与无机酸的盐。本文中所用的“可药用盐”是指保留所述化合物的生物学有效性和性质，通过与无机酸或碱(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等)反应所得到的盐。优选的盐包括与碱金属的盐、与金属的盐、与有机碱的盐、与有机酸的盐、和与无机酸的盐。在一些实施方案中，本发明的药剂或药物组合物可进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的作用剂或组合物。例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的e-和a-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL应答的另一个例子，大肠杆菌(E. coli)脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS),当与适宜的肽共价连接时,可用来引发CTL (参见例如Deres et al. , Nature1989，342:561-4)。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，及系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整，通常是0. OOlmg至IOOOmg,例如0. OOlmg至IOOOmg,例如0. Img至IOmg,而且可以每少数天施用一次至每少数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。(2)含有多核苷酸作为活性成分的药剂或药物组合物本发明的药剂或药物组合物也可含有处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中，短语“处于可表达形式的”意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中，感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的配置(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR & Capecchi MR, Cell1987,51:503-12)。参见例如 Wolff et al. , Science 1990, 247:1465-8;美国专利 No. 5，580, 859; 5, 589, 466; 5, 804, 566; 5, 739, 118; 5，736，524; 5，679，647;及 W 98/04720。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利No. 5，922，687)。本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如牛痘病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利No. 4，722，848。另一个例子是卡介苗(BCG，Bacille Calmette Guerin) qBCG载体记载于Stover et al. , Nature 1991，351:456-60。有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是容易想到的，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体、诸如此类。参见例如 Shata et al. , Mol Med Today 2000，6:66-71; Shedlock et al. , J LeukocBiol 2000,68:793-806;Hipp et al. , In Vivo 2000,14:571-85。 将多核苷酸投递入受试者可以是直接的，其中使受试者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者是间接的，其中首先在体外用感兴趣的多核苷酸转化细胞，然后将细胞移植入受试者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel et al. , Clinical Pharmacy1993, 12:488-505;Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95;Tolstoshev, Ann Rev PharmacolToxicol 1993, 33:573-96;Mulligan, Science 1993, 260:926-32;Morgan & Anderson, AnnRev Biochem 1993, 62:191-217;Trends in Biotechnology 1993，11(5):155-215。在 eds.Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,1993;及 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, StocktonPress, NY, 1990中描述的重组DNA技术领域的公知方法也可用于本发明。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，而且可使用系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当调整合适的担载体或经编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量，而且通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如
0.OOlmg至IOOOmg,例如0. Img至IOmg,而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法本发明的肽和编码此类肽的多核苷酸可用于诱导APC和CTL，以及用于针对癌症或肿瘤的免疫应答。本发明的外来体和APC也可用于诱导CTL，以及用于诱导针对癌症或肿瘤的免疫应答。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要该化合物不抑制它们的CTL诱导能力。因此，任何前文所述的本发明的药剂或药物组合物均可用于诱导CTL，而且除它们之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导APC，如下文讨论的。此外，本发明的CTL也可以用来诱导针对癌症或肿瘤的免疫应答。(I)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法本发明提供了使用本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸来诱导APC的方法。诱导APC可以如上文“VI.抗原呈递细胞”部分所述来实施。本发明还提供了用于诱导具有高水平CTL诱导能力的APC的方法，上文“VI.抗原呈递细胞”项目下也提到了其诱导。优选的是，诱导APC的方法包括选自下面的至少一个步骤a 使APC与本发明的肽接触，和b :将编码本发明的多肽的多核苷酸以可表达的形式导入APC。这样的APC诱导方法优选地以体外或离体的方式实施。为了以体外或离体方式实施所述方法，可以从受试者或者与待治疗的受试者的HLA抗原相同的其他人获得要诱导的APC0在优选的实施方案中，通过本方法诱导的APC在其表面上携带HLA-A2抗原。(2)诱导CTL的方法 本发明还提供了使用本发明的肽、编码所述肽的多核苷酸、或呈递所述肽的外来体或APC来诱导CTL的方法。本发明还提供了使用编码能形成T细胞受体(TCR)亚单位的多肽的多核苷酸来诱导CTL的方法，所述TCR亚单位识别(即结合)本发明的肽与HLA抗原的复合物。优选地，所述诱导CTL的方法包括选自下组的至少一个步骤(a)使⑶8-阳性T细胞与抗原呈递细胞和/或外来体接触，所述抗原呈递细胞和外来体在其表面上呈递HLA抗原与本发明的肽之间形成的复合物；和(b)向⑶8阳性T细胞中导入编码能够形成TCR亚单位的多肽的多核苷酸，所述TCR亚单位可识别HLA抗原与本发明的肽之间形成的复合物。当本发明的肽被施用给受试者后，受试者的身体中诱导出CTL，而且靶向肿瘤相关内皮的免疫应答的强度增强。或者，肽和编码肽的多核苷酸可用于离体治疗方法，其中在体外用本发明的肽接触(刺激)源自受试者的APC和CD8阳性细胞或外周血单核白细胞，并在诱导CTL后，将活化的CTL细胞返还给受试者。例如，该方法可包括下述步骤a:自受试者收集APC;b :用本发明的肽接触步骤a的APC ；c :将步骤b的APC与OT8+T细胞混合，并共培养以诱导CTL ;并d :自步骤c的共培养物收集OT8+T细胞。或者，依照本发明，提供了本发明的肽在制备用于诱导CTL的药物组合物中的用途。另外，本发明提供了一种制备用于诱导CTL的药剂或药物组合物的方法或工艺，其中所述方法包括将本发明的肽与药学上可接受的担载体混合或配制的步骤。另外，本发明还提供了用于诱导CTL的本发明的肽。通过步骤d获得的具有细胞毒性活性的OT8+T细胞可作为疫苗施用于受试者。上文步骤c中要与⑶呵细胞混合的APC也可通过将编码本发明肽的基因转移入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞”部分中详述的；但是不限于此。相应地，任何将本发明的肽有效呈递给T细胞的APC或外来体均可用于本发明的方法。(3)诱导免疫应答的方法本发明进一步提供用于诱导受试者中针对癌症，例如肺癌和食道癌的免疫应答的方法。所述方法包括施用本发明的疫苗，所述疫苗包括(a) 一种或多种本发明的寡肽，或其免疫学活性片段；(b) 一种或多种编码(a)的寡肽或免疫学活性片段的多核苷酸；
(c) 一种或多种本发明的CTL ；(d) —种或多种本发明的抗原呈递细胞；或(e) 一种或多种分离的经过TCR编码基因转化的T细胞。在本发明的语境中，可以用这些活性成分治疗过表达IMP-3的癌症。这样的癌症的例子包括但不限于肺癌和食道癌。因此，在施用含有所述活性成分的疫苗或药物组合物之前，优选确认要治疗的癌细胞或组织中MP-3的表达水平相比于相同器官的正常细胞是否提高。因此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗(过)表达IMP-3的癌症的方法，该方法可包括下述步骤i)测定从具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中的MP-3的表达水平；
ii)比较所述MP-3表达水平与正常对照；并iii)对具有与正常对照相比过表达MP-3的癌症的受试者施用至少一种选自上文所述(a)至⑷的成分。或者，本发明可提供包含至少一种选自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或药物组合物，其用于对具有过表达MP-3的癌症的受试者施用。换言之，本发明进一步提供了用于鉴定要用本发明MP-3多肽来治疗的受试者的方法，所述方法包括测定源自受试者的癌细胞或组织中的MP-3表达水平的步骤，其中该水平与该基因的正常对照水平相比的升高指示该受试者具有可用本发明IMP-3多肽来治疗的癌症。本发明的治疗癌症的方法将在下面更加详细的加以叙述。任何源自受试者的细胞或组织均可作为用于测定MP-3表达，只要它包括目标的MP-3转录或翻译产物。合适的样品的例子包括，但不限于，身体组织与体液，例如血液，痰，与尿液。优选地，源自受试者的细胞或组织含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，更优选癌性上皮细胞或源自怀疑为癌性的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，并将其用为源自受试者的样品。需用本方法治疗的患者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如，人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。根据本发明，测定在自受试者获得的癌细胞或组织中MP-3的表达水平。表达水平可在转录产物水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针来定量MP_3的mRNA。所述检测可在芯片或阵列上实施。对检测MP-3的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用MP-3的序列信息制备上述探针。举例而言，MP-3的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，所述标记物例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生了杂交的标签的强度检测。进一步，頂P-3的转录产物(SEQ ID N0:21)可通过基于扩增的检测方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因的可用的序列信息来制备。具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件与低严格条件下与IMP-3的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长序列与较短序列相比在较高温度观察到特异杂交。一般地，严格条件的温度应选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的熔点(Tm)低大约5° C。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50%的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50%的探针被占据。典型地,严格条件是这样的其中盐浓度小于大约I. OM钠离子，典型地大约0. 01-1. OM钠离子(或其它盐)，pH7. 0-8. 3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30° C，用于较长的探针或引物是至少大约60° C。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。探针或引物可具有特定的大小。大小的 范围可为至少10个核苷酸，至少12个核苷酸，至少15个核苷酸，至少20个核苷酸，至少25个核苷酸，至少30个核苷酸，且探针和引物的大小范围可为5-10个核苷酸，10-15个核苷酸，15-20个核苷酸，20-25个核苷酸，和25-30个核苷酸。或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定IMP-3蛋白(SEQID NO:22)的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段或经修饰抗体保留对IMP-3蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。作为另一种基于MP-3的翻译产物检测其基因的表达水平的方法，可利用针对IMP-3蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。意即，在这种测量中，强染色表明所述蛋白质存在/水平增加，且同时表明MP-3基因的高表达水平。对于癌细胞中的靶基因(例如MP-3基因)，如果其较之靶基因的对照水平(例如正常细胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的话，或增加到超过I. I倍，超过I. 5倍，超过2. 0倍，超过5. 0倍，超过10倍或者更多，则可以认为其在癌细胞中的表达水平增加了。对照水平可以与癌细胞同时确定，使用先前从疾病状态(患癌或未患癌)已知的受试者收集和保存的样品。另外，自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞可用作正常对照。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的MP-3基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中IMP-3基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的样品的组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中MP-3基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S. D.或平均值+/-3S. D.的范围可以用作标准值。在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌对照水平”。测试生物样品的表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸(例如管家基因)的表达水平加以标准化。示例的对照基因包括，但不仅限于，P -肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl。当MP-3基因的表达水平相比正常表达水平有所提高，或与癌性对照水平相似/等同，则受试者可诊断为具有要治疗的癌症。更具体地，本发明提供了一种⑴诊断受试者是否具有要治疗的癌症，和/或(ii)选择受试者进行癌症治疗的方法，该方法包括下述步骤a)测定MP-3在自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的生物样品中的表达水平；b)将MP-3的表达水平与正常对照水平比较； c)若MP-3的表达水平与正常对照水平相比升高的话，将受试者诊断为具有要治疗的癌症；并d)若在步骤c)中受试者被诊断为具有要治疗的癌症的话，选择受试者进行癌症治疗。或者，此类方法可包括下述步骤a)测定IMP-3在自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的生物样品中的表达水平；b)将MP-3的表达水平与癌性对照水平比较；c)若MP-3的表达水平与癌性对照水平相似或等同的话，将受试者诊断为具有要治疗的癌症；并d)若在步骤c)中受试者被诊断为具有要治疗的癌症的话，选择受试者进行癌症治疗。本发明还提供了用于确定能用本发明的MP-3多肽来治疗的患有癌症的受试者的试剂盒，其亦可用于评价和/或监测特定的癌症疗法，更特别地是癌症免疫疗法的功效。合适的癌症的示例包括，但不限于肺癌和食道癌。更特别地，所述试剂盒优选包含至少一种在源自受试者的癌细胞中检测MP-3基因表达的试剂，所述试剂选自下组(a)用于检测MP-3基因的mRNA的试剂；(b)用于检测MP-3蛋白的试剂；(c)用于检测MP-3蛋白的生物学活性的试剂。适于检测MP-3基因mRNA的试剂包括特异性结合或识别MP_3mRNA的核酸，诸如具有与MP-3mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对MP_3mRNA特异性的引物与探针。这类寡核苷酸可基于本领域众所周知的方法制备。如果需要，用于检测MP_3mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测MP-3mRNA的试剂。另一方面，适于检测MP-3蛋白的试剂包括针对MP-3蛋白的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述试剂，只要所述片段或经修饰抗体保留与MP-3蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种用于检测IMP-3蛋白的试剂。所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。举例而言，从没有癌症或患有癌症的受试者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和带有使用说明书(例如，书面的、磁带、⑶-ROM等等)的装箱单。这些试剂之类的可标上标签包含在容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可用多种材料制造，例如玻璃或塑料。作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对IMP_3mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质例如多孔条上，以形成至少一个检测位置。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位置，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位置。或者，对照位置可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位置上量较大而在后面的位置上量较小。在加入测试样品之后，显示可检测信号位置的数目提供了在样品中存在的IMP-3mRNA量的定量指征。所述检测位置可设置成具有任何合适可检测的形状，通常是横跨测试条宽度的条状或点状。本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照样品或MP-3标准样品。本发明的所述阳性对照样品可通过收集MP-3阳性样品，随后测定其MP-3水平来制备。此外，可将纯化的MP-3蛋白或多核苷酸添加到不表达MP-3的细胞中以形成所述阳性样品或MP-3标准品。在本发明中，纯化的MP-3可以是重组蛋白。例如，阳性对照样品的MP-3水平大于截留值。提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例材料和方法小鼠人白细胞抗原(HLA)-A2 转基因(Tg)小鼠；引入了人 beta2m-HLA_A2. I (HLA_A*0201，a I, a 2)-H_2Db(a 3跨膜胞质)单链构建体基因的H_2Db和beta2m双敲除小鼠系于Department SIDA-Retrovirus, Unite d' Immunite Cellulaire Antivirale, InstitutePasteur, France制作，由F. A. Lemonnier博士惠赠。这些小鼠饲养在熊本大学动物资源和开发中心(Center for Animal Resources and Development ofKumamoto University),依照熊本大学动物照看指南来操作它们。细胞系PANC I, A549, Lu99, MCF7, SW620, SKHep I 和 T2, TAP-缺陷和 HLA-A2 (A*0201)-阳性细胞系，购自Riken Cell Bank(日本筑波)。通过逆转录聚合酶链式反应分析确定了IMP-3的表达。血液样品利用自HLA-A2阳性供体分离的外周血单个核细胞(PBMC)进行的研究获得了日本熊本熊本大学机构评审委员会(Institutional Review Board of KumamotoUniversity, Kumamoto, Japan)的批准。在熊本大学医院，在获得了患者的正式书面知情同意书后，在例行诊断程序中获取了 4名肺癌患者(代号为患者I、患者3、患者4、患者14和患者103)的血液样品。还在获得书面知情同意后从HLA-A2(A*0201)阳性健康供体(代号为供体-I、供体-2和供体-3)获得了血液样品。所有样品均经过匿名化处理、随机编号，并、保持在-80摄氏度直到使用。 来源于MP-3的肽的候选者选择使用结合预测软件"BIMAS" (http://www_bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bi nd)(Parker et al. , J TmmunoI 1994，152 (I):163-75，Kuzushima et al. , Blo od2001,98(6) :1872-81)预测了来源于IMP-3的可能结合HLA-A2 (A*0201)分子的肽。由American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA合成了这些妝以及HLA-A2 (A*0201)限制型HIV 肽(SLYNTYATL)，纯度 >95%。IMP-3反应性小鼠CTL的诱导对于HLA-A2转基因小鼠，在第7和第14天用5X IO5个经候选肽冲激的同基因骨髓衍生树突细胞(BM-DC)体内免疫。在第21天，用经每种肽冲激的BM-DC刺激从经免疫的 小鼠分离的⑶4-脾细胞，历时6天。用酶联免疫斑点(ELISP0T)测定检测IFN-Y产生。IMP-3反应性人CTL的诱导通过Ficoll-Conray密度梯度离心分离来自HLA-A2 (A*0201)阳性供体的肝素化血液的PBMC，以产生外周血单核细胞衍生的DC。在含有2%热灭活的自体血浆的 AIM-V (Invitrogen Japan, Tokyo, Japan)中将这些 DC 在 4 u g/mL ^ -2 微球蛋白(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的存在下用 20 u g/mL 候选肽在 37°C冲激 2 小时。然后照射细胞(40Gy)，并将细胞与⑶8+T细胞一起温育。然后在24孔平板中设置培养物，每个孔含有2mL AM-V (含2%自体血浆)，其中有IX IO5个经肽冲激的DC、2X IO6个⑶8+T细胞、和5ng/mL人重组IL_7 (ffako, Osaka, Japan)。2天后，向这些培养物中加入重组人IL-2 (PeproTech, Rocky Hill1NJ, USA)至最终浓度为20IU/mL。另外使用同样的程序用加载有肽的自体DC刺激，每周一次，进行两次(在第7天和第14天)。在最后一次刺激后六天，通过IFN- y ELISP0T测定和51Cr释放测定来考察诱导出的CTL的抗原特异性应答。对于IFN- y ELISP0T测定，用经关联肽或无关的HIV肽冲激过的T2 (IX IO4/孔)刺激CTL (10XIO5个细胞/孔)。对于51Cr释放测定，以标示的效应物/靶物比将CTL与作为靶细胞的经肽冲激的T2细胞或癌细胞(5X103/孔)共温育，按照前人的描述(Komori H et al.，ClinCancer Res. 2006 May I; 12 (9) : 2689-97)进行标准 51Cr 释放测定。对⑶107a(LAMP_l;溶酶体相关膜蛋白_1)在CTL细胞表面上的暴露的分析通过抗⑶107a抗体检测了在抗原刺激后⑶107a在CTL的细胞表面上的暴露。在缀合有FITC的抗CD107a单抗或作为对照的小鼠IgGl的存在下，用关联肽或无关HIV肽刺激MP-3肽特异性CTL。将这些CTL在37°C温育5小时，然后用缀合有PE的抗人⑶8单抗染色。所有肽以I微克/ml的终浓度使用。所显示的事件是对CD8+T细胞设门的。抗HLA I类单克隆抗体对CTL应答的抑制如前人所述(KomoriH et al. , Clin Cancer Res. 2006 May I; 12 (9) : 2689-97)进行HLA I类的抑制。具体地，分别将Lu99靶细胞与抗HLA I类单抗(W6/32，IgG2a)或抗HLA-DR单抗(HLA II类单抗)(H-DR-1，IgG2a)温育I小时后，将Lu99细胞与通过用关联肽刺激而自肺癌患者衍生的CTL共温育。统计学分析使用双尾Student氏t检验来评估IFN- y EU SPOT测定获得的数据的差异的统计学显著性。P〈0. 05的值认为是显著的。统计学分析使用市售的统计学软件包(SPSS forWindows, version11. 0，Chicago, ILj USA)来进行。结果来源于IMP-3的HLA-A2结合肽的预测表I显示以最高结合亲和力为序排列的MP-3的HLA-A2(A*0201)结合肽(表I)。选择了总共20种具有潜在HLA-A2(A*0201)结合能力的肽。源自頂P-3的 HLA-A2 (A*0201)结合肽
权利要求
1.一种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列。
2.一种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID NO: 1、3、5和6的氨基酸序列，其中替换、缺失、插入和/或添加了 I个、2个或数个氨基酸，且其中所述寡肽具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力。
3.权利要求2的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者 (a)从N端起的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和 (b)C端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
4.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-3中任一项的肽。
5.通过使用如权利要求1-3中任一项所述的寡肽来诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞的方法。
6.权利要求5的方法，其中所述方法包括选自下组的步骤 (a)使抗原呈递细胞与权利要求1-3中任一项的寡肽接触，和 (b)将编码权利要求1-3中任一项的寡肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞。
7.权利要求5或6的方法，其中所述抗原呈递细胞在其表面上表达至少一种HLA-A2抗原。
8.通过使用如权利要求1-3中任一项所述的寡肽来诱导CTL的方法。
9.权利要求8的方法，其中所述方法包括选自下组的步骤 (a)使CD8-阳性T细胞接触在其表面上呈递权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的抗原呈递细胞和/或外来体；和 (b)向CD8-阳性T细胞中导入编码能够形成T细胞受体(TCR)亚单位的多肽的多核苷酸，所述亚单位结合细胞表面上的权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物。
10.权利要求9的方法，其中所述HLA抗原为HLA-A2。
11.一种分离的CTL，其靶向权利要求1-3中任一项的寡肽。
12.权利要求11的CTL，其中所述CTL能够结合细胞表面上权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物。
13.权利要求12的CTL，其中所述HLA抗原为HLA-A2。
14.分离的CTL，其是通过使用权利要求1-3中任一项的寡肽诱导的。
15.权利要求14的CTL，其中所述CTL是通过权利要求8-10中任一项的方法诱导的。
16.一种分离的抗原呈递细胞，该细胞在其表面呈递HLA抗原与权利要求1-3中任一项的寡肽的复合物。
17.权利要求16的抗原呈递细胞，其中所述HLA抗原是HLA-A2。
18.权利要求16或17的抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞是通过权利要求5-7中任一项的方法诱导的。
19.一种在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，包括对所述受试者施用疫苗的步骤，所述疫苗包含选自下组的至少一种活性成分 (a)一种或多种权利要求1-3中任一项所述的寡肽，或其免疫学活性片段； (b)一种或多种编码权利要求1-3中任一项所述的寡肽或其免疫学活性片段的多核苷酸； (c)一种或多种权利要求11-15中任一项的分离的CTL ;和(d) —种或多种权利要求16或18的分离的抗原呈递细胞。
20.权利要求19的方法，其中所述受试者是HLA-A2阳性的。
21.一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药剂，其中该药剂包含可药用担载体以及选自下组的至少一种活性成分 (a)一种或多种权利要求1-3中任一项所述的寡肽，或其免疫学活性片段； (b)一种或多种编码至少一种权利要求1-3中任一项所述的寡肽或其免疫学活性片段的多核苷酸； (c)一种或多种在其表面上呈递至少一种权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的抗原呈递细胞；和 (d)一种或多种能够结合细胞表面上权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合 物的CTL。
22.一种用于诱导CTL的药剂，其中该药剂包含可药用担载体以及选自下组的至少一种活性成分 (a)一种或多种权利要求1-3中任一项所述的寡肽，或其免疫学活性片段； (b)一种或多种编码至少一种权利要求1-3中任一项所述的寡肽或其免疫学活性片段的多核苷酸； (c)一种或多种在其表面上呈递权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的抗原呈递细胞。
23.权利要求21或22的药剂，其中所述药剂配制为用于对HLA-A2阳性的受试者施用。
24.权利要求21-23中任一项的药剂，其是疫苗。
25.选自下组的活性成分 (a)一种或多种权利要求1-3中任一项所述的寡肽； (b)—种或多种处于可表达形式的编码权利要求1-3中任一项所述的寡肽的多核苷酸； (c)一种或多种在其表面上呈递权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的抗原呈递细胞；和 (d)一种或多种能够结合细胞表面上权利要求1-3中任一项的寡肽与HLA抗原的复合物的CTL 在制备用于治疗癌症的药物组合物或药剂中的用途。
26.权利要求25的用途，其中所述药物组合物或药剂配制为用于对HLA-A2阳性的受试者施用。
27.—种包含选自SEQ ID勵:1、3、5和6的氨基酸序列的分离的寡肽，其用于在见^-八2阳性的受试者中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发。
28.一种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID NO:l、3、5和6的氨基酸序列，其中替换、缺失、插入和/或添加了 I个、2个或数个氨基酸，且其中所述寡肽具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力，用于在HLA-A2阳性的受试者中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发。
29.权利要求28的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者 (a)从N端起的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和(b)C端氨基酸是 缬氨酸或亮氨酸。
全文摘要
本申请中描述了具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力、适于在癌症免疫治疗的语境中使用的寡肽。突出的例子包括具有SEQ ID NO:1、3、5或6的氨基酸序列的寡肽，其中任选替换、缺失、插入或添加1个、2个或数个氨基酸，只要它们保留原始肽的细胞毒性T淋巴细胞诱导能力。还描述了与这些寡肽相关的适于治疗或预防癌症或肿瘤或其手术后复发的药物制剂或“药物”。
文档编号C12N15/00GK102741271SQ20108006287
公开日2012年10月17日 申请日期2010年11月30日 优先权日2009年12月1日
发明者中村佑辅, 原尾美智子, 富田雄介, 西村泰治, 角田卓也 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司