专利名称：山羊颗粒冻精稀释液的制作方法
山羊颗粒冻精稀释液 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于保存山羊颗粒冻精的稀释液。 [背景技术]精液冷冻保存技术，就是将精子置于超低温环境中，使其新陈代谢几乎停止，升温后又恢复受精能力。该技术是人工授精技术的一大革新，具有很明显的优势可以不受时间、地域和种公畜年限的限制，发挥和提高优良种公畜的利用率，加速品种的改良步伐。山羊精液冷冻保存技术的研究始于50年代。直到20世纪60年代，一些国家才开始应用羊冻精进行人工授精试验。J. M. Corteel报道，在非繁殖季节，利用同期发情技术，对同期发情效果较好的一千多只母羊进行冷冻精液的人工授精，获得了 38. 7%的分娩率。这是关于羊的冷冻精液技术人工授精结果较早的报道。90年代以来，山羊冻精制作和应用的研究，虽然取得了一定成绩，但存在的问题也很多，特别是没有有效地把受胎率稳定在50%以上，说明这一方面的研究还有待取得更大的突破。山羊的精液保存是一个复杂的物理化学过程，稀释液的组成成分、渗透压、PH值及精液的稀释倍数、保存温度对精液的保存效果都有重要的影响。目前，在精液冷冻稀释液中，其主要成分可以划分为缓冲剂、营养剂、抗冷冻剂以及添加剂四个组成部分。目前报道的精液稀释液配方，按缓冲剂、营养剂、抗冷冻剂以及添加剂四个组成部分主要有以下几种柠檬酸钠-糖类-甘油-卵黄、Tris-柠檬酸-糖类-甘油-卵黄、 EDTA-柠檬酸钠-糖类-甘油-卵黄和Tris-柠檬酸-糖类-甘油-卵黄，但各自对精子的冷冻保护效果，不同的研究者结论不同，差异较大，未形成定论。到目前为止，尚未形成公认的最适技术参数，因此，人们对其仍在不断的优化和提高。山羊精液在冻前的平均损伤率为19. 4%，冻后平均损伤率为17. 1%。由此可见山羊精液在冻前和冻后损伤较大。因此，就降低精子损伤率而言，我们有必要对冷冻精液的稀释液配方进行研究和改进。在受胎率方面，目前，我国山羊冻精的受胎率为45. 5 60%。本发明要解决的技术问题是提供一种用于保存安徽白山羊颗粒冻精的稀释液，其可提高山羊颗粒冻精的品质，相应提高山羊冻精的受胎率。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种用于保存山羊颗粒冻精的稀释液，所述的稀释液由葡萄糖3. Og,柠檬酸钠1. 6g，甘油5ml，卵黄20ml，羟乙基哌嗪乙磺酸1. 6g，二甲基甲酰胺Iml，十二烷基硫酸钠0. Ig,青霉素10IU，链霉素10IU，并用蒸馏水将上述物质定溶至IOOml组成。山羊的精液保存是一个复杂的物理化学过程，稀释液的组成成分、渗透压、PH值及精液的稀释倍数、保存温度对精液的保存效果都有重要的影响。目前，在精液冷冻稀释液中，其主要成分可以划分为营养剂、缓冲剂、抗冷冻剂以及其他添加剂四个组成部分。缓冲剂作为冷冻稀释液的重要组成部分，对于精液冷冻的效果发挥着重要作用。柠檬酸钠无毒性、具有PH调节性能及良好的稳定性。柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以在钙离子的情况下不能使用。羟乙基哌嗪乙磺酸作为一种缓冲剂，受外界因素影响小，缓冲功能强大，并且不易形成缓冲剂-金属离子复合物。本发明将柠檬酸钠和两性离子羟乙基哌嗪乙磺酸的组合添加于稀释液中达到了很好的效果。抗冻剂是精液冷冻稀释液中不可缺少的部分，发挥着至关重要的作用。相对于非渗透性抗冻剂而言，渗透性抗冻剂的作用又更加重要。目前，最常用的渗透性抗冻剂是甘油。甘油对于精液冷冻过程中的精子具有很好的保护作用，但也存在缺点，一是甘油对精子有毒性作用，会影响冻后精液的存活时间；二是可能具有抑制受孕的负作用。二甲基甲酰胺 (DMF)属于一种低分子量酰胺类化合物，分子量为73. 1，能够通过渗入精细胞内，平衡精细胞内外渗透压，降低其冰点而起保护作用。与甘油相比，二甲基甲酰胺的分子量小，更容易穿过细胞膜进入到精子内部，但其缺点是粘性小，抑制水结晶能力较弱，并且也具有一定毒性。因此，本发明以二甲基甲酰胺和甘油组成一种混合冷冻保护剂，得到更加有效的山羊精液冷冻稀释液配方。十二烷基硫酸钠(SDS)是一类表面活性剂，对精子膜结构有保护、修补作用，提高解冻后精液的活力、质膜完整率及存活率。在本发明中，添加适当的十二烷基硫酸钠对于冷冻精液品质有显著的改善(P <0.05)。因此，不管十二烷基硫酸钠是自身作用于精膜起到抗冷冻效果还是通过作用于卵黄间接作用于精膜，十二烷基硫酸钠对于冷冻精液的确实起到了保护作用。本发明的有益效果是，在常规的冷冻精液稀释液中加入羟乙基哌嗪乙磺酸、二甲基甲酰胺和十二烷基硫酸钠，组成如下配方100ml稀释液中含葡萄糖3. 0g，柠檬酸钠 1.6g，羟乙基哌嗪乙磺酸1.6g，甘油5ml，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸钠0. lg，卵黄 20ml。经检测，采用上述稀释液配方制作的安徽白山羊颗粒冻精复苏活力达到0. 65，用该配方制作的颗粒冻精对55只发情正常的安徽白山羊进行人工授精实验，经统计人工授精受胎率为76. 4%。由此可见，该配方制作的冷冻精液具有较好的实际应用效果。本实施例所使用的材料、试剂及其来源1)材料采精公羊安徽白山羊，6只，2 3岁，体质健壮，繁殖性能良好；合肥博大牧业科技公司种羊场提供；采精公羊饲养管理舍饲，每天户外运动4h 他；日粮精料0. 75kg/ d ·只，干花生秧、青绿饲料自由采食，采精期补喂鸡蛋4枚/d ·只。2)主要器材精子品质自动分析仪(南宁松景天伦生物科技有限公司，CASA，Windows XP)； 生物光学显微镜(XSJ-2型，重庆光学仪器厂)；相差显微镜(Olympus，日本)；渗透压计 (ADVANCED，美国)；精密PH计(上海双赢科学仪器有限公司)；液氮灌(北京信康亿达科技发展有限公司)。3)主要试剂葡萄糖(Sigma公司)、柠檬酸纳(Na3C6H5O7. 2H20,上海试剂公司)、羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(h印es，Sigma公司)、甘油(天津市化学试剂三厂)、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF，沈阳市试剂三厂)、十二烷基磺酸钠(SDS，上海双龙化学品厂)、卵黄(鸡蛋黄，本地)、青霉素、链霉素(上海新亚药业有限公司)。本实施例具体做法如下1稀释液配制将表1所列各组分物质用蒸馏水定溶至IOOml配制成稀释液。表 权利要求
1. 一种用于保存山羊颗粒冻精的稀释液，其特征在于，所述的稀释液由葡萄糖3. 0g， 柠檬酸钠1.6g，甘油5ml，卵黄20ml，羟乙基哌嗪乙磺酸1.6g，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸钠0. lg，青霉素10IU，链霉素10IU，并用蒸馏水将上述物质定溶至IOOml组成。
全文摘要
本发明公开了一种用于保存山羊颗粒冻精的稀释液，所述的稀释液由葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.6g，甘油5ml，卵黄20ml，羟乙基哌嗪乙磺酸1.6g，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸钠0.1g，青霉素10IU，链霉素10IU，并用蒸馏水将上述物质定溶至100ml组成。本发明在常规的冷冻精液稀释液中加入羟乙基哌嗪乙磺酸、二甲基甲酰胺和十二烷基硫酸钠，组成优化配方；经检测，采用优化的稀释液配方制作的安徽白山羊颗粒冻精复苏活力达到0.65，通过用该配方制作的颗粒冻精对55只发情正常的安徽白山羊进行人工授精实验，经统计人工授精受胎率为76.4％。由此可见，该配方制作的冷冻精液具有较好的实际应用效果。
文档编号C12N5/076GK102586178SQ20111000119
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者丁建平, 任春环, 凌英会, 孙志辉, 张子军, 张晓东, 张育军, 张运海, 李运生, 章孝斌, 章孝荣, 阮崇美, 陈泽文 申请人:合肥博大牧业科技开发有限责任公司, 安徽农业大学