专利名称：用于增加Fc融合蛋白的血清半寿期的组合物和方法
用于増加Fe融合蛋白的血清半寿期的组合物和方法相关申请
本申请要求保护2009年12月2日提交的美国临时申请号61/266，095和2010年4月23日提交的美国临时申请号61/327，582的权益。上述申请的全部教导通过引用结合到本文中。
背景技术：
以其天然态或当重组产生时的治疗用蛋白质或多肽通常为不稳 定的分子，表现出短时间的稳定性或短的血清半寿期。此外，这些分子在配制吋，特别是当在水溶液中配制用于诊断和治疗目的时，常常极不稳定。存在少数实用的解决方案来延长或提高蛋白质治疗分子的体内或体外稳定性。许多治疗药，特别是肽药物受累于不适当的体内血清半寿期。这使在高频和/或更高剂量给予所述治疗药，或者使用持续释放制剂以维持疗效所需的血清水平成为必需。频繁的全身给药与大量的消极副作用相关。例如，频繁(例如毎日)全身注射表现出受试者的相当不舒适，造成高风险的给药相关的感染，以及特别是当静脉内给予治疗药时，可能需要住院治疗或频繁去医院就诊。此外，长期治疗中的毎日静脉内注射亦可导致大量的组织瘢痕形成和由反复穿刺血管引起的血管病理。对于治疗剂的所有频繁的全身给药，例如给予糖尿病患者胰岛素，或者在患有多发性硬化的患者中给予干扰素药物，均已知类似问题。所有这些因素导致患者遵从性减小和用于卫生系统的费用増加。改变药剂的血清半寿期的ー个可能的解决方案是与可増加半寿期的试剂分子共价连接。先前已显示，聚合物例如聚こニ醇或“PEG”与多肽连接可増加它们的血清半寿期。然而，聚合物的连接可导致药物活性減少。不完全连接或不一致连接导致产生具有不同性质的化合物的混合群体。此外，由这类修饰引起的半寿期改变为不可预知的。例如，不同的聚こニ醇与IL-8、G-CSF和IL-Ira缀合产生具有各种活性和半寿期的分子(Gaertner和Offord, (1996)，Bioconjugate Chem. 7:38-44)。IL-8 与 PEG2tl 缀合不引起其半寿期的改变，而PEG2tl与IL-Ira缀合引起在半寿期上几乎増加至7倍。此外，IL-8/PEG20缀合物的效カ为天然蛋白质的1/10至1/20。因此，能够增加生物活性分子的血清半寿期，而不会严重減少分子的生物学功能的方法将是极其需要的。发明概述
在某种程度上，本公开内容提供用于延长融合蛋白的血清半寿期的方法，所述融合蛋白包含免疫球蛋白Fe结构域和至少ー个异源多肽结构域。在某些实施方案中，所述方法包括通过修饰编码最初Fe融合蛋白的异源部分的核酸以编码一个或多个附加的N联糖基化位点，来制备编码修饰Fe融合蛋白的修饰核酸，所述修饰Fe融合蛋白相对于最初Fe融合蛋白具有延长的血清半寿期。在一些实施方案中，本发明的修饰核酸将编码以下修饰Fe融合蛋白，当在合适细胞培养物中表达时，其血清半寿期比最初Fe融合蛋白的血清半寿期至少长10%。在一些实施方案中，本发明的修饰Fe融合蛋白相对于未修饰Fe融合蛋白具有基本上相同或更大的体内生物活性。在某些实施方案中，相对于缺乏附加糖基化位点的融合多肽的血清半寿期，在一个或多个附加(即引入的)糖基化位点的糖基化使修饰Fe融合蛋白的半寿期(例如，体外半寿期、体内半寿期、血清半寿期)増加至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%或250%或更多。在某些实施方案中，在相同的动物模型或物种中测定修饰Fe融合蛋白和缺乏附加糖基化位点的融合多肽的血清半寿期以进行比较。在示例性实施方案中，如本文所述在药代动力学大鼠測定或药代动力学猴测定中测定血清半寿期。在一些实施方案中，本公开内容提供制备相对于最初Fe融合蛋白具有延长的半寿期的修饰Fe融合蛋白的方法，所示方法通过a)在提供哺乳动物或哺乳动物样糖基化的细胞培养物中表达已被修饰为引入至少ー 个附加N联糖基化位点的核酸，和b)从细胞培养物中回收修饰Fe融合蛋白来进行。可利用任何适于从细胞培养物中获取蛋白质的技术，将Fe融合蛋白作为未加工部分、部分纯化部分或高度纯化部分回收。在某些方面，在产生包含唾液酸的N联糖部分的细胞系中表达修饰核酸。在某些方面，通过哺乳动物细胞系(包括但不限于CHO细胞系、NSO细胞系、COS细胞系或HEK236细胞系)，来表达修饰核酸。在其他方面，通过已工程改造为提供哺乳动物或哺乳动物样糖基化的非哺乳动物细胞(包括但不限于基因工程真菌细胞、昆虫细胞或植物细胞)，来表达修饰核酸。在某些方面，纯化可包括以下步骤将修饰Fe融合蛋白暴露给A蛋白并回收与A蛋白结合的修饰Fe融合蛋白。在优选的实施方案中，将通过本公开内容的方法产生的Fe融合蛋白配制用于给予患者。在一些实施方案中，本公开内容提供包含按照本文所述任何方法制备的修饰核酸的细胞系。本发明的细胞系可包括哺乳动物细胞系(例如CHO细胞系、NSO细胞系、COS细胞系或HEK236细胞系)或已遗传修饰成提供哺乳动物或哺乳动物样糖基化的非哺乳动物细胞系(例如真菌细胞、昆虫细胞或植物细胞)。在某些实施方案中，本公开内容提供以稳定性和/或血清半寿期増加为特征的糖变体(glycovariant) Fe融合蛋白以及用于产生半寿期增加的融合蛋白的方法。本发明的Fe融合蛋白包括但不限于包含免疫球蛋白Fe结构域和至少ー个异源多肽结构域的多肽。在免疫球蛋白Fe结构域之外修饰Fe融合蛋白，以引入至少ー个非内源N联糖基化位点，其相对于缺乏引入的糖基化位点的融合蛋白的半寿期(例如，体外半寿期、体内半寿期或血清半寿期)，増加修饰融合蛋白的血清半寿期。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白包含至少ー个非内源或引入的N联糖基化位点，其相对于缺乏引入的糖基化位点的融合蛋白的血清半寿期，使所述融合物的血清半寿期增加至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%或250%或更多。在某些实施方案中，在相同的动物模型或物种中測定修饰Fe融合蛋白和缺乏附加糖基化位点的融合多肽的血清半寿期以进行比较。在示例性实施方案中，如本文所述在药代动力学大鼠測定或药代动力学猴测定中測定血清半寿期。可通过添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基以引入ー个N联糖基化位点来修饰本发明的Fe融合蛋白。在某些实施方案中，最初Fe融合蛋白的异源部分的姆50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130、140或150个氨基酸中包含至少ー个N联糖基化位点。在某些实施方案中，最初Fe融合蛋白的异源部分的每60、70、80、90、100、110、120或125个氨基酸中包含少于ー个N联糖基化位点。在某些实施方案中，通过至少
15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸将与N联糖基化连接的修饰Fe融合蛋白的异源部分的各个氨基酸与任何其他被N联糖基化修饰的氨基酸隔开。在某些实施方案中，在修饰Fe融合蛋白的N端、C端或者N端和C端二者的10、20、30、40或50个氨基酸之内不会出现附加的N联糖基化位点。在优选的实施方案中，本发明的Fe融合蛋白包含至少两个结构上不同的结构域，其通过表面暴露的(即可溶性环结构域)且未掺入a螺旋或P折叠中的氨基酸序列连接。在优选的实施方案中，将附加的N联糖基化位点置于表面暴露的氨基酸序列之内。在优选的实施方案中，不将附加的N联糖基化位点掺入具有ニ级结构元件例如a螺旋或0折叠的蛋白质区中。用于本发明的异源部分可包括蛋白质的功能结构域(例如酶促或催化结构域或者配体结合域)。在一些实施方案中，本公开内容的Fe融合蛋白还包含接头结构域。在一些实施方案中，至少ー个引入的糖基化位点位于接头结构域中。优选本发明的融合多肽的异源结构域具有较高分子量，为至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100,105 或 110 kDa。在具体实施方案中，异源部分包括细胞受体(例如跨膜受体)的胞外(即可溶性)域及其任何变体(包括突变型、片段和肽模拟形式)。在优选的实施方案中，异源部分包括 跨膜受体的配体结合域。本公开内容的方法可用于在异源部分的以下位置引入ー个或多个N联糖基化位点，所述位置使得连接的任何附加的糖部分基本上不会干扰配体结合域，例如相对于与缺乏引入糖基化位点的Fe融合蛋白结合的配体，在结合活性上减小至不小于1/2、1/3、1/5、1/10或1/15。因此，在ー些方面，在使得配体结合域的氨基酸序列未被修饰的位置和/或在预测其基本上不会干扰配体界面的位置弓I入ー个或多个弓I入的N联糖基化位点。在某些实施方案中，Fe融合蛋白的IC5tl (即半数最大抑制浓度)不小于最初Fe融合蛋白的 IC50 的 1/2、1/3、1/5 或 1/10。在某些实施方案中，Fe融合蛋白包含选自神经生长因子/肿瘤坏死因子受体家族成员的异源部分。在具体实施方案中，胞外受体结构域包含2型肿瘤坏死因子受体(即TNFR2)的部分。在优选的实施方案中，本公开内容提供与TNF-a结合的Kd小于I微摩尔或者小于100、10或I纳摩尔的TNFR2融合蛋白。在一些实施方案中，本发明的TNFR2融合蛋白包含具有位于人TNFR2前体蛋白(即SEQ ID NO: I)的D47、Q48、A50、E155或G253位的一个或多个修饰氨基酸的TNFR2胞外域。这些残基分别对应于TNFR2的胞外加工结构域(即SEQ ID NO: 2)的D25、Q26、A28、E133和G231位。优选的修饰包括氨基酸的添加、取代和/或缺失，其导致在TNFR2多肽中引入ー个或多个N联糖基化位点，包括例如相对于SEQID NO: 2的氨基酸序列的026队ム285、025队￡133队025队623謂氨基酸取代。在一些实施方案中，对TNFR2融合蛋白进行多于ー种修饰(例如添加、缺失和/或取代)以引入ー个或多个N联糖基化位点，包括例如包含相对于SEQ ID NO: 2氨基酸序列的Q26N/A28S ;D25N/E133N ；D25N/G231N ；Q26N/A28S/E133N ；Q26N/A28S/G231N 或 E133N/G231N 取代的 TNFR2 变体。本发明的TNFR2-FC融合蛋白可为本文所公开的任何融合蛋白，例如包含下列多肽的融合蛋白，所述多肽具有选自SEQ ID NO: 1、2、5、6、7或8的氨基酸序列，或者包含与选自SEQID NO: 1、2、5、6、7或8的氨基酸序列有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%同一性的氨基酸序列。可将TNFR2-FC融合蛋白配制成包含TNFR2-FC融合蛋白和药学上可接受的载体的药物制剂，其中所述制剂基本上无致热物质以便适于给予哺乳动物。通过大小排阻层析法评价，所述组合物相对于其他多肽组分纯度至少可为95%，以及任选所述组合物纯度至少为98%。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅彩色制作的附图。带有彩图的本专利或专利申请出版物的副本可在请求并支付必要费用后由专利局提供。图I显示了 TNFR2-h⑴Fe多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)。描述可溶性TNFR2融合蛋白，其具有在无接头情况下与免疫球蛋白Fe结构域(命名为h(l)Fc变体)融合的人TNFR2的胞外域。免疫球蛋白Fe区用单下划线表示，天然存在的N联糖基化位点用双下划线表示。图2 显示了 Q48N/A50S 变体 TNFR2-h(l)Fc 多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)。描述可溶性TNFR2融合蛋白，其具有在无接头情况下与h (I)Fe免疫球蛋白Fe结构域融合的人TNFR2的胞外域。在48位和50位上修饰天然存在的TNFR2_Fc胞外域以引入N联糖基化位点。免疫球蛋白Fe区用单下划线表示，取代的氨基酸用双下划线表示。图3 显示了变体(D47N/E155N) TNFR2_h(l)Fc 多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:
7)。描述可溶性TNFR2融合蛋白，其具有在无接头情况下与h(I)Fe免疫球蛋白Fe结构域融合的人TNFR2的胞外域。在47位和155位上修饰天然存在的TNFR2_Fc胞外域以引入N联糖基化位点。免疫球蛋白Fe区用单下划线表示，取代的氨基酸用双下划线表示。图4 显示了变体(D47N/G253N) TNFR2_h(l)Fc 多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:
8)。描述可溶性TNFR2融合蛋白，其具有在无接头情况下与h(I)Fe免疫球蛋白Fe结构域融合的人TNFR2的胞外域。在47位和253位上修饰天然存在的TNFR2_Fc胞外域以引入N联糖基化位点。免疫球蛋白Fe区用单下划线表示，取代的氨基酸用双下划线表示。图5显示了具有天然前导序列的编码TNFR2-h⑴Fe多肽(即SEQ ID NO: 5)的核酸序列(SEQ ID NO: 9)。图6为描述TNF和TNFR2受体的胞外域之间的结合界面的带状图(ribbondiagram)。TNF为左边的绿色带状结构，而TNFR2受体为右边的蓝色带状结构。环中显示了引入N联糖基化位点的工程改造位点。蓝色环代表单突变，緑色环代表双重突变。显著降低配体结合活性的突变位于TNF结合部位近端并且描述为红色环。图7显示了 TNFR2的胞外域的序列，将用于引入非内源糖基化位点的示例性氨基酸修饰突出显示。对各个突出显示区指出了可引入非内源糖基化位点的修饰的具体实例。信号肽用单下划线指示，内源糖基化位点用双下划线指示。图8显示了 P链(箭头)在TNFR2结构中的预测位置。编号基于天然TNFR2前体序列(SEQ ID NO: I)。通过与TNFRl (PDB ID: 1EXT)、细胞因子应答修饰物E (CrmE; PDBID: 2UWI)和CD134 (0X40; PDB ID: 2HEY)的序列比对和结构同源性来推测ニ级结构。图9显示了具有天然前导序列的变体TNFR2_h(2)Fc多肽的氨基酸序列(SEQ IDNO: 16)。描述可溶性TNFR2融合蛋白，其具有通过4氨基酸接头与示例性人Fe结构域(SEQID NO: 14)融合的天然人TNFR2的胞外域。Fe结构域用单下划线指示,前导序列和接头序列用双下划线表示。
图10显示了编码TNFR2-h⑵Fe多肽(即SEQ ID NO: 16)的核苷酸序列(SEQ IDNO: 17)。编码Fe结构域的序列用单下划线指示，编码前导序列和接头的序列用双下划线表不。图11显示了糖变体Q48N/A50S TNFR2_h (I) Fe在大鼠胶原诱导关节炎模型中对作为炎症标志物的脚爪体积的影响。在第O天和第7天给予胶原，而使用试验物品的治疗在第6天开始。显示的数据为平均值土SEM。如同TNFR2-h(l)Fc，使用Q48N/A50S TNFR2_h(l)Fe的治疗在下半部分研究中预防了在溶媒治疗的大鼠中观察到的脚爪肿胀。图12显示了糖变体Q48N/A50S TNFR2_h (I) Fe在大鼠胶原诱导关节炎模型中对骨品质的影响。通过在研究完成后第21天的显微计算机断层扫描术(显微CT)离体获得跗骨图像。如同TNFR2-h(l)Fc，使用Q48N/A50S TNFR2-h(l)Fc的治疗预防了在溶媒治疗的大鼠中观察到的骨侵蚀。发明详述
I.综述
在某些方面，本公开内容涉及出人意料的发现可通过在适当靶蛋白的适当位置上引入至少ー个非内源N联糖基化位点来延长Fe融合蛋白的血清半寿期。因此，本公开内容提供通过增加多肽上N联糖基化位点的数目来増加Fe融合蛋白(特别是治疗用多肽)的血清 半寿期的方法。如本文所示，已将本公开内容的方法用于增加包含以下受体胞外域的一部分的Fe融合蛋白的血清半寿期，所述部分包含配体结合域。在具体实例中，本公开内容提供以相对于未修饰形式的各个融合蛋白半寿期増加为特征的修饰TNFR2-FC融合蛋白。虽然不使公开内容限制于任何具体的作用机制，但提出在其在患者体内的停留时间期间，将Fe融合蛋白的非Fe部分(“异源部分”)暴露给各种胞内和胞外环境。这些不同的条件可引起部分的异源部分作为蛋白酶底物或者使蛋白质修饰或降解过程开始的其他酶或分子的底物而变得易受攻击。因此，本公开内容提供以下新提议起降解异源部分作用的物质显著影响Fe融合蛋白的血清半寿期，以及趋向于保护异源部分免受这类物质作用的修饰将导致更长的血清半寿期。如本文所述，添加ー个或多个N联糖基化位点提供用于屏蔽异源结构域的易受攻击部分免受不需要的降解或改变以及在一些情形中使这类分子的所需结构构象稳定的单步生物相容性系统。可能难以先验地预测最初Fe融合蛋白的异源结构域中哪些位置最易接受附加的N联糖基化位点，以及在缺乏任何约束或指导方针时，在理论上可用一个或多个附加N联位点的几乎无限组合来修饰任ー个异源结构域。通过使用不同的最初Fe融合蛋白，申请人发现了允许以合理数目的位点修饰最初Fe融合蛋白以获得以下修饰Fe融合蛋白的多种指导方针，所述修饰Fe融合蛋白相对于最初Fe融合蛋白表现出延长的血清半寿期，同时保留修饰分子的生物活性(特别是体内生物活性)。虽然不希望限制总体公开内容的范围，但是申请人发现利用ー种或多种以下原理提供产生有活性、半寿期延长的Fe融合蛋白的可行方法(I)可将N联糖基化位点有利地置于Fe融合蛋白异源部分的表面暴露位置(不论是通过蛋白质结构分析确定还是通过经验方法确定)，和特别地置于未包含在限定的蛋白质结构元件(例如a螺旋或P折叠)之内的位置；(2)可将N联糖基化位点有利地置于Fe融合蛋白异源部分的以下位置如果所述位置经受修饰或降解会引起蛋白质结构或功能的实质性扰动(例如，许多蛋白质在N端具有松散区，如果切割该松散区，会引起总体蛋白及其活性的很少扰动或不引起扰动，因此，置于这类位置的N联糖基化位点可对血清半寿期有适度影响，而相比之下，位于结构元件之间的表面暴露区如果经受不合乎需要的降解，会对蛋白质表现出高度暴露和显著后果的组合，因此结构元件之间的表面暴露氨基酸代表对引入N联糖基化位点而言合乎需要的位置)；(3)可将N联糖基化位点置于不会干扰最初Fe融合蛋白的关键功能部位(例如，配体结合表面或催化部位)的位置，这可通过选择功能部位本身之外的位置和/或选择任何新N联糖部分不会伸入功能部位的位置来完成；(4)待通过添加N联糖基化位点达到的作用程度可与已存在于最初Fe融合蛋白中的N联糖密度成反比，因此，使用具有相对低水平糖基化(例如，异源部分的每60、70、80、90、100、110、125个或更多个氨基酸中有少于I个N联位点)的异源部分的最初Fe融合蛋白的方法可为最有效的；(5)在重度糖基化和轻度糖基化异源部分二者中，待达到的作用程度可与N联糖基化位点之间的间距成比例，这意味着可将ー个或多个附加的N联糖基化位点以离已存在N联糖基化或其他附加的N联糖基化位点相对规律和相对远的间距(例如，在N联糖基化位点的N残基之间有多于10、15、20、25、30、35或40个氨基酸)有利地放置——甚至在重度糖基化蛋白质中，如果糖紧密聚簇，则添加良好间隔的N联位点可促进血清半寿期的显著增加。虽然使用ー个或多个以上原理可允许设计相对于最初Fe融合蛋白表现出延长的血清半寿期的单一修饰Fe融合蛋白，但是常常有益的是，基于单ー最初Fe融合蛋白产生多种修饰Fe融合蛋白，测试这些经改变的形式井随后测试表现出增加的半寿期和保留生物活性的最好组合的那些修饰形式的组合。在某些方面，本公开内容涉及通过增加多肽上N联糖基化位点的数目来增加Fe融合蛋白特别是治疗用多肽的血清半寿期的方法。如本文所示，已将本公开内容的方法用于増加包含受体胞外域的一部分的Fe融合蛋白的血清半寿期，所述部分包含配体结合域。在具体实例中，本公开内容提供以相对于未修饰形式的各个融合蛋白半寿期増加为特征的修饰TNFR2-FC融合蛋白。不论机制，从本文所示数据显而易见的是，引入附加的糖基化位点是延长高分子量生物药品特别是Fe融合蛋白的半寿期的有效方法。在具体实施方案中，本公开内容提供以血清半寿期増加为特征的修饰TNFR2-FC糖变体融合蛋白。肿瘤坏死因子(TNF)为涉及正常炎症和免疫应答的天然存在的细胞因子。肿瘤坏死因子a (TNFa)和肿瘤坏死因子0 (TNFP)为同源的多功能细胞因子。在这些多肽的结构和功能特征方面的巨大相似性使得它们统称为肿瘤坏死因子或“TNF”。通常归因于TNF的活性包括释放包括IL-I、IL-6、GM-CSF和IL-10的其他细胞因子、诱导趋化因子、増加粘附分子、增长血管、释放组织破坏性酶和激活T细胞。參见例如Feldmann等，1997, Adv. Tmmun01. , 64:283-350，Nawroth等，1986，J. Exp. Med. , 163:1363-1375;Moser 等，1989，J. Clin. Invest, 83:444-455; Shingu 等，1993, Clin. Exp.Tmmun 01. 94:145-149; MacNaul 等，1992，Matrix Suppl. , 1:198-199;和 Ahmadzadeh等，1990，Clin. Exp. Rheumatol. 8:387-391。所有这些活性都可起增强炎症反应的作用。TNF引起导致组织损伤的促炎作用，例如诱导对血管内皮细胞的促凝活性(Pober等，J. Immunol. 136:1680 (1986))、增加中性白细胞和淋巴细胞的粘附(Pober等，J.Immunol. 138:3319 (1987))以及刺激自巨噬细胞、中性白细胞和血管内皮细胞中释放血小板活化因子(Camussi 等，J. Exp. Med. 166:1390 (1987))。TNF亦与感染(Cerami 等，Immunol. Today 9:28 (1988))、免疫病症、肿瘤病理(Oliff 等，Cell 50:555 (1987))、自身免疫病理和移植物抗宿主病理(Piguet等，J. Exp. Med. 166:1280 (1987))相关。这类TNF相关的病症包括充血性心カ衰竭、炎性肠病(包括克罗恩氏病)、关节炎和哮喘。具体而言，TNF在革兰氏阴性脓毒症和内毒素性休克中起主要作用(Michie等，、Br. J. Surg. 76:670-671 (1989) ; Debets 等，第二届维也纳休克论坛(Second ViennaShock Forum),第 463-466 页(1989); Simpson 等，Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989);Waage 等，Lancet 1:355-357 (1987) ; Hammerle 等，第二届维也纳休克论坛，第 715-718页(1989) ; Debets等，Crit. Care Med. 17:489-497 (1989) ; Calandra等，J. Infect.Dis. 161:982-987 (1990) ; Revhaug等，Arch. Surg. 123:162-170 (1988))，包括发烧、不适、厌食和恶病质。TNF通过其与TNF应答细胞上的特异性细胞表面受体的相互作用来启动其生物效应。有两种不同形式的细胞表面肿瘤坏死因子受体(TNFR)，命名为p75 (或2型)和p55 (或 I 型)(Smith 等，1990，Science 248:1019-1023; Loetscher 等，1990，Cell61:351-359)。I型TNFR和2型TNFR各自与TNF a和TNF ^ 二者结合。TNF的生物活性取决于与任ー细胞表面TNFR的结合。I型受体(也称为TNF-R55、TNF-RI或TNFR-P )为55kd的糖蛋白，显示其转导引起TNF-a的细胞毒活性、抗病毒活性和増殖活性的信号。p75受体(也称为TNF-R75、TNFR2或TNFR-a )为75 kDa的糖蛋白，亦显示其转导细胞毒信号和増殖信号以及导致GM-CSF分泌的信号。 已证实TNF拮抗剂(例如可溶性TNFR和抗TNF抗体)阻断TNF活性，引起对TNF响应的IL-1、GM-CSF、IL-6、IL-8、粘附分子和组织破坏的减少(Feldmann等，1997)。在DBA/1小鼠的II型胶原关节炎模型中测试了利用仓鼠抗小鼠TNF抗体的TNF拮抗作用的效应(Williams 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9784-9788)。在疾病发作后开始的治疗导致在足垫肿胀、临床评分和关节破坏的组织病理方面的改进。使用抗体(Thorbecke 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7375-7379)或 TNFR构建体(Husby 等，1988，J. Autoimmun. 1:363-71; Tetta 等，1990，Ann. Rheum.Dis. 49:665-667; Wooley 等，1993，J. Immunol. 151:6602-6607; Piguet 等，1992，Immunology 77:510-514)的其他研究获得了类似结果。三种特异性TNF拮抗剂现已被FDA批准依那西普(EnbreT)、英利昔单抗(Remicade )和阿达木单抗(Humira )。这些药物的一种或多种获准用于治疗类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、強直性脊柱炎和炎性肠病(克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。连接至人IgGl的Fe部分的可溶性人TNFR (p75)的重组形式(sTNFR(p75) :Fc,EnbreI , Immunex)的临床试验已显示,给予所述药物导致RA疾病活性的显著和迅速减小(Moreland 等，1997，N. Eng. J. Med. , 337:141-147)。此外，来自对 Enbrel 的儿科临床试验的安全性数据指出，患有青少年类风湿性关节炎(JRA)的患者通常良好耐受此药物(Garrison等，1998，美国风湿病学学会会议(Am. College of Rheumatologymeeting)，1998 年 11 月 9 日，摘要 584)。如上所述，Enbrel 为由连接到人IgGl的Fe部分的人75千道尔顿(p75) TNFR的胞外配体结合部分组成的ニ聚体融合蛋白。Enbrel 的Fe组分含有CH2结构域、CH3结构域和铰链区，但不含IgGl的CHl结构域。Enbrel 在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达系统中产生。其由934个氨基酸组成且表观分子量约为150千道尔顿(Smith等，1990，Science 248:1019-1023; Mohler 等，1993，J. Immunol. 151:1548-1561;美国专利号
5,395, 760 (Immunex Corporation, Seattle, Wash.);美国专利号 5，605，690 (ImmunexCorporation, Seattle, Wash.)。目前表明Enbrel 用于在对ー种或多种疾病缓解抗风湿药(DMARD)应答不足的患者中減少中度至重度活性的类风湿性关节炎的体征和症状。可在对单独的甲氨蝶呤不充分应答的患者中与甲氨蝶呤组合使用Enbrel 。亦表明Enbrel 用于在对一种或多种DMARD应答不充分的患者中減少中度至重度活性的多关节病程青少年类风湿性关节炎(polyarticular-course juvenile rheumatoid arthritis)的体征和症状(1999 年 5 月28日)。将Enbrel 作为皮下注射剂每周两次以25 mg给予RA患者。目前，使用ENBREL制剂的治疗为每周两次皮下给药，这对于患者而言昂贵、不愉快且不便。因此，本公开内容提供包含TNF结合受体(例如Enbrel )的可溶性(例如胞外的)部分的TNF拮抗剂，所述可溶性部分已被修饰为弓I入至少ー个非内源N联糖基化位点，以相对于缺乏引入糖基化位点的可溶性TNF受体的血清半寿期，增加修饰多肽的血清半寿期。
在本发明的上下文以及在使用各个术语的具体上下文中，用于本说明书的术语ー般具有其在本领域的一般含义。下文或本说明书其它部分论述某些术语，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用所述组合物和方法方面，对从业人员提供额外的指导。术语任何用法的范围或含义从使用术语的具体上下文来看将是显而易见的。“约”和“大约”总的来讲应意指给定测量的性质或精度，对所測定的量的可接受的误差度。示例性误差度通常在给定值或值的范围的20%、优选10%、更优选5%内。或者，特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可意指在给定值的数量级以内、优选5倍以内、更优选2倍以内的值。本发明的方法可包括将序列彼此进行比较的步骤，包括野生型序列与ー个或多个突变型(序列变体)比较。这类比较通常包括多聚体序列的比对，例如应用本领域熟知的序列比对程序和/或算法(例如BLAST、FASTA和MEGALIGN等)。技术人员可容易理解的是，在其中突变含有残基插入或缺失的这类比对中，序列比对可在不含插入残基或缺失残基的多聚体序列中引入“空位”(通常用破折号或“A”表示)。在所有其语法形式和拼法变化中的“同源的”，是指具有“共同进化起源”的两种蛋白质之间的关系，包括来源于同一生物物种超家族的蛋白质以及来源于不同生物物种的同源蛋白质。这类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的一样，不论就百分比同一性而言，或者就特定残基或基序和保守位置的存在情况而论。在所有其语法形式中的术语“序列相似性”是指可能有或没有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或一致性程度。然而，在普通用法以及在本申请中，术语“同源的”当用副词(例如“高度地”)修饰时，可以是指序列相似性，并且可与共同进化起源有关或无关。术语“药代动力学性质”是指生物活性剂(例如，小分子、多肽药物等)的吸收、分布、代谢和排泄。2.糖变体Fe融合蛋白
本文提供了具有与异源多肽连接的来自免疫球蛋白分子的Fe结构域的糖变体融合蛋白。所述糖变体融合蛋白包含至少ー个在融合蛋白Fe结构域之外的非内源N联糖基化位点。Fe结构域可直接地或通过多肽接头间接地与异源多肽连接。可将非内源糖基化位点引入异源多肽、接头或二者中。“非内源的”、“引入的”或“新的”糖基化位点是指未修饰形式的多肽中不存在的糖基化位点。因此，本文所述糖变体融合蛋白与存在于未修饰形式的融合蛋白中的糖基化位点数目相比，具有至少ー个附加的N联糖基化位点。例如，如果未修饰形式的融合蛋白具有两个Fe结构域之外的糖基化位点并将ー个N联糖基化位点引入异源多肽，则糖变体融合蛋白将具有包括两个天然糖基化位点和一个引入的糖基化位点在内的三个N联糖基化位点。应当理解的是，修饰融合蛋白以增加糖基化位点的数目不限于特定的“野生型”氨基酸序列，因为天然存在的变体或人造变体亦可根据本发明的方法进行修饰以增加糖基化位点的数目。众所周知的是，ー些蛋白质可支持大量糖侧链。0联糖基 化位点之间的距离可小至每隔ー个氨基酸(參见例如Kolset & Tveit (2008) Cell. MoI. Life Sci 65: 1073-1085和Kiani等，(2002) Cell Research 12(1) : 19-32)。对于N联糖基化位点，位点之间的距离可小至 3、4、5 或 6 个氨基酸(參见例如 Lundin 等，(2007) FEBS Letters 581:5601-5604(2007) ; Apweiler 等，(1991) Biochimica et Biophysica Acta 1473:4-8,其姆个的全部内容通过引用结合到本文中)。因此，在某些实施方案中，可将至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 个或更多个 N 联糖基化位点加入本文所述融合蛋白中。在某些实施方案中，本公开内容的糖变体融合蛋白的每
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150 或 200 个氨基酸中包含至少ー个糖基化氨基酸。在某些实施方案中，通过至少10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个或更多个氨基酸将各个N联糖基化氨基酸与任何其他N联、0联或者N联和0联糖基化氨基酸隔开。本文所用的“糖基化位点”可意指糖连接共有序列(即充当用于使糖(单糖、寡糖或多糖)与氨基酸序列连接的共有序列的一系列氨基酸)或者其可意指糖部分与之共价连接的实际氨基酸残基。糖部分可为单糖(单糖分子)、寡糖或多糖。 可通过修饰蛋白质的氨基酸序列或通过化学修饰融合蛋白中的氨基酸残基以加入糖部分来将N联糖基化位点引入融合蛋白。在优选的实施方案中，修饰本文所述融合蛋白以引入(例如通过插入、缺失或取代指定氨基酸)至少ー个具有共有序列NXT/S(天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸)的N联糖基化位点，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸。在蛋白质上增加糖部分数目的另ー种方法为通过将糖苷与多肽化学偶联或酶促偶联。例如，根据所采用的偶联方式，可将糖部分连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(C)游离巯基，例如半胱氨酸的巯基；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(e)芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。參见例如WO87/05330 以及 Aplin 和 Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem ，第 259-306 页，通过引用结合到本文中。在示例性实施方案中，将糖部分与精氨酸残基偶联以产生N联聚糖。在示例性实施方案中，利用细胞机器通过在宿主细胞中表达融合蛋白来将糖部分加入至引入的糖基化位点中。一般地，可在提供适当的糖基化的哺乳动物细胞系中表达融合蛋白，例如J1EK293或CHO细胞系，或其他哺乳动物表达细胞系。在某些实施方案中，可使用已工程改造为产生哺乳动物样糖基化的非哺乳动物宿主细胞(例如酵母、细菌或昆虫细胞)来将糖部分加入至引入的糖基化位点中。已开发具有遗传修饰的糖基化途径的细胞系，其执行模拟在人中加工糖蛋白的一系列酶反应。在这些工程改造细胞中表达的重组蛋白产生与它们的人对应物类似(如果不是基本相同的话)的糖蛋白(例如，哺乳动物样糖基化)。用于遗传修饰宿主细胞以改变表达的肽的糖基化概况的技术为众所周知的。參见例如 Altmann 等，(1999, Glycoconjugate J. 16: 109-123)，Ailor 等,(2000,Glycobiology 10(8): 837-847)，Jarvis 等，(In vitrogen Conference, 1999 年 3月，摘要)，Hollister 和 Jarvis, (2001, Glycobiology 11(1): 1-9),以及 Palacpac等，(1999，PNAS USA 96: 4697) , Jarvis 等，(1998. Curr. Opin. Biotechnol.9:528-533), Gemgross (美国专利公布号20020137134)，上述所有均公开了通过用糖基转移酶基因转染昆虫或植物细胞来“人源化”昆虫或植物细胞表达系统的技木。亦存在从遗传上改变在原核系统中表达的肽的糖基化概况的技木。已使用来自细菌脑膜炎奈瑟氏球菌{Neisseria meningitidis)和固氮根瘤菌属(Azorhizobium)的多种糖基转移酶工程改造大肠杆菌(瓦coli)以在体内产生寡糖(Bettler等，1999，Glycoconj. J. 16:205-212)。已基因工程改造为过表达脑膜炎奈瑟氏球菌P 1，3 Nこ酰氨基葡萄糖基转移酶Igta基因的大肠杆菌将有效地使外源乳糖糖基化(Priem等，2002，Glycobiology 12:235-240)。亦已将真菌细胞遗传修饰为产生外源糖基转移酶(Yoshida等，1999，Glycobiology, 9(1):53-58; Kalsner 等，1995， Glycoconj. J. 12:360-370;Schwientek 和 Ernst, 1994, Gene 145(2):299-303; Chiba 等，1995， Biochem J.308:405-409)。在某些实施方案中，表达本公开内容的Fe融合蛋白的宿主细胞可为表达ー种或多种外源糖基转移酶和/或一种或多种外源糖苷酶的真核或原核细胞，其中在宿主细胞中表达重组糖肽导致具有“人”聚糖结构的重组糖肽的产生。在一些实施方案中，用于细胞的异源糖基转移酶可选自例如在Taniguchi等(2002, Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes, Springer, N. Y.)中 ロ丁得的糖基转移酶家族列表中所包含的任何已知的糖基转移酶。在一些实施方案中，宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞，其中已灭活一种或多种内源糖基转移酶和/或一种或多种内源糖苷酶，使得在宿主细胞中表达重组糖肽导致具有“人”聚糖结构的重组糖肽的产生。在一些实施方案中，宿主细胞可表达异源糖基转移酶和/或糖苷酶，而同时ー种或多种内源糖基转移酶和/或糖苷酶为灭活的。可利用本领域技术人员已知的任何技术灭活内源糖基转移酶和/或糖苷酶，所述技术包括但不限于反义技术和包括将核酸插入宿主细胞基因组的技木。 在示例性实施方案中，本文所述糖变体融合蛋白相对于未修饰形式的融合蛋白具有增加的稳定性和/或增加的血清半寿期。在示例性实施方案中，相对于未修饰形式的融合蛋白，糖变体融合蛋白的血清半寿期增加至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%, 200%, 250% 或 300% 或更多。在某些实施方案中，在相同的动物模型或物种中测定修饰Fe融合蛋白和缺乏附加糖基化位点的融合多肽的血清半寿期以进行比较。在示例性实施方案中，如本文所述在药代动力学大鼠测定或药代动力学猴测定中測定血清半寿期(參见例如实施例4和5)。在示例性实施方案中，引入一个或多个非内源糖基化位点不会显著影响融合蛋白异源多肽部分的ー种或多种生物活性。例如，融合蛋白的异源多肽部分的ー种或多种生物活性可受少于10倍、5倍、3倍、2. 5倍、2倍、I. 5倍、I倍、0. 5倍或更小倍的影响。本文进ー步描述了异源多肽部分的生物活性的实例，包括例如蛋白质-蛋白质相互作用、配体结合、生理活性等。在示例性实施方案中，将ー个或多个非内源糖基化位点引入Fe融合蛋白的异源部分。Fe融合蛋白的异源部分可包括催 化结构域或配体结合域。本文所用的“配体结合域”是指蛋白质上与另一分子(例如配体)相互作用的区。例如，配体结合域可指蛋白质上被抗体结合的区、抗体上与抗原结合的区、受体上与配体结合的区、配体上与受体结合的区、第一多肽上与第二多肽结合的区、多肽上与小分子结合的区等。在示例性实施方案中，配体结合域为跨膜受体蛋白的胞外域中与配体结合的区。本文所用的“催化结构域”是指具有功能活性的区。催化结构域的实例包括例如激酶结构域、磷酸酶结构域、蛋白酶结构域等。在示例性实施方案中，将ー个或多个非内源糖基化位点引入柔性或松散的表面暴露区，例如连接a螺旋和/或0折叠的环区。一般而言，蛋白质为具有ニ级和三级结构的多肽链。多肽的ニ级结构包括将多肽链折叠成称为a螺旋和P折叠的两种常见结构域。蛋白质的三级结构由通过各种长度和不规则形状的环区连接的ニ级结构(a螺旋和P折叠)的组合组成。一般地，ニ级结构元件的组合形成稳定的疏水核，而环区存在于蛋白质表面。由于环区为溶剂暴露的，因此与内部的结构稳定的ニ级结构域(例如a螺旋和@折叠结构域)相比，其一般更易受到各种活性分子和蛋白质酶(例如蛋白酶)的亲核攻击/肽键切割。在某些实施方案中，可能需要除去融合蛋白异源多肽部分中的ー个或多个天然存在的糖基化位点(例如未修饰形式蛋白质中的糖基化位点)。例如，为了改变N联糖基化位点的间距，可能需要除去天然存在的糖基化位点井随后在所需位置引入两个非内源糖基化位点。此外，可能需要除去存在于融合蛋白中的ー个或多个天然存在的0联糖基化位点。可通过剔除共有氨基酸序列或者通过从氨基酸残基化学切割或酶促切割糖部分来除去N联和0联糖基化位点。例如，可如下除去N联糖基化位点通过在N联糖基化识别位点(即NXT/S)的第一个或第三个氨基酸位置之一或二者上取代或缺失氨基酸，和/或在三肽序列的第二位上缺失氨基酸。可通过添加、缺失或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基和/或如下所述破坏0联共有序列来除去0联糖基化位点。或者，可用化学法和/或酶法实现存在于多肽上的ー个或多个天然存在的糖部分的除去。化学去糖基化可包括例如将糖基化多肽暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等同化合物中。这种处理导致除连接糖(N-こ酰氨基葡萄糖或N-こ酰半乳糖胺)以外的大部分或所有糖被切割，同时保持氨基酸序列完整。化学去糖基化另由 Hakimuddin 等(1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 和由 Edge 等(1981) Anal. Biochem. 118:131描述。糖基化多肽上糖部分的酶促切割可通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶完成，如Thotakura等(1987) Meth. Enzymol. 138:350所述。在某些实施方案中，可能需要引入除一个或多个非内源N联糖基化位点之外的ー个或多个0联糖基化位点。可通过将0联糖基化共有序列引入多肽来向蛋白质中加入0联糖基化位点。示例性0联共有序列包括例如CXXGGT/S- C、NSTE/DA、NITQS、QS1QS、0/E-FI 1RZK-V、C-E/D-SN和GGSC- K/R。或者，可通过化学修饰多肽中的氨基酸来引入O联糖部分。参见例如 WO 87/05330 和 Aplin 和 Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem.,第259-306页，通过引用结合到本文中。在某些实施方案中，本文所述糖变体多肽可包含另外的结构域，例如前导序列、接头和/或纯化/鉴定标签。在一些实施方案中，融合蛋白可包含信号序列，例如蜜蜂蜂毒肽前导序列(honeybee mellitin leader, HBML) MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 10);组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 11);或(iii)天然前导序列。本公开内容的融合蛋白可任选包含接头结构域。在某些实施方案中，融合蛋白包含位于Fe结构域和异源多肽结构域之间相对松散的接头。该松散接头可为1、2、3、4或5 个氨基酸或者长度介于5和10、15、20、30、50个或更多个氨基酸之间相对缺乏二级结构的人工序列。接头可富含甘氨酸和脯氨酸残基，并可含有例如苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列或者苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列(例如TG3 (SEQ ID NO: 12)或SG3 (SEQID NO: 13)单一序列或重复序列)。在某些实施方案中，一个或多个引入的糖基化位点可位于接头结构域中。本公开内容的融合蛋白可包含促进融合蛋白的分离和/或检测的结构域。这类结构域的众所周知的实例包括但不限于聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可选择融合结构域以提供所需性质。例如，一些融合结构域特别可用于通过亲和层析法分离融合蛋白。为了亲和纯化的目的，使用用于亲和层析法的相关基质，例如谷胱甘肽缀合树脂、淀粉酶缀合树脂和镍缀合树脂或钴缀合树脂。这类基质的许多种可以“试剂盒”形式获得，例如Pharmacia GST纯化系统和可与(HIS6)融合配偶体一起使用的QIAexpress 系统(Qiagen)。作为另一个实例，可选择融合结构域以促进多肽的检测。这类检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如GFP)以及“表位标签”，其通常是短肽序列，可获得其特异性抗体。易获得其特异性单克隆抗体的众所周知的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点，例如允许相关蛋白酶部分消化融合蛋白，从而从中释放重组蛋白的因子Xa或凝血酶。然后，可通过随后的层析分离，从融合结构域分离出释放的蛋白质。要理解的是，融合蛋白的不同成分可以与所需功能性一致的任何方式排列。例如，可将Fe结构域置于异源多肽结构域的C端，或者，可将异源多肽结构域置于Fe结构域的C端。Fe结构域和异源结构域在融合蛋白中不必邻接，在任一结构域的C端或N端或者在结构域之间可包括另外的结构域或氨基酸序列。在某些实施方案中，糖变体融合蛋白可包含选自下列的一个或多个另外的修饰氨基酸残基聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。由于这类翻译后修饰，本文所述融合蛋白可含有非氨基酸成分，例如聚乙二醇、脂质和磷酸酯。对于这类翻译后活性，不同细胞(例如CHO、HeLa, MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有特定的细胞机器和特有机制，可选择不同细胞以确保本发明多肽的正确修饰和加工。
本公开内容的融合蛋白通常为较高分子量的，大小为至少30、40、50、60、70、80、90、100 或 110 kDa 或更大。在示例性实施方案中，本公开内容提供具有Fe结构域之外的至少一个非内源N联糖基化位点的TNFR2-FC糖变体融合蛋白。在某些实施方案中，本发明的糖变体融合蛋白可包含与选自SEQ ID NO: 18、21、22、23或24的氨基酸序列有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些情况下，糖变体融合蛋白具有与选自SEQ ID NO: 18、21、22、23或24的氨基酸序列有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文所述糖变体Fe融合蛋白不含ActRIIb受体的胞外域和/或抗体的可变区。Fe结构域
本文所述糖变体融合蛋白包含与异源多肽融合的免疫球蛋白重链Fe结构域。已知具有免疫球蛋白Fe部分的融合物赋予多种蛋白质所需的药代动力学性质。本文所用的术语 “Fe区”或“Fe结构域”是指免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fe区和变体Fe区。虽然免疫球蛋白重链Fe区的边界可能变化，但是通常将人IgG重链Fe区定义为从Cys226位或从Pro230位的氨基酸残基延伸至免疫球蛋白羧基端。例如如果重组工程改造编码抗体重链的核酸，则可除去Fe区的C端赖氨酸(根据EU编号系统为残基447)。除非另有指示，否则本文免疫球蛋白重链的残基编号为Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991)中的EU索引的编号，所述文献通过引用明确地结合到本文中。“Kabat中的EU索引”是指人IgGl EU抗体的残基编号。“天然序列Fe区”包含与自然中发现的Fe区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe区包括天然序列人IgGl Fe区(非A异型和A异型)；天然序列人IgG2 Fe区；天然序列人IgG3 Fe区；和天然序列人IgG4 Fe区及其天然存在的变体。“变体Fe区”包含由于至少一个氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而与天然序列Fe区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选与天然序列Fe区或与亲代多肽的Fe区相比，变体Fe区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fe区或在亲代多肽的Fe区有约I-约10个氨基酸取代，和优选约I-约5个氨基酸取代。优选本文的变体Fe区与天然序列Fe区和/或亲代多肽的Fe区具有至少约80%同源性，最优选至少约90%同源性，更优选至少约95%同源性。在优选的实施方案中，本文所述Fe融合蛋白具有与免疫球蛋白Fe结构域C端部分的N端融合的异源部分。优选将以恰好位于木瓜蛋白酶切割位点(例如，使重链恒定区的第一个残基为114)或其他免疫球蛋白的类似位点上游的铰链区开始的序列用于融合。在一个实施方案中，将异源结构域与IgGl、IgG2或IgG3重链的铰链区、CH2和CH3或CH1、铰链、CH2和CH3结构域融合。在一些实施方案中，进行融合的确切位点不重要，可通过常规试验确定最佳位点。对于人Fe结构域，优选使用人IgGl和IgG3免疫球蛋白序列。使用IgGl的主要优势为，可在固定化A蛋白上有效纯化IgGl融合蛋白。相比之下，IgG3融合蛋白的纯化需要G蛋白，一种通用性显著更少的介质。然而，如果选择用于特定构造的Ig融合配偶体，则应考虑免疫球蛋白的其他结构性质和功能性质。例如，IgG3铰链更长且更可变，所以其可容纳较大的异源部分，该异源部分与IgGl融合时不可折叠或不可正确发挥作用。另一个考虑可为化学价；IgG免疫粘附素为二价同二聚体，而如IgA和IgM的Ig亚型分别可产生基础Ig同二聚体单元的二聚或五聚结构。对设计用于体内施用的Fe融合蛋白而言，由Fe区规定的药代动力学性质和效应子功能也是重要的。虽然IgGl、IgG2和IgG4的体内半寿期均为21天，但是其激活补体系统的相对功效不同。IgG4不激活补体，IgG2在补体激活方面显著弱于IgGl。此外，与IgGl不同，IgG2不与单核细胞或中性白细胞上的Fe受体结合。虽然IgG3最适于补体激活，但是其体内半寿期大约为其他IgG同种型的1/3。对于设计以用作人治疗药的Fe融合蛋白的另一个重要考虑为特定同种型的异型变体数目。一般而言，优选具有较少血清学限定的异型的IgG同种型。例如，IgGl仅具有四个血清学限定的异型位点，其中两个位点(GIm和2)位于Fe区；并且这些位点之一的Glml
为非免疫原性的。相比之下，IgG3中有12个血清学限定的异型，全部都在Fe区中；这些位点中仅三个位点(G3m5、ll和21)具有一个非免疫原性异型。因此，IgG3融合蛋白的潜在免疫原性大于IgGl融合蛋白的潜在免疫原性。在某些实施方案中，与野生型Fe结构域相比，用于Fe融合蛋白的Fe结构域可包含一个或多个改变。然而这些Fe结构域基本上保留与其野生型对应物相同的治疗效用所需的特征。例如，认为可在Fe区进行某些改变，其将引起CIq结合和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)改变(即改善或减小)，例如，如W099/51642所述。亦参见关于Fe区变体的其他实例的 Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988);美国专利号 5，648，260;美国专利号 5，624，821 和 W094/29351。W000/42072 (Presta)和 WO 2004/056312 (Lowman)描述了与FcR的结合改善或降低的抗体变体。这些专利出版物的内容通过引用具体地结合到本文中。亦参见 Shields 等 J. Biol. Chem. 9(2) : 6591-6604 (2001)。US2005/0014934A1(Hinton等)描述了半寿期增加且与新生儿Fe受体(FcRn)结合改善的抗体,所述受体负责将母体 IgG 转移给胎儿(Guyer 等，J. Tmmuno 1. 117:587 (1976)和 Kim 等，J. Tmmuno I.24:249 (1994))。这些抗体包含其中具有改善Fe区与FcRn的结合的一个或多个取代的Fe区。美国专利号6，194，551和国际公布号冊99/51642描述了具有改变的？(区氨基酸序列和CIq结合能力增加或减少的多肽变体。亦参见Idusogie等J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)。这些参考的内容通过引用具体地结合到本文中。以下显示了示例性Fe结构域。THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPR
EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK* (例如 SEQ ID NO: 14)
以下显示了组合的有利接头(TG3)与Fe结构域的实例
TGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 18)
任选Fe结构域在例如Asp-265、赖氨酸322和Asn_434残基上具有一个或多个突变。在某些情况下，相对于野生型Fe结构域，具有一个或多个这些突变(例如Asp-265突变)的突变型Fe结构域与Fcy受体的结合能力减小。在其他情况下，相对于野生型Fe结构域，具有一个或多个这些突变(例如Asn-434突变)的突变型Fe结构域与I类MHC相关Fe受体(FcRN)的结合能力增加。异源多肽
本文所述糖变体融合蛋白亦包含与Fe结构域直接或间接融合的异源多肽部分。异源多肽部分可以是任何多肽。在示例性实施方案中，异源多肽部分的分子量至少为10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 或 100 kDa 或更大。异源多肽部分可为治疗用蛋白质或其片段，例如生长因子、酶、血清酶、内分泌因子例如GLP1、骨形态发生蛋白和可溶性受体片段。示例性异源多肽包括生长因子，例如肝细胞生长因子(HGF)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(例如TGF-a、TGF-P、TGF-P 2、TGF- ^ 3)、血管内皮生长因子(VEGF ;例如VEGF-2)、干扰素(例如INF-a、INF-^ )和胰岛素。其他示例性异源多肽包括酶，例如a半乳糖苷酶(例如Fabrazyme )。其他示例性异源多肽包括骨形态发生蛋白(BMP)、红细胞生成素(EPO)、肌肉生长抑制素和肿瘤坏死因子(例如TNF-a)。其他示例性异源多肽包括跨膜受体的胞外域，包括细胞受体的任何天然存在的胞外域及其任何变体(包括突变型、片段和肽模拟形式)。在示例性实施方案中，异源多肽部分为来自TNF/NGF受体家族的受体的胞外域。可溶性受体多肽的实例包括例如本公开内容的SEQ ID NO: 2、5、6、7或8。在优选的实施方案中，具有至少一个非内源N联糖基化位点的糖变体融合蛋白包含的胞外受体结构域保留结合天然存在受体的配体的能力。在某些实施方案中，在胞外受体结构域的配体结合袋之外引入非内源N联糖基化位点。优选引入的糖基化位点的糖基化不会显著影响受体蛋白与可溶性配体的结合。在示例性实施方案中，引入的糖基化位点的糖基化不会使胞外受体结构域与其配体的结合减少超过10倍、5倍、3倍、2. 5倍、2倍、I. 5倍、I倍、0. 5倍或更小倍。优选包含至少一个非内源N联糖基化位点的可溶性受体结构域将以少于I 或者少于100、10或I nM的解离常数与指定配体结合。在一个实施方案中，本文所述糖变体融合蛋白包含以下异源多肽部分，所述 异源多肽部分包含来自神经生长因子(NGF)/肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的受体的胞外域。参见例如 M. Lotz 等，J. Leukocyte Biology, 60: 1-7 (1990)。NGF/TNF 受体家族包括例如神经生长因子受体(NGFR)、TNFRl (或TNFR55)、TNFR2 (或TNFR75)、TNF受体相关蛋白(TNFRrp)、CD40、Hodgkin 抗原 CD30、T 细胞抗原 CD27、Fas/AP0-l、0X_40 和 4-1BB/ILA。在示例性实施方案中，本文所述融合蛋白包含具有至少一个非内源N联糖基化位点的TNFR2的胞外域。本文所用的术语“TNFR2”是指来自任何物种的2型肿瘤坏死因子受体(TNFR2)蛋白家族以及通过诱变或其他修饰衍生于这类TNFR2蛋白的变体。TNFR2家族成员一般为跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸区的配体结合胞外域、跨膜结构域和具有预测的胞内信号转导活性的胞质结构域组成。术语“TNFR2多肽”包括包含TNFR2家族成员的任何天然存在的多肽及其保留有用活性的任何变体(包括突变型、片段、融合物和肽模拟形式)的多肽。例如，TNFR2多肽包括来源于任何已知TNFR2序列、具有以下序列的多肽，所述序列与TNFR2多肽序列有至少约80%同一性、优选至少85%、90%、95%、97%、99%或更大同一性。例如，本发明的TNFR2多肽可与TNFa或TNFP结合并抑制TNFR2蛋白和/或TNF a或TNFP的功能。TNFR2多肽的实例包括人TNFR2前体多肽(SEQ ID NO: I)和可溶性人TNFR2多肽(例如SEQ ID NO: 2、5、
6、7 或 8)。人TNFR2前体蛋白序列如下
权利要求
1.一种用于制备编码修饰Fe融合蛋白的修饰核酸的方法，所述修饰Fe融合蛋白相对于最初Fe融合蛋白具有延长的血清半寿期，其中修饰Fe融合蛋白和最初Fe融合蛋白各自包含Fe部分和异源部分，所述方法包括修饰编码最初Fe融合蛋白的异源部分的核酸，以编码ー个或多个附加的N联糖基化位点，其中(a)修饰的核酸编码以下修饰Fe融合蛋白，其在合适细胞培养物中表达时，具有比最初Fe融合蛋白的血清半寿期至少长10%的血清半寿期，如在药代动力学猴测定中所測定的；和(b)相对于未修饰Fe融合蛋白，修饰Fe融合蛋白具有基本上相同或更高的体内生物活性。
2.权利要求I的方法，其中将一个或多个附加的N联糖基化位点引入表面暴露的异源部分的一个或多个氨基酸序列中。
3.权利要求2的方法，其中将一个或多个附加的N联糖基化位点引入表面暴露且未掺入^折叠或a螺旋中的异源部分的一个或多个氨基酸序列中。
4.权利要求1-3中任ー项的方法，其中所述异源部分包含配体结合域。
5.权利要求4的方法，其中所述配体结合域来源于跨膜受体的胞外域。
6.权利要求4或5的方法，其中在异源部分的以下位置上引入一个或多个附加的N联糖基化位点，所述位置使得任何附加的糖部分基本上不会干扰配体结合域。
7.权利要求4-6中任ー项的方法，其中在以下位置引入一个或多个附加的N联糖基化位点，所述位置使得配体结合域的氨基酸序列不被修饰。
8.权利要求4-7中任ー项的方法，其中在以下位置引入一个或多个附加的N联糖基化位点，所述位置使得与附加的N联糖基化位点连接的任何糖部分被预测为基本上不会干扰配体结合界面。
9.权利要求4-8中任ー项的方法，其中修饰Fe融合蛋白与配体结合的半数最大抑制浓度(IC5tl)不小于最初Fe融合蛋白的1/2。
10.权利要求1-9中任ー项的方法，其中通过添加或缺失至少ー个氨基酸残基以引入至少ー个糖基化位点，来修饰最初Fe融合蛋白。
11.权利要求1-10中任ー项的方法，其中通过取代至少ー个氨基酸残基以引入至少ー个糖基化位点，来修饰最初Fe融合蛋白。
12.权利要求1-11中任ー项的方法，其中最初Fe融合蛋白的异源部分包含通过表面暴露的松散多肽区连接的至少两个结构上不同的a螺旋和/或P折叠结构域。
13.权利要求12的方法，其中将附加的N联糖基化位点置于松散的肽区之内。
14.权利要求1-13中任ー项的方法，其中最初Fe融合蛋白的异源部分的每90个氨基酸中包含少于ー个N联糖基化位点。
15.权利要求1-14中任ー项的方法，其中最初Fe融合蛋白的异源部分的每125个氨基酸中包含少于ー个N联糖基化位点。
16.权利要求1-15中任ー项的方法，其中修饰Fe融合蛋白的异源部分的每90个氨基酸中包含至少ー个N联糖基化位点。
17.权利要求1-16中任ー项的方法，其中修饰Fe融合蛋白的异源部分的每65个氨基酸中包含至少ー个N联糖基化位点。
18.权利要求1-17中任ー项的方法，其中通过至少20个氨基酸将与N联糖基化连接的修饰Fe融合蛋白异源部分的每个氨基酸与任何其他被N联糖基化修饰的氨基酸隔开。
19.权利要求1-18中任ー项的方法，其中最初Fe融合蛋白还包含不含N联糖基化位点的在Fe部分和异源部分之间的多肽接头。
20.权利要求1-18中任ー项的方法，其中修饰Fe融合蛋白包含置于接头之内的N联糖基化位点。
21.权利要求1-20中任ー项的方法，其中所述异源部分包含含有配体结合域的TNFR2受体的胞外域。
22.权利要求21的方法，其中TNFR2受体的胞外域包含与SEQID NO: 2有至少90%同一性的氨基酸序列。
23.ー种用于制备相对于最初Fe融合蛋白血清半寿期延长的修饰Fe融合蛋白的方法，所述方法包括 (a)在提供哺乳动物或哺乳动物样糖基化的细胞培养物中表达根据权利要求1-22中任ー项的方法制备的修饰核酸；和 (b)从细胞培养物中回收修饰的Fe融合蛋白。
24.权利要求23的方法，其还包括纯化修饰的Fe融合蛋白的步骤。
25.权利要求24的方法，其中纯化修饰的Fe融合蛋白的步骤包括将修饰的Fe融合蛋白暴露给A蛋白并回收与A蛋白结合的修饰Fe融合蛋白。
26.权利要求23-25中任ー项的方法，其还包括将修饰Fe融合蛋白配制用于给予患者。
27.权利要求23的方法，其中通过哺乳动物细胞系表达修饰核酸。
28.权利要求27的方法，其中所述哺乳动物细胞系选自CHO细胞系、NSO细胞系、COS细胞系和J1EK236细胞系。
29.权利要求23、27或28中任ー项的方法，其中在产生包含唾液酸的N联糖部分的细胞系中表达修饰核酸。
30.权利要求23或29的方法，其中通过已工程改造为提供哺乳动物或哺乳动物样糖基化的非哺乳动物细胞来表达修饰核酸。
31.权利要求30的方法，其中所述细胞系来源于真菌细胞、昆虫细胞或植物细胞。
32.—种细胞系，其包含根据权利要求1-22中任ー项的方法制备的修饰核酸。
33.一种修饰Fe融合蛋白，其根据权利要求23-32中任ー项的方法制备。
34.ー种包含免疫球蛋白Fe结构域和至少ー个异源多肽结构域的融合蛋白，其中在免疫球蛋白Fe结构域之外修饰所述融合蛋白，以引入至少ー个非内源N联糖基化位点，以及其中如在药代动力学猴测定中所測定，相对于缺乏引入的糖基化位点的融合蛋白的血清半寿期，在一个或多个引入的糖基化位点的糖基化使修饰融合蛋白的血清半寿期増加至少10%。
35.权利要求34的融合蛋白，其中所述异源多肽结构域包含受体的胞外域的至少一部分，所述部分包含配体结合域。
36.权利要求35的融合蛋白，其中在配体结合袋之外的胞外域引入糖基化位点。
37.权利要求35或36的融合蛋白，其中在一个或多个引入的糖基化位点的糖基化对受体的配体结合活性的影响不超过3倍。
38.权利要求34-37中任ー项的融合蛋白，其中通过添加或缺失至少ー个氨基酸残基以弓I入至少ー个糖基化位点，来修饰融合蛋白。
39.权利要求34-38中任ー项的融合蛋白，其中通过取代至少ー个氨基酸残基以引入至少ー个糖基化位点，来修饰融合蛋白。
40.权利要求34-39中任ー项的融合蛋白，其中异源多肽结构域的分子量至少为25kDa0
41.权利要求34-40中任ー项的融合蛋白，其中相对于缺乏引入的糖基化位点的融合蛋白的血清半寿期，在一个或多个引入的糖基化位点的糖基化使融合蛋白的血清半寿期增加至少20%。
42.权利要求34-41中任ー项的融合蛋白，其中未修饰异源多肽结构域的每90个氨基酸中包含少于ー个N联糖基化位点。
43.权利要求34-41中任ー项的融合蛋白，其中未修饰异源多肽结构域的每125个氨基酸中包含少于ー个N联糖基化位点。
44.权利要求34-41中任ー项的融合蛋白，其中修饰异源多肽的每90个氨基酸中包含至少ー个N联糖基化位点。
45.权利要求34-41中任ー项的融合蛋白，其中修饰异源多肽的每65个氨基酸中包含至少ー个N联糖基化位点。
46.权利要求34-45中任ー项的融合蛋白，其中通过至少20个氨基酸将N联糖基化修饰的各个氨基酸与任何其他被N联糖基化修饰的氨基酸隔开。
47.权利要求34-46中任ー项的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含在Fe结构域和异源多肽结构域之间的多肽接头。
48.权利要求47的融合蛋白，其中至少ー个引入的糖基化位点位于接头中。
49.权利要求34-48中任ー项的融合蛋白，其中Fe融合蛋白的异源部分包含通过表面暴露的松散多肽区连接的至少两个结构上不同的a螺旋和/或0折叠结构域。
50.权利要求49的融合蛋白，其中将引入的糖基化位点置于松散的肽区之内。
51.权利要求35-50的融合蛋白，其中所述受体为神经生长因子/肿瘤坏死因子受体家族的成员。
52.权利要求51的融合蛋白，其中所述受体为TNFR2受体。
53.权利要求52的融合蛋白，其中TNFR2受体的胞外域包含在选自SEQID NO: 2的Q26、D25、A28、E133或G231的一个或多个氨基酸残基上的氨基酸取代。
54.权利要求53的融合蛋白，其中TNFR2受体的胞外域在SEQID NO: 2的26位氨基酸上包含Q — N取代，和在SEQ ID NO: 2的28位氨基酸上包含A — S取代。
55.权利要求53的融合蛋白，其中TNFR2受体的胞外域在SEQID NO: 2的25位氨基酸上包含D —N取代，和在SEQ ID NO: 2的133位氨基酸上包含E — N取代。
56.权利要求53的融合蛋白，其中TNFR2受体的胞外域在SEQID NO: 2的25位氨基酸上包含D — N取代，和在SEQ ID NO: 2的231位氨基酸上包含G — N取代。
57.权利要求53-56中任ー项的融合蛋白，其中TNFR2受体的胞外域与SEQID NO: 2的氨基酸序列有至少90%同一‘注。
58.权利要求57的融合蛋白，其中TNFR2受体的胞外域与SEQID NO: 2的氨基酸序列有至少95%同一性。
59.权利要求58的融合蛋白，其中TNFR2受体的胞外域与SEQID NO: 2的氨基酸序列有至少99%同一性。
60.权利要求53的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自以下的异源结构域 a)包含SEQID NO: 5的13-257位氨基酸的多肽； b)包含SEQID NO: 6的13-257位氨基酸的多肽； c)包含SEQID NO: 7的13-257位氨基酸的多肽；和 d)包含SEQID NO: 8的13-257位氨基酸的多肽。
61.权利要求60的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含具有SEQID NO: 18的氨基酸序列的接头和Fe部分。
62.ー种药物制剂，其包含权利要求34-61中任ー项的融合蛋白和药学上可接受的载 体，其中所述制剂基本上无致热物质，以便适于给予哺乳动物。
全文摘要
本文提供了具有增加的血清半寿期的糖变体Fc融合蛋白。亦提供了通过引入一个或多个非内源糖基化位点来增加Fc融合蛋白的血清半寿期的方法。
文档编号C12N15/62GK102770458SQ201080062928
公开日2012年11月7日 申请日期2010年12月2日 优先权日2009年12月2日
发明者J.克诺普夫, J.西拉, R.库马 申请人:阿塞勒隆制药公司