专利名称：用于将细胞种植到三维支架上的系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种系统，包括在准备用于植入时从来源(例如个体)收集、分离细胞和将细胞直接种植到生物相容性支架上的装置和方法。
背景技术：
血管和心胸外科医生使用血管移植物修复或替换因外伤或疾病(例如动脉瘤、动脉粥样硬化和感染)而被削弱、损坏或阻塞的动脉和静脉血管部段。历史上，血管移植物已经为同种移植物例如患者自身的大隐静脉或乳内动脉，由合成材料例如聚酯(例如，涤纶)、扩展特氟龙(ePTFE)和其它复合材料制成的假体移植物，或者新鲜的或固定的生物组织移植物。但是，合成移植物通常具有对很多用途的不足的通畅率，而收获同种移植物需要费时的、昂贵的和创伤患者的漫长手术。固定的组织移植物不容许由宿主细胞渗透和占据，而宿主细胞渗透和占据对于重塑和组织维护而言是重要的。因此，固定的组织移植物随着时间退化并且最终将导致故障。由于这些目前可得的合成和生物移植物的不足以及同种移植物的高成本和有限供给，正开发组织工程移植物，其被灭菌、随后在体外使用细胞进行种植和培养。这些组织工程移植物可以显示天然动脉和血管的长期尺寸稳定性和通畅性而具有正常的生理功能，优于用于在替换疗法中使用的其它移植物。历史上，除了培养组织工程移植物以外，细胞的分离和种植通常需要使用无菌环境，例如罩或专用设施例如ISO第7类室。但是，在这种环境中存在种植和培养组织的缺点。例如，这些系统可能对于使用者而言是繁琐的、不方便的、使用起来耗费时间、并且构建和维护起来非常昂贵。由此，本领域中存在对于容许方便的、无菌分离、收集和种植组织工程移植物和其他假体装置的组成和方法的需求。
发明内容
本文所述的是一种系统，优选地，封闭的无菌系统，所述系统包括装置和方法，以用于从来源优选地从目标分离和收集细胞(例如源自骨髓的祖细胞例如单核细胞)，并且随后将这些细胞种植到生物相容性的三维支架或组织移植物上。所述支架或移植物能够在用于培养、输送、存储、测试的系统内例如作为组织移植物(例如血管移植物)培育和/或植入到目标内，以在体内、体外或离体地再生和/或修复组织。根据本发明，提供了一种用于分离和种植、培养、存储、运输和测试在封闭和无菌系统内的血管移植物的装置和方法，其不需要专用罩或洁净室。在某些方面，本发明提供了用于使用人类细胞种植和培养血管移植物的装置和方法，从而得到由活性人类细胞占据的组织工程血管移植物。在某些方面，本发明提供了一种封闭的、一次性系统，所述系统使用过滤/洗脱技术分离期望的细胞类型，并且使用真空种植将细胞种植到三维生物相容性支架上。所述被种植的支架随后能够被培育，并且当准备使用时从所述系统中移除。因此，在一个方面，提供了一种用于种植细胞的系统，包括细胞分离流体容器；设置在所述细胞分离流体容器与收集流体容器、洗脱流体容器以及种植容器之间的流动通道，其中，所述流动通道包括入口、出口和介于所述入口和所述出口之间的过滤器，其中，所述过滤器适于容许沿至少两个方向的流动，并且其中，所述流动通道分别与所述细胞分离流体容器、所述收集流体容器、所述洗脱流体容器和所述种植容器中的每一个选择性地流体连通。在某些实施例中，所述种植容器包括多孔管或穿孔管(例如穿孔芯棒)以及设置在所述管的至少一部分附近的生物相容性三维支架。在某些另外的实施例中，所述系统包括与所述种植容器流体连通的残留种植细胞流体容器以及与所述残留种植细胞流体容器流 体连通的真空源。在另一方面，提供了用于使用如本文所述的用于种植细胞的系统的方法。本发明还提供了本文所述的任意发明。前面的实用性的常见领域仅作为示例给出而非意为限制本公开和所附权利要求的范围。鉴于示例实施例、描述和示例，本领域的技术人员将明白本发明的另外的目的和优点。例如，本发明的各个方面和实施例可以利用为多种组合，所有这些均由本说明书明确地构想。这些另外的优点、目的和实施例明确地包括在本发明的范围内。
结合到说明书内且形成说明书的一部分的附示了本发明的若干实施例，并且连同描述一起用来解释本发明的原理。附图仅仅用于图示本发明的实施例的目的而非意为理解为限制本发明。从下面的详细说明，结合示出了本发明的示例性实施例的附图，本发明的另外的目的、特征和优点将变为明显，在附图中图I展示了如本文所述的示例系统。简要地，(i)骨髓抽吸物(例如，5cc/kg体重)被无菌收集且注入细胞分离流体容器(3)内；(ii)利用重力，使骨髓抽吸物穿过包括过滤器的流动通道(7)，所述过滤器在所述抽吸物从所述过滤器介质的上游表面流动通过所述滤器介质的下游表面时捕获源自骨髓的单核细胞；(iii)所述骨髓抽吸物的剩余部分(其典型地主要包括血浆，但是可以包括红血细胞和/或血小板)被收集在收集流体容器(13)中；(iv)位于洗脱流体容器(9)中的洗脱溶液穿过流动通道(7)，其中，所述洗脱溶液从所述过滤器介质的下游表面流动通过所述介质的上游表面，并且进入种植容器(18)内，使得所述过滤器释放收集在所述种植容器中的源自骨髓的单核细胞；(V)所述种植容器(18)包括插入到穿孔芯棒(20)上的支架；(vi)源自骨髓的单核细胞悬浮液填充所述种植容器,从而完全覆盖被插入到所述穿孔芯棒(20)上的支架；(vii)真空(例如，-20mmHg)被施加，直到所有细胞悬浮液已经穿过支架且被收集在至少一个残留种植细胞流体容器(35a,35b)中为止；以及(viii)被过滤的骨髓吸出物(典型地主要包括血浆)经由重力的作用从所述收集容器(13)流动到种植容器(18)内，所述种植容器(18)包括所述被种植的支架’由此冲洗所述被种植的支架。图IA为在图I中所示的种植容器(18)的立体图，图示了位于种植容器中的细胞悬浮液，其中，悬浮液与支架相接触。图2展示了用于与本文所述的示例性系统一起使用的示例性芯棒设计。简要地，
(i)所述穿孔芯棒(20)的敞开端部(126)被插入到抽吸杆(23)上；(ii)所述合适尺寸的联接环(123)随后被插入到所述穿孔芯棒上；以及(iii)所述合适尺寸的支架随后被插入到所述装置上并且被固定。图3图示了能够根据本发明的实施例使用的另一种植容器(18)。
具体实施方式
下面是提供用于帮助本领域的技术人员实施本发明的对本发明的详细描述。本领域的普通技术人员可以在不偏离于本发明的精神或范围的情况下对本文所述的实施例进行修改和改变。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的技术人员共同理解的相同含义。在本文的发明的描述中使用的术语仅仅用于描述特定实施例，而非旨在限制本发明。本文提及的所有公布、专利申请、专利、附图和其他参考文献的全部内容通过参引的方式明确并入本文。本文描述的是一种系统，优选地，封闭的无菌系统，所述系统包括用于分离和收集细胞(例如源自骨髓的祖细胞例如单核细胞)的装置和方法，这些细胞被种植到生物相容性三维支架上、被培育并且随后能够例如被植入以例如作为组织移植物(例如血管移植物)。在某些实施例中，所述系统利用过滤/洗脱技术以用于无菌分离细胞、将细胞种植和培育到三维支架上。占据生物相容性支架的无菌分离细胞能够被培养并且在存储、运输和/或测试来自个体的细胞中被采用。可选地，由活性分离细胞占据的支架能够被培养，并且用作例如可植入移植物(例如血管移植物)，以在体内、体外或离体地再生和/或修复组织。由此，本发明的一个优点在于其提供了一种方便的、较低成本的系统，所述系统用于无菌分离细胞、将细胞种植且培养到支架上而不需要罩或专用设施例如ISO第7类室。另一优点在于所述方法能够比使用罩或专用设施的常规方法更快地执行。有利地，例如，所述方法能够在几小时内执行，例如大约5小时或更少，优选到，大约3小时或更少，甚至更优选地，大约两(2)小时或更少。当提供数值范围时，应当理解的是，介于该范围的上限与下限之间的每个中间值(除非上下文另外清楚地指出，到下限的单元的十分之一)以及在所述范围中的任意其他表述或中间值包括在本发明内。这些更小范围的上限和下限(其可以独立地包括在更小范围内)也包括在本发明内，除所述范围内的任意专门排除的极限。当所述范围包括这些极限中的一个或两个时，排除那些被包括在内的极限中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。现在描述优选的方法和材料，但与本文所述的那些相似或等同的任意方法和材料也能够在本发明的实施或测试中使用。本文提及的所有公布通过参与的方式并入本文，以公开和描述与所引述的公布相关的方法和/或材料。必须注意的是，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“和”、以及“该”包括复数引用，除非上下文清楚地另外表述。本文所用的所有技术和科学术语具有相同的含义。I.示例性定义除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的技术人员共同理解的含义。下面的参考文献(其所有公开内容通过参引的方式并入本文)向技术人员提供了在本发明中所用的很多术语的一般定义辛格尔顿等人，微生物学和分子生物学词典(第二版，1994 年)(Singleton et al. , Dictionary of Microbiology andMolecular Biology (2nd ed. 1994));剑桥科技词典(沃克编著，1988 年)(The CambridgeDictionary of Science and Technology (Walker ed.，1988));遗传学词汇，第 5 版，R. HH格等(编著)，施普林格出版社(1991 年)(The Glossary of Genetics, 5th Ed. , R. Rieger etal. (eds.), Springer Verlag (1991));以及黑尔&马汉姆,哈拍柯林斯生物学词典(1991年)(Hale&Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology(1991))。如本文所用，除非另有规定，下面的术语可以具有以下含义。但是，应当理解的是，由本领域的普通技术人员 已知或理解的其他含义也是可能的，并且落在本发明的范围内。本文所提及的所有公布、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容通过参引的方式并入本文。在冲突的情况下，包括定义的本说明书优先。另外，材料、方法和示例仅仅是说明性的而非意为限制性的。为了可以更容易地理解本发明，首先定义特定的术语。术语“芯棒”可以指的是但不限于圆筒形装置或管，例如金属棒，其用作芯部，围绕该材料，例如用于种植和生长细胞的基体支架可以铸造、模制成型、锻造、弯曲、或另外地定形。在某些实施例中，本文所述的芯棒在至少一个端部上为敞开的。在另外的实施例中，本文所述的芯棒也可以包括沿着其轴线(即，沿着其长度)的孔或穿孔。术语“阀”可以指的是但不限于一种装置或装置的一部分，通过所述装置，液体、气体或松散材料的流动可以例如通过活动部件而被起动、停止或调节，所述活动部件打开、关闭或部分地阻塞一个或多个端口(例如，入口或出口)或通路。术语“生物相容性的”可以指的是但不限于身体通常在不出现大的免疫反应的情况下接受的材料，所述材料能够在不导致过多纤维化或排斥反应的情况下被植入到生物系统中，例如组织植入物。术语“可生物降解的”可以指的是但不限于由活有机体的作用将物质或材料分解成无害物质的能力。术语“聚合物”可以指的是但不限于由五个或更多个相同组合单元(称为单体)的化学结合形成的大分子。在大多数情况下，单体的数目很大并且常常不能精确地知道。在合成聚合物中，该数目可以被控制到预定的程度。组合两个、三个、或四个单体被分别称为二聚体、三聚体、和四聚体，并且被统称为低聚物。聚合物可以为无机的(例如，硅氧烷、链硫、黑磷、硼-氮、聚硅氧烷)或有机的(指的是含有碳)。有机聚合物可以为天然的(例如，多糖类，例如淀粉、纤维素、果胶、海藻胶、植物胶；多肽，例如酪蛋白、白蛋白、球蛋白、角蛋白、胰岛素、DNA;以及烃类，合成的(例如，热塑性塑料(例如，未硫化的弹性体、尼龙、聚氯乙烯、线性聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯、丙烯酸树脂)；热固性塑料(例如，硫化弹性体、交联聚乙烯、酚醛树脂、醇酸树脂、聚酯)，和半合成的(例如，纤维素例如人造丝、甲基纤维素、醋酸纤维素；以及改性淀粉)。
术语“均聚物”可以指的是但不限于源自单一单体的天然或合成聚合物。术语“杂聚物”可以指的是但不限于源自多于一种的单体亚单元的天然或合成聚合物(即，共聚物)。除非另有说明，术语“聚合物”通常用来指代如本文所述的均聚物和杂聚物(即，共聚物)。术语“水溶性纤维素化合物”可以指的是但不限于纤维素化合物系，其是由阴离子硫酸盐基团(其能够由-SO3-表示)替代到不同程度的重复葡萄糖单元的长链大分子。由本发明包括的水溶性纤维素化合物的分子量典型地在从大约5X 105g/mol到大约3X IO6g/mol的范围中。每个葡萄糖单元的羟基基团能够以一个至三个硫酸基团替代。磺化使得不溶性纤维素具有水溶解度。未替代的羟基基团的存在提供了用于水溶性纤维素硫酸盐的交联的反应活性部位。硫酸基团的负电荷由阳离子种类的正电荷平衡，阳离子典型地为碱金属阳离子，并且优选地为钠阳离子。在某些实施例中，形成支架的该聚合物基体能够另外地
包括水溶性纤维素化合物,例如NaCS。术语“胶原蛋白”可以指的是但不限于细胞外的、紧密相关的蛋白质系中的任一个，其发生作为结缔组织的主要成分，从而向其提供强度和柔性。存在至少十四(14)种类型，每种包括原胶原蛋白单元，其与局部化于不同的组织、阶段或功能的类型共享共同的三重螺旋形状，但是其在不同类型之间的组合略有不同。在某些类型中，包括最常见的I型，原胶原蛋白杆相关联以形成原纤维或纤维；在其他类型中，杆不是纤维状的而与纤维状胶原蛋白相关联，而在其他类型中它们形成非纤维状的、非周期性的但结构化的网。胶原蛋白的基本结构单元、原胶原蛋白包括由三个多肽链构成的螺旋形结构，每个链包括大约一千个氨基酸，围绕彼此缠绕以形成螺旋且通过链间和链内共价键稳定。其富含甘氨酸(作为三个中的近一个残基发生)、以及三脯氨酸、羟脯氨酸和羟基赖氨酸；后两个很少在其他蛋白中发生。术语“微米级纤维”或“微米尺度纤维”可以指的是但不限于直径在从大约I微米(I(T6HI)至大约1000微米的范围中的纤维。术语“纳米级纤维”或“纳米尺度纤维”可以指的是但不限于直径范围为从大约I纳米(10_9m)至大约1000纳米的纤维。在某些实施例中，可降解聚合物从由聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、或聚(己内酯)、聚酰胺、多糖和胶原蛋白构成的组中选取。在优选实施例中，该聚合物为聚(乳酸-乙醇酸)。如本文所用，术语“聚(乙醇酸)”、聚乙交酯和“PGA”在本文互换地使用以指代可生物降解的热塑性聚合物和最简单的线性脂肪族聚酯。PGA也可以例如从Sigma-Aldrich公司商业上获得。“聚乳酸”是源自乳酸的可生物降解聚合物。聚(丙交酯)或PLA以两种立体形式存在，由D或L象征右旋或左旋，或由DL象征外消旋混合物。术语“PLLA”指的是可生物降解的脂肪族聚酯均聚物的聚L-乳酸。PLLA可以例如从Alkermes公司商业上获得。术语聚(乳酸-乙醇酸)、聚(D，L-丙交酯-C-糖苷)以及PLGA互换地使用以指代聚乳酸和乙醇酸的共聚物。PLGA可以例如从Alkermes公司商业上获得。如本文所用，术语“多糖”是由链接的单糖(单糖)(例如葡萄糖)和密切相关的分子制成的长链天然或合成聚合物。两个单糖分子可以通过糖苷键接合以形成二糖，例如在葡萄糖和果糖联接以生成蔗糖时。更复杂的多糖例如淀粉、糖原、纤维素或甲壳质包括通过糖苷键接合的多个单糖单元。如本文所用，术语“多孔的”涉及具有可以由液体和/或气体填充或灌注或者容许液体和/或气体穿过其中的流动的一个或多个开口、孔、穿孔或洞孔。术语“生长因子”通常指的是生物活性细胞信号转导分子，包括细胞因子和趋化激素，其已知为通过它们与细胞上的细胞表面受体(典型地受体酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、免疫球蛋白或GPCR)的相互作用引致生理学效果。结合到其受体上的生长因子的生理学效果包括例如在基因表达中的变化和/或细胞增殖、分化、激活、静止、或细胞凋亡。在某些情况下，生长因子是多效性的，即，取决于浓度、细胞类型和/或细胞状态，它们可以诱导不同的生理作用。在本文所提供的任一实施例中，纤维、基体和/或支架可以另外地包括一个或多个生长因子以增强例如细胞或组织的生长、分化和/或修复。
术语“生物活性的”和“生物活性”可以指的是但决非限于对与活体组织的相互作用或来自活体组织的响应的任意影响。如本文所用，术语“流体”可以指的是但决非限于能够流动的材料和/或材料的组合。例如，用于在本文所述的任一实施例中使用的流体可以包括例如在溶液、悬浮液、分散体或其组合中的液体成分和/或非液体成分(例如，气体、固体、半固体、颗粒状、胶体)。作为进一步示例，短语“细胞分离流体”包括液体成分和源自细胞或组织的材料的组合。本发明的下面的实施例将在系统的上下文中说明，所述系统包括用于种植、培养、存储、运输和测试血管移植物的装置和方法，但本领域的技术人员将认识到，所公开的方法和结构很容易地适于更广泛的应用。注意，只要相同的附图标记在不同的附图中重复，其就指的是在每张这种附图中的对应结构。II.示例性系统图I图示了由本发明提供的用于种植、培养、存储、运输和/或检测细胞和/或移植物(例如组织移植物)的示例性封闭系统1000。在某些实施例中，所述系统包括用于容纳细胞分离物(例如细胞分离流体)的装置。在某些实施例中，所述装置为容器3，例如能够被灭菌和/或密封的介质袋或任意柔性或刚性容器。例如，能够使用Gibco-BFL IL介质袋。在某些实施例中，细胞分离流体容器3可以包括能够被灭菌的任意生物相容性的、刚性材料，例如特氟龙、聚碳酸酯、PVC或不锈钢。容器3能够具有用于容纳细胞分离流体的任意合适的体积。在优选实施例中，容器3具有适于流体(例如骨髓抽吸物)的无菌灌装和/或分配的至少一个端口。例如,骨髓抽吸物(例如，5cc/kg体重)被无菌收集且流动例如经由端口 I或端口 2注入容器3内。在另一优选实施例中，容器3具有至少一个入口和一个出口。在又一实施例中，容器3包括具有一个或多个阀以容许流体或气体的单向流动的端口。例如，使用图I中所示的实施例作为参考，端口 I能够包括和/或采取swabbable阀(例如无针接入端口)的形式。该阀能够使用本领域的技术人员已知的任意合适的联接件或紧固装置(例如夹具、螺钉或鲁尔接头、压力配合、摩擦配合、联接件等)连接到容器3上和/或能够与流体线路(与容器3连通)相关联。根据图I中图示的系统1000的实施例，阀5与导管例如流体线路51相关联，从而与容器3连通。可选地，容器3包括预过滤元件4，该预过滤元件4例如包括例如丝网元件或机织元件(具有例如范围为从大约40微米至大约150微米的开口或孔结构)。这种预过滤元件能够当流体从容器中通过时用来移除非期望的材料(例如骨碎片、血块和/或脂肪沉积)。在某些实施例中，用于容纳细胞分离流体的装置包括本体，所述本体限定能够保持流体或气体的无菌和/或密闭容器，其中，所述本体也限定适于流体的填充和/或分配的一个或多个端口。在某些实施例中，所述本体限定一个或多个端口，其中，至少一个端口具有阀，例如单向阀。在又一实施例中，所述本体限定有包括阀的出口端口。可以在系统中使用的流体的示例包括但不限于消毒流体、造影介质流体、生物流体、含有细胞的流体、血液、血清、骨髓抽吸物、或含有培养基的流体。应当理解的是，在优选实施例中的测试、种植和培养期间，流体可以有利地保持在人体温度，并且可以包括接近人体血液粘度的流体。接近血液粘度的溶液的一个示例性示例为带有甘油的生理盐水。容纳在容器3中的流体从容器流过流体线路51 (图I中)。在优选实施例中，流体通过重力的作用而远离于容器3被引导。但是，本领域的技术人员容易理解，也能够使用流体泵(例如，由Cole-Palmer公司制造的Masterflex L/S数字驱动式螺动泵,但本领域的技 术人员能够从多种可商业获得的泵中选取)。流体线路51以及系统中的所有其他流体线路(例如，线路52、53、54、55、56、57、58a-58d和59)可以由适于在使用时运输流体或气体的医用级的、可消毒的、耐用的管件中的任一种类型制成。例如，流体线路能够为柔性或刚性塑料。所述系统还包括流动通道7，所述流动通道7包括至少一个入口、至少一个出口和至少一个过滤器，所述至少一个过滤器包括介于所述至少一个入口与所述至少一个出口之间的至少一个过滤器介质(例如，设置在过滤器壳体中)。在优选实施例中，过滤器以大致垂直于流过流动通道7的方向的角度设置(在一些实施例中，过滤器能够以大致平行于流动方向的角度设置，例如，涉及切向流动过滤)。在优选实施例中，过滤器适于容许沿至少两个方向的穿过其中的流动，例如，当第一和第二方向大致相反时，例如，其中流体能够沿第一方向从过滤器的上游表面流过下游表面，并且流体能够沿第二方向从过滤器的下游表面流过上游表面。在该实施例的示例中，细胞分离流体沿第一方向流过具有合适孔径(或网目尺寸)的过滤器，其中，过滤介质处于大致垂直于流动方向的角度，使得过滤器保持太大而不能穿过过滤器的细胞核/或生物材料。第二流体随后沿第二方向穿过过滤器，其能够从过滤器介质上清洗所保持的细胞核/或生物材料。能够用于在流动通道中利用的过滤器在本领域中是已知的，并且包括例如Pall公司。在又一另外的实施例中，过滤器(例如，至少一个过滤器介质)具有适于保持细胞(例如源自骨髓的单核细胞)的孔隙率。在某些实施例中，过滤器包括设计用于基于例如配体-受体相互作用而可逆地结合且保持所关注的细胞的基体。在又一另外的实施例中，多个过滤器能够串联或并联地组装以用于在如本文所述的系统中使用。构想的是，所述系统和方法能够具有任意数目的期望的流道和截止阀。流体或气体能够以至少三种方式通过系统供给重力，例如联接到过滤器上的IV型袋；例如经由注射器、泵或真空源获得的正压力或负压力，所有这些都由本发明明确地包括和构想。能够以本领域中众所周知的任意数量的方式进行与过滤器和/或系统的任意其他部件的连接，例如，无菌对接、在接头上的扭转(例如鲁尔接头、卡扣或摩擦配合)和紧固件等。由此，将可能的是使用多种标准联接技术进行连接，并且其构想的是标准连接件的任意组合是可能的。所有组合均由本发明包括和构想。在某些实施例中，所述系统包括用于容纳收集流体的装置。在某些实施例中，所述装置是容器13，例如能够被灭菌和/或密封的介质袋或任意柔性或刚性容器。例如，能够使用Gibco-BFL IL介质袋。在某些实施例中，收集容器13可以包括能够被灭菌的任意生物相容性的刚性材料，例如特氟龙、聚碳酸酯、丙烯酸类、PVC或不锈钢。容器13能够具有用于容纳收集流体的任意合适的体积。在优选实施例中，容器13具有适于流体的无菌灌装和/或分配(例如骨髓抽吸物滤过或流过)的至少一个端口。例如，骨髓抽吸物(例如，5cc/kg体重)被无菌收集且流动(例如注入)进入容器3内并且随后流动(例如，通过可选的预过滤器4且经由流体流动线路 51和52)通过包括过滤器的流动通道7。过滤器保留所关注的细胞和/或生物材料，从而使滤液能够流过流体线路53和54以及入口端口 11而流入容器13内。在另一优选实施例中，容器13具有至少一个流动端口，例如双向流动端口 ；但是，典型地，容器13具有至少两个端口。在某些实施例中，容器13包括入口端口和/或出口端口(在图I中图示的实施例中，容器13包括入口端口 11和出口端口 14)。在又一实施例中，容器13包括具有一个或多个阀以容许流体或气体的单向流动的端口。所述阀能够使用对本领域技术人员公知的任意合适的联接件或紧固装置(例如夹具、螺钉或鲁尔接头、压力配合、摩擦配合等)连接到容器13上和/或与流体线路(与容器13连通)相关联。根据图I中图示的实施例，系统1000包括与流体线路54相关联的阀10。在某些实施例中，用于容纳收集流体的装置包括本体，所述本体限定能够保持流体或气体的无菌和/或密闭容器，其中，所述本体还限定适于流体的填充和/或分配的一个或多个端口。在某些实施例中，所述本体限定一个或多个端口，其中，至少一个端口具有阀，例如单向阀。在又一实施例中，所述本体限定包括阀的出口端口。在某些实施例(例如，在下面更详细地指出的，在洗脱流体流过流动通道7并且细胞流入种植容器18内之后)中，容纳在容器13中的收集流体或滤液流过流体管路59和57而流入种植容器18 (图I中)内。在优选实施例中，流体通过重力的作用远离于容器13被引导。但是，如本领域的技术人员将容易理解的，也能够使用流体泵(例如，由Cole-Palmer公司制造的Masterflex L/S数字驱动式螺动泵,但本领域的技术人员能够从多种商业上获得的泵中选取)。在某些实施例中，所述系统包括用于容纳洗脱流体的装置。在某些实施例中，所述装置为容器9，例如能够被灭菌和/或密封的介质袋、注射器、或者任意柔性或刚性容器。例如，能够使用Gibco-BFL IL介质袋。在某些实施例中，洗脱流体容器9可以包括能够被灭菌的任意生物相容性的刚性材料，例如特氟龙、聚碳酸酯、丙烯酸类、PVC或不锈钢。容器9能够具有用于容纳洗脱流体的任意合适的体积。在优选实施例中，容器9具有适于流体(例如洗脱流体或洗涤流体)的无菌灌装和/或分配的至少一个端口。在某些实施例中，洗脱流体能够为细胞培养介质、盐水(例如磷酸盐缓冲生理盐水、包括葡聚糖的生理盐水)、或者由本领域的技术人员已知的用于收获或培养细胞的任意其他合适的流体(例如乳酸钠林格溶液、常规生理盐水、Delbecco公司的改进Eagles培养基、如在国际公布WO 98/045413和WO 05/094914等中所公开的流体等)。在另一优选实施例中，容器9具有至少一个流动端口，例如双向流动端口。在某些实施例中，容器9包括入口和/或出口。在又一实施例中，容器9包括具有一个或多个阀以容许流体或气体的单向流动的端口，和/或一个或多个阀的端口与流体线路(与容器9连通)相关联。根据图I中图示的实施例，系统1000包括与流体线路55相关联的阀8。该阀能够使用本领域的技术人员已知的任意合适的联接件或紧固装置(例如夹具、螺钉或鲁尔接头、压力配合、摩擦配合、联接件等)连接到容器9上和/或与流体线路相关联。洗脱流体或清洗流体流过阀8和流体线路53、流动通道7、流体线路52、56和57并且流入种植容器18 (图I中)内。在某些实施例中，用于容纳洗脱流体或清洗流体的装置包括本体，所述本体限定能够保持流体或气体的无菌和/或密闭容器，其中，所述本体还限定适于流体的填充和/或分配的一个或多个端口。在某些实施例中，所述本体限定一个或多个端口，其中，所述至少一个端口具有阀，例如单向阀。在又一实施例中，所述本体限定包括阀的出口端口。在一个实施例中，容器9是由无菌洗脱流体或清洗流体填充的注射器。洗脱流体或清洗流体流过流动通道7并且流过阀8、流体线路53、52、56和57 (图I中)而流入种植 容器18内。在本实施例中，流体由于通过按压注射器柱塞(例如手动地或者经由机械装置和/或电子装置)施加到流体上的压力而被引导远离容器9。可选地，例如，容器9能够为可压缩的柔性容器。但是，如本领域的技术人员将容易理解的，也能够使用流体泵(例如，由Cole-Palmer公司制造的Masterflex L/S数字驱动螺动泵,本领域的技术人员能够从多种商业上获得的泵中选取)。在某些实施例中，所述系统包括用于容纳细胞种植组件的装置。在某些实施例中，所述装置为种植容器18，例如能够被灭菌和/或密封的介质袋或任意柔性或刚性容器。例如，能够使用Gibco-BFL IL介质袋。在某些实施例中，容器18可以包括能够被灭菌的任意生物相容性的刚性材料，例如特氟龙、聚碳酸酯、丙烯酸类、PVC或不锈钢。种植容器18能够具有任意合适的体积。在某些实施例中，种植容器18可以包括通过任意标准装置(例如内螺纹和外螺纹)或使用粘接剂被固定且形成防漏的两个或更多个部段。例如，根据图I中图示的实施例，种植容器18包括刚性材料(包括主体部段(包括螺纹)以及螺纹帽17。可选地，根据图IA中所示的种植容器18的实施例，种植容器包括柔性材料例如袋。为了观察位于容器18内的支架或移植物(例如血管移植物)，观察端口可以布置在容器上的任意点或位置处，或者可选地，容器可以由光学透明材料例如聚碳酸酯或PVC制成。在优选实施例中，种植容器18具有适于流体(例如洗脱流体或清洗流体和/或如本文所述的收集或过滤流体)的无菌灌装和/或分配的至少一个端口。在某些实施例中，容器18包括入口和/或出口。在又一实施例中，容器18包括至少一个入口和出口端口(在图I和图3中图示的实施例中，种植容器18包括入口端口 16、出口端口 24、取样端口 19 (例如，用于流体样品从种植容器中的无菌采集，以确定例如微生物污染和/或干细胞计量)、以及排放端口 26，其中，所述盖17 (仅仅图I)包括端口)。使用图I和图3中所示的实施例作为参照，端口 19可以包括swabbable阀，例如无针接入端口。在特别优选的实施例中，出口端口适于细胞种植组件100 (参见图3)。在某些实施例中，容器18包括具有一个或多个阀以容许流体或气体的单向流动的入口端口。可选地，或另外地，一个或多个阀能够与一个或多个流体线路(与种植容器连通)相关联。该阀能够使用本领域的技术人员已知的任意合适的联接件或紧固装置(例如夹具、螺钉或鲁尔接头、压力配合、摩擦配合、联接件等)连接到容器18上和/或与流体线路(与种植容器18连通)相关联。在优选实施例中，种植容器18包括容许流体灌注和/或循环到容器内且穿过容器的入口端口 16和出口端口 24。入口端口 16和出口端口 24也用来将容器18分别附接到流体线路57和58a上。流体线路58a将种植容器18连接到一个或多个残留种植细胞流体容器35a和35b上，同时维持封闭系统。应理解，尽管图I中示出了仅仅一个种植容器18，但是流体线路(例如流体线路57或58a)可以分叉以便将多于一个的种植容器并联地连接到系统上。可选地，种植容器18还能够包括至少一个排放口，例如包括如例如在国际公布WO91/017809中公开的至少一个疏水性微孔膜(优选地，设置在壳体中)。例如，在图I和图3中图示的实施例中，排放口 26 (优选地,提供细菌阻挡孔隙等级(pore rating))能够布置为与至少一个种植容器端口 25连通。在没有约束到任意特定的理论或机制的情况下，排放口可以容许例如气体交换，同时冲洗被种植的支架。 在某些实施例中，用于容纳种植组件的装置包括本体，所述本体限定能够保持流体或气体的无菌和/或密闭容器，其中，所述本体还限定适于流体的填充和/或分配的一个或多个端口、以及种植组件。在某些实施例中，所述本体限定一个或多个端口，其中，至少一个端口具有阀，例如单向阀。在又一实施例中，所述本体限定出口端口。在某些实施例中，用于容纳残留种植细胞流体的装置为至少一个残留种植细胞流体容器35a、35b，例如能够被灭菌和/或被气密密封的介质袋或任意柔性或刚性容器。例如，能够使用Gibco-BFL IL介质袋。在某些实施例中，容器35a、35b可以包括能够被灭菌的任意生物相容性的刚性材料，例如特氟龙、聚碳酸酯、PVC或不锈钢。在优选实施例中，通过使用包括真空源(例如泵)以及调节器28的真空组件，流体经由端口 25和流体线路58a被抽出容器18而进入残留种植细胞流体容器35a内，其中，来自泵的负压力通过连接到残留种植细胞流体容器35a、35b和种植容器18上的流体线路传输。在某些实施例中，种植容器18容置包括多孔管20和支架21 (例如，诸如血管移植物支架的细胞或组织支架或移植物)的种植组件100。多孔管20可以包括可以使流体可渗透的任意合适的刚性材料，例如特氟龙、PVC、聚碳酸酯、塑料、金属例如不锈钢。合适多孔管的一个示例性示例为由Porex技术公司制造的多孔塑料管。可选地，多孔管20可以包括能够扩展和收缩且可以使流体可渗透的任意合适的弹性材料，例如PET或血管成形术球囊。种植容器18和管20均可以形成为任意长度或直径，以便保持任意长度或直径的血管移植物支架21。这由于该系统可以用来消毒、种植、培养、存储、运输、和测试任意尺寸的血管移植物而是有利的。一个或多个保持元件(例如夹具、ο形环、或扣眼)也可以例如在支架21的两个端部处布置在管20上，以在种植、培养、存储、运输或治疗期间将支架保持在管上的位置中。在某些实施例中，多孔管20包括芯棒120a。图2中图示了示例性芯棒。参照图2 :芯棒歧管120的敞开端部126被插入到抽吸杆23上，具有在抽吸杆的封闭端部附近的孔隙124。芯棒随后例如附着有合适尺寸的联接环123，其随后被插入到穿孔芯棒上，并且示例性地，芯棒120a经由一个或多个ο形环22 (图I中所示)摩擦地保持在种植容器18中。该组件容许流体运动通过芯棒歧管120而进入孔隙124内和离开开口 125。如本文所述，经由与残留种植细胞流体容器35a、35b连通的真空装置(例如，泵)，流体经由抽吸杆23从种植容器18中通过芯棒引出，并且通过流体线路58a-58d引导至芯棒120a。在优选实施例中，芯棒120a包括多个孔或穿孔121。但是,应当理解的是,所述穿孔可以为任意所需的尺寸、形状和/或构型，其能够以技术人员鉴于本说明书而显而易见的任意数目的方式变化且由本发明包括和构想。还构想的是，多孔管20能够为任意期望的长度和/或直径。例如，直径可以根据不同的移植物尺寸和/或应用而变化，其由本发明明确地包括和构想。在某些实施例中，种植容器18容纳包括多孔管18和支架21的种植组件100。支架能够为源自自然的，例如胎盘组织，或者合成的。例如，合成细胞和/或组织支架在本领域中是已知的并且是市售的。国际公布WO 09/019995中公开了支架的一个合适示例。在某些实施例中，待使用的支架能够为由聚合物(均聚物和/或共聚物)纤维形成的三维基体，其以织造或非织造网、以随机或对齐构型的方式组装。在优选实施例中，支架的纤维基体包括 合适尺寸的孔，以使细胞能够附着和生长和/或分化。由于细胞的直径为大约10 μ m至大约20 μ m，因此在该范围内的孔径在某些实施例中是期望的。另外，由本发明提供的聚合物支架能够被产生或制造，以更紧密地模仿天然的细胞外基体的结构和组合物以促进种植细胞的生长和分化，并且促进支架或在支架上生长的细胞的运输和/或植入。包括支架基体的纤维能够为任意期望的尺寸，但是通常介于大约I. 5mm与Inm之间。在某些实施例中，纤维为纳米级(即，从大约Inm至大约IOOOnm)和/或微米级(从大约I μ m至大约1000 μ m)。在某些实施例中，本发明的支架另外地包括能够促进细胞的生长和/或分化的一个或多个生长因子。用于对生成在本发明中使用的支架有用的聚合物可以为无机的(例如，硅氧烷、链硫、黑磷、硼-氮、聚硅氧烷)或有机的(指的是含有碳)。有机聚合物可以是天然的[例如，多糖，例如淀粉、纤维素、果胶、海藻胶、植物胶；多肽，例如酪蛋白、白蛋白、球蛋白、角蛋白、胶原蛋白、胰岛素、DNA ;和烃类]，合成的[例如热塑性塑料(未硫化的弹性体、尼龙、聚氯乙烯、线性聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯、丙烯酸酯树脂)；热固性的(例如，硫化弹性体、交联聚乙烯、酚醛树脂、醇酸树脂、聚酯)，以及半合成的(例如，纤维素，如人造丝、甲基纤维素、醋酸纤维素；以及改性淀粉)]。另外，本发明中有用的支架可以包括由水溶性或水不溶性的纤维素化合物形成的水凝胶。如将由技术人员容易理解的，支架的特定类型和构成将取决于期望的应用而变化。但是，通常优选的是包括支架的聚合物材料为生物相容性的(即，将不会引起不期望的免疫反应)。在某些实施例中，支架是可生物降解的。在任一实施例中，可降解的聚合物从由聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、或聚己内酯、聚酰胺、多糖和胶原蛋白构成的组中选取。在优选实施例中，该聚合物为聚(乳酸-乙醇酸)。在本文所述的任一实施例中，支架能够布置到位于种植组件中的多孔管(例如如本文所述的芯棒)的附近。例如，构想的是支架可以与多孔管的仅仅一部分相接触。可选地，构想的是支架可以基本上包围多孔管中的一些或全部。通常，优选的是所述支架与多孔管的穿孔部分并列或相邻，使得流体尽可能多地流过支架，以有利于种植尽可能多的细胞。
根据本发明的实施例，例如包括种植组件(包括多孔管((优选地，芯棒和支架))的多个种植容器能够被预组装，例如用于不同尺寸的移植物和/或不同的应用，并且当需要时组装为系统的一部分。典型地，例如，种植容器被预组装和消毒，并且能够例如通过无菌对接而无菌连接到系统的其余部分上。因此，最佳系统能够在需要时被快速地设置。在另一优选实施例中，流动通道设置在细胞分离流体容器、收集流体容器、洗脱或清洗流体容器与种植容器之间。这种构型由图I示例。在又一实施例中，流动通道与上述中的每一个选择性地流体连通。在实施例中，壳体包括流动通道，包括入口、出口、和过滤器，所述过滤器包括至少一个过滤器介质，例如，多孔白细胞去除介质(例如，在优选实施例中，流动通道包括过滤器装置，其包括壳体，所述壳体具有入口和出口，并且限定介于入口与出口之间的流体流动路径；以及过滤器，所述过滤器包括设置在所述壳体中的横过流体流动路径的至少一个多孔过滤器介质。在另一实施例中，所述壳体包括流动通道、入口、出口和介于它们之间的过滤器、以及阀。在某些实施例中，阀具有至少一个敞开位置和至少一个封 闭位置。在任意优选实施例中，由本发明所提供的系统包括容许流体和/或气体流过其中的流动线路。因此，在优选实施例中，本发明提供了用于种植、培养、存储、运输和/或测试细胞或组织移植物的系统，所述系统包括细胞分离流体容器、设置在所述细胞分离流体容器、收集流体容器、洗脱流体容器和种植容器之间的流动通道，其中，所述流动通道包括入口、出口和介于它们之间的过滤器，其中，所述过滤器适于沿至少两个方向流动，并且其中，所述流动通道分别与细胞分离流体容器、收集流体容器、洗脱流体容器和种植容器中的每一个流体连通；并且其中，所述种植容器包括种植组件。在一个实施例中，所述种植组件包括穿孔芯棒和设置在所述芯棒的至少一部分附近的生物相容性三维支架。在又一实施例中，所述系统包括至少一个残留种植细胞流体容器，其中，所述残留种植细胞流体容器与所述种植容器选择性地流体连通。在另一实施例中，所述系统包括与所述残留种植细胞流体容器流体连通的真空源。如本文所述的系统的示例性实施例(参见图I、图2和图3)容许源自骨髓的单核细胞的分离，并且，在维持无菌系统的同时，或者在维持封闭无菌系统的同时，将细胞种植在生物相容性的三维支架上，其在短暂时段的潜育期(例如，大约三(3)小时或更少，更优选地，大约两(2)小时或更少)后能够用作组织工程血管移植物。如将由本领域的技术人员根据本发明的实施例理解的，能够在维持无菌系统的同时使用所述系统，其中，无菌种植容器能够使用在无菌领域中的无菌技术例如手术室(使用无菌手套以处理部件)进行组装(例如，使用期望的多孔管和支架)。被组装的种植容器能够连接到所述系统的其他部件上，例如，其中细胞分离流体容器、洗脱容器和收集容器已经以封闭无菌方式预组装。可选地，且优选地，能够在维持无菌系统的同时使用所述系统，其中，所述系统已经在使用之前预组装且被消毒。在某些实施例中，所述系统是一次性的。封闭的一次性系统容许用于构建组织工程移植物(例如血管移植物)的手术，当与先前所述方法进行比较时，其能够在实现相似的种植效率的同时被快速地执行。参见例如松村G (Matsumura G)、日比野N (Hibino N)、Ikada Y、黑泽明H (Kurosawa H),Shinoka T。组织工程血管自体移植物的成功应用临床经验。生物材料2003; 24:2303-8 JPFDA IDE 14127，其全部的内容通过参引的方式并入本文。另外，如本文所述的系统的使用提供了在护理点(即，在手术室中)构建组织工程移植物(例如血管移植物)的机会，从而排除了用于支架运输的需求。如本文所述的用于将细胞种植到三维支架上的无菌或封闭系统结合细胞分离过滤器、真空种植和容器(例如，袋)技术以用于以先前未描述的方式在组织工程中使用。这种技术的优点包括其容许在不需要无菌罩或ISO第7类室的情况下组装组织工程构造，通过排除对这种设备或设施的需求而显著减小用于生成组织工程产品的成本，同时增大组织工程产品的使用的临床效用。另一优点是其以比先前可能的更短时间提供移植物。III.示例性方法 可以根据本公开的示例性方法获得具有源自骨髓的单核细胞的组织工程血管移植物。参照图1，在另外的方面，本发明提供了用于将细胞种植到支架上的方法，所述方法包括例如设置根据本文所述的任一方法的细胞种植系统，其中，至少一个阀分别设置在细胞分离流体容器、收集流体容器、洗脱流体容器和种植容器中的每一个与流动通道之间，并且其中，第一阶段由仅与所述细胞分离流体容器和所述收集流体容器流体连通的流体通道限定，将流体流动沿第一方向从所述细胞分离流体容器引导到收集流体容器中，其中，将来自细胞分离流体的细胞保持在过滤器上，封闭至少一个阀，使得流动通道不与所述收集流体容器或所述细胞分离流体容器流体连通，其中，第二阶段由仅与所述洗脱流体容器和所述种植容器流体连通的流动通道限定；将洗脱溶液的流动沿与所述第一方向大致相反的方向从所述洗脱流体容器引导通过流动通道过滤器，使得细胞基本上从过滤器中移除并且流入种植容器内；并且通过将流动引导通过生物相容性的三维支架和穿孔芯棒而进入残留种植细胞流动容器内将流体从种植容器中移除，从而，位于种植容器中的细胞的至少一部分被种植到支架上。在一个实施例中，流体通过例如_20mmHg(或者比位于流动通道2中的过滤器的起泡点小的另一合适的值)的真空从种植容器中移除，所述真空被应用直到所有细胞悬浮液已经流过支架并且收集在残留种植细胞流体容器35a、35b中为止。在另一实施例中，所述壳体包括流动通道，包括入口、出口和过滤器。在另一实施例中，所述壳体包括流动通道、入口、出口和介于它们之间的过滤器、以及阀。在某些实施例中，所述阀具有至少一个敞开位置和至少一个闭合位置。因此，在另一实施例中，并且总体参照图I中所示的示例性系统1000 (其中，图3中所示的种植组件18也能够在系统中使用),所述方法包括将骨髓抽吸物(例如，5cc/kg体重)无菌地收集到容器3内，其中，至少阀51是关闭的(典型地，一个或多个阀6、7、8、10和15也被关闭)。夹具5和10被打开，并且利用重力的作用，使骨髓抽吸物流动(经由流体线路51和52)通过流动通道7的过滤器，过滤器捕获源自骨髓的单核细胞。骨髓抽吸物的剩余部分(典型地，主要包括血浆)被收集(经由流体线路53和54以及端口 11)在收集流体容器13中。接着，夹具5和10被关闭，阀8和6被打开，并且洗脱溶液流动(经由流体线路55和53)通过过滤器7，从而释放源自骨髓的单核细胞，这些细胞流过流体线路52、56和57以及端口 16，并且被收集在种植容器18中。种植容器18容纳种植组件100，包括被插入到穿孔多孔管20/芯棒120a上的支架21。在优选实施例中，源自骨髓的单核细胞悬浮液填充种植容器18，从而完全覆盖被插入到穿孔芯棒20上(图IA示出了与支架相接触的细胞悬浮液)的支架21。接着，阀6和10被关闭，并且阀27被打开，并且使用真空组件(包括调节器28)的真空(例如，-20mmHg)被施加，直到所有细胞悬浮液已经流过支架并且经由端口 24和流体线路58a收集在残留种植细胞流体容器35a中(如果存在过多的流体，则经由流体线路58b将另外的细胞悬浮液收集在残留种植细胞容器35b中)。在真空停止之后，阀27优选地被关闭，阀15被打开，并且容许容器13中的血清通过重力的作用经由流体线路59和57以及端口 16排放到种植容器18内，从而冲洗所种植的支架。如果可选的排放口 26被包括作为种植容器18的一部分，则可以例如在冲洗期间发生气体交换。若需要，例如，为了在细胞被冲洗的同时易于处理种植容器和/或种植容器部件(例如，芯棒和/或支架)，位于种植容器18上游的一个或多个系统部件，例如过滤器7、 洗脱容器9、收集容器13和/或细胞分离流体容器3能够被移除(例如，在热密封适当流体线路之后)且被弃用。作为另外的选项，整个装置被布置在培育箱中(例如大约10%-100%的湿度、35°C 37°C的温度、具有3%-5%的CO2)大约两小时，在此之后，被种植的支架能够从容器中被无菌地移除(例如，在移除盖17 (图I)之后或者在切开柔性容器(图3)之后)并且用作组织工程血管移植物。IV.示例性套件在另外的方面，本发明提供了套件，所述套件包括至少一个容器，其包括根据本文所述实施例中的任一个的系统或装置；以及其使用的指示。V.示例应当理解的是，本发明的示例性实施例不应当理解为限制于在本文所述的示例；事实上，本发明的示例性实施例应当理解为包括本文所提供的任一个和所有应用，并且包括在技术人员的技术领域内的所有改变。VI.通过参引的方式并入在本申请中前后引述的所有参考文献、专利、待审专利申请、公布的专利申请和公布的专利的全部内容通过参引的方式明确并入本文。VII.等同本领域的技术人员使用不多于常规的实验将理解或能够确定本文所述发明的具体实施例的很多等同。这些等同意为由下面的权利要求包括。应当理解的是，本文所述的详细示例和实施例作为用于仅示例性目的的示例给出，并且绝非视为限制本发明。对于其的多种修改或变化对本领域的技术人员是显而易见的并且被包括在本申请的精神和和范围内，并且视为落在所附权利要求的范围内。例如，成分的相对量可以变化以优化期望的效果，另外的成分可以被添加，和/或相似的成分可以被替代用于所述成分中的一个或多个。另外的优点和特征以及与本发明的系统、方法和过程相关联的功能从所附权利要求中变为明显。此外，本领域的技术人员使用不多于常规的实验将认识到或能够确定本文所述发明的具体实施例的很多等同。这些等同意为由下面的权利要求包括。
权利要求
1.一种用于种植细胞的系统，包括 细胞分离流体容器； 流动通道，所述流动通道设置在细胞分离流体容器、收集流体容器、洗脱流体容器以及种植容器之间，其中，所述流动通道包括入口、出口和介于所述入口和所述出口之间的过滤器； 其中，所述过滤器适于容许沿至少两个方向的流动，并且其中，所述流动通道分别与所述细胞分离流体容器、所述收集流体容器、所述洗脱流体容器和所述种植容器中的每一个选择性地流体连通；并且其中，所述种植容器包括细胞种植组件。
2.如权利要求I所述的系统，其中，壳体包括所述流动通道、入口、出口和介于所述入口和所述出口之间的过滤器。
3.如权利要求I所述的系统，其中，所述种植容器还包括排放口。
4.如权利要求3所述的系统，包括封闭系统，其中，所述系统还包括至少一个残留种植细胞流体容器，其中所述残留种植细胞流体容器与所述种植容器选择性地流体连通；以及真空源，所述真空源与所述残留种植细胞流体容器流体连通。
5.如权利要求I所述的系统，其中，所述种植容器包括螺纹本体和螺纹帽。
6.如权利要求I所述的系统，其中，所述种植容器包括柔性袋。
7.如权利要求I所述的系统，包括封闭系统。
8.如权利要求I所述的系统，其中，所述种植容器包括穿孔芯棒以及设置在所述芯棒的至少一部分附近的生物相容性三维支架。
9.如权利要求8所述的系统，其中，所述生物相容性三维支架为可生物降解的。
10.如权利要求9所述的系统，其中，所述生物相容性三维支架包括聚合物纤维基体。
11.如权利要求10所述的系统，其中，所述纤维包括从由聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、聚(聚己内酯)、聚酰胺、聚乙烯基聚合物或共聚物、多糖、胶原蛋白及其组合构成的组中选取的至少一种聚合物。
12.如权利要求11所述的系统，其中，所述纤维包括聚-I-(丙交酯酸)。
13.如权利要求I所述的系统，其中，所述系统包括多个种植容器。
14.如权利要求13所述的系统，所述多个种植容器与歧管选择性地流体连通，所述歧管与所述流动通道选择性地流体连通，并且包括入口、阀、和多个出口，并且其中，所述歧管适于将流体和/或气体基本等同地分布到每个种植容器中。
15.如权利要求8所述的系统，其中，所述支架为组织移植物，所述组织移植物能够促进在移植物上的三维组织生长。
16.如权利要求15所述的系统，其中，所述组织移植物为可植入的血管组织移植物。
17.如权利要求16所述的系统，其中，所述血管组织移植物包围所述芯棒的至少一部分。
18.如权利要求I所述的系统，包括封闭系统，其中，所述细胞分离流体为无菌的。
19.如权利要求I所述的系统，包括封闭系统，其中，所述洗脱溶液为无菌的。
20.如权利要求4所述的系统，其中，所述细胞分离流体容器、所述洗脱流体容器、所述收集流体容器、所述种植容器和所述残留细胞流体容器中的每一个包括入口和出口。
21.一种用于将细胞种植到支架上的方法，包括设置如权利要求4所述的系统，其中，至少一个阀分别设置在细胞分离流体容器、收集流体容器、洗脱流体容器和种植容器中的每一个与流动通道之间，并且其中，第一阶段由仅与所述细胞分离流体容器和所述收集流体容器流体连通的流体通道限定； 将流体的流动沿第一方向从所述细胞分离流体容器引导到所述收集流体容器，其中，来自所述细胞分离流体的细胞被保留在所述过滤器上； 关闭至少一个阀，使得所述流动通道不与所述收集流体容器或所述细胞分离流体容器流体连通，其中，第二阶段由仅与所述洗脱流体容器和所述种植容器流体连通的流动通道限定； 将所述洗脱溶液的流动沿与所述第一方向大致相反的方向从所述洗脱流体容器引导通过所述流动通道过滤器，使得细胞被基本从所述过滤器中移除并且流入所述种植容器内；并且 通过将流动通过所述生物相容性三维支架和所述穿孔芯棒引导到所述残留细胞流体容器内而将流体从所述种植容器中移除，其中位于所述种植容器中的细胞的至少一部分种植到所述支架上。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述方法在移除位于所述种植容器中的流体之前包括 关闭介于所述流动通道与所述洗脱流体容器之间的阀，其中，第三阶段由仅与所述流动通道和/或所述种植容器流体连通的所述收集流体容器限定；以及将流体的流动从所述收集流体容器引导到所述种植容器。
23.如权利要求22所述的方法，其中，在所述第一阶段、所述第二阶段或所述第三阶段的至少一个中的流体的流动是由于重力的作用。
24.如权利要求21所述的方法，其中，所述流体通过真空从所述种植容器中移除。
25.如权利要求21所述的方法，其中，壳体包括所述流动通道、入口、出口、和介于所述入口和所述出口之间的过滤器。
26.—种用于培养细胞的封闭系统,包括 用于容纳细胞分离流体的第一装置； 用于引导流体流动的设置在所述第一装置之间的第二装置； 用于收集流体的第三装置； 用于容纳洗脱流体的第四装置；以及 用于容纳细胞种植组件的第五装置，其中，所述第二装置包括过滤器； 其中，所述过滤器适于容许沿至少两个方向的流动，并且其中，所述第二装置分别与所述第一装置、所述第三装置、所述第四装置和所述第五装置中的每一个选择性地流体连通，并且其中，生物相容性三维支架设置在所述第六装置的至少一部分的附近； 用于容纳残留种植细胞流体的第七装置，所述第七装置与所述第五装置流体连通；以及 用于移除残留种植细胞流体的第八装置，所述第八装置与所述第七装置流体连通，并且其中，所述第一装置、所述第二装置、所述第三装置、所述第四装置、所述第五装置、所述第六装置、所述第七装置和所述第八装置中的每一个通过第九装置相连以促进流体流动。
27.如权利要求26所述的封闭系统，其中，所述第一装置、所述第三装置、所述第四装置、所述第五装置、所述第七装置、所述第八装置或其组合中的至少一个为柔性或刚性塑料容器。
28.如权利要求26所述的封闭系统，其中，所述第九装置包括柔性或刚性流体线路，以及容许介质穿过其中的选择性流动的至少一个阀。
29.如权利要求26所述的封闭系统，其中，所述第六装置为穿孔芯棒。
30.如权利要求29所述的封闭系统，其中，所述生物相容性三维支架为可生物降解的。
31.如权利要求28所述的封闭系统，其中，所述生物相容性三维支架包括聚合物纤维基体。
32.如权利要求29所述的封闭系统，其中，所述纤维包括由聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、聚(聚己内酯)、聚酰胺、聚乙烯基聚合物或共聚物、多糖、胶原蛋白、以及其组合构成的组中选取的至少一种聚合物。
33.如权利要求32所述的封闭系统，其中，所述纤维包括聚-I-(丙交酯酸)。
全文摘要
提供了用于便利的和无菌分离、收集细胞和将细胞种植到支架或组织移植物上的系统。所述系统可以为封闭的。还提供了用于使用用于分离、收集和种植细胞的公开系统的方法以及产生组织工程血管移植物的方法。所述系统可以以套件被提供以用于有效的和迅速的使用。
文档编号C12N1/12GK102884172SQ201080066662
公开日2013年1月16日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者C·布鲁尔, E·L·斯奈德, K·沙菲, M·A·史密斯 申请人:耶鲁大学, 帕尔公司