专利名称：一种检测人结直肠癌braf基因突变的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种检测BRAF基因突变的方法和试剂盒。
背景技术：
结肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一。近年来研究发现结肠癌的发生途径除经典的 “腺瘤-癌”途径外，还存在“畸形隐窝灶-增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌”途径，即锯齿状腺瘤途径。该途径由有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activedprotein kinases，MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinases，ERK)信号通路调控，BRAF 基因是其重要的调控因子。BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(v-raf)致癌同源体Bi，定位于人染色体 7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAH(通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，BRAF蛋白位于MAPK/ERK途径的入口处，将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。在结直肠癌(CRC)中，BRAF突变率约为15%左右，这些突变主要发生于外显子15上的激活区，其中约92%位于第1799位核苷酸上(T突变为A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。有研究发现，在结肠癌EGFR靶向药物的临床治疗中，KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物(西妥西单抗、 帕尼单抗)产生耐药。但是在KRAS野生型患者中使用抗EGFR单抗治疗，部分没有KRAS基因突变的患者也会对EGFR靶向药物产生耐药性，研究证明这主要是由于KRAS下游的BRAF 基因V600E突变造成的。进一步研究显示，KRAS下游基因BRAF突变状况与西妥昔单抗和帕尼单抗的耐药有关在KRAS野生型的患者中，有5%左右的BRAF基因突变，BRAF基因突变的患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗均无反应，并且无进展生存(pre)和总生存(0 均较 BRAF野生型的患者短。Lambrechts等在2009年ASCO会议上报道BRAF的突变率为5%，与 KRAS基因突变具有排他性；BRAF野生型与客观疗效及生存获益明显相关。CAIR0-2研究中， BRAF野生型患者的PFS与OS均优于BRAF基因突变型患者。提示BRAF野生型患者可从抗 EGFR单抗治疗中获益。美国国家癌症综合网络(NCCN)在2010年版的结肠癌病理评估原则4_3中指出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。同时NCCN新增了针对KRAS基因检测无突变的患者，在诊断检测中推荐加入BRAF基因状态检测的评估原则，并指出对于KRAS基因野生型但同时具有BRAF V600E突变的患者，似乎抗EGFR抗体靶向治疗无效，已知BRAF突变的患者似乎不能从抗EGFR抗体靶向的治疗中获益。因此BRAF基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。但是，尽管BRAF基因突变的意义已得到重视和临床应用，目前全球范围内仍缺乏标准化的检测方法。
传统的直接测序方法一直是公认的“金标准”，但是这种方法的灵敏度低，要求突变率达到20% -30%时才能检出，因此需要显微切割或选择性组织抽提来富集突变细胞。 且费用高、通量低、检测周期长，临床应用局限性大。限制性片段多态性分析(RFLP)虽然具有较高的灵敏度，但所检测的突变位点必须具有限制性内切酶的酶切位点，实际设计和操作复杂。高效变性液相(dHPLC)的灵敏度在5% -10%之间，但只能区分杂合型样本，当检测纯合型样本时，需要掺入野生型样本混合成杂合型来检测，带来额外的检测费用、延长了检测周期。上面的几种检测方法由于自身的缺陷，在临床应用方面局限性较大，至今仍然只是作为一种检测方法，而非成品试剂盒。高分辨率熔解(High-resolution melting，简称HRM)分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。HRM既可以对未知突变进行筛查、扫描，也可以对已知突变进行分析。相对于传统的突变分析而言，操作步骤大大简化，时间和成本也降低了不少。而且样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。现有技术中，采用高分辨率熔解分析BRAF基因突变的报道有UMartin Pichler等人采用HRM方法从野生型DNA样本背景中检测出1 %的BRAF 基因突变。在与DNA测序法、实时等位基因特异性PCR(eal-timeallele-specific PCR)、高效变性液相色谱法等方法比较后，证明HRM方法比DNA测序和高效变性液相色谱法的敏感度更高，与实时等位基因特异性P CR的灵敏度一致。通过对60例石蜡包埋的结直肠癌组织标本进行HRM法检测并用DNA测序法进行验证，HRM检测结果与DNA测序法一致。结论是，HRM分析是检测BRAF基因V600E突变的有效手段。该方法有高灵敏度，高通量的特点， 可以用于临床石蜡包埋组织标本的检测。(参考Martin Pichler，MarijaBalic, Journal of Molecular Diagnostics 2009，v080100)2、苏州为真生物医药有限公司销售一种BRAF基因突变试剂盒，采用高分辨率熔点曲线分析，可在配有HRM模块的荧光定量PCR仪器(如LightCylcerfSO等)上分析，用于检测B RAG基因的热点突变区V600E(1799T > A)。试剂盒可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。现有的试剂盒虽然采用了 HRM的方法，但是在实际中，往往需要后续的PCR富集和DNA测序来对检出的突变进行基因分型，因此对突变位点的准确识别可以将与肿瘤的预后和靶向治疗疗效密切相关的突变与其他突变有效的区分开来，有利于临床分析和科学研
发明内容
本发明目的是提供一种含有特异性探针的检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，弥补HRM检测只能进行突变筛查的缺点，实现基因分型，通过对检测试剂以及检测条件的优化，使该试剂盒的操作简单快速、检测结果更为稳定、检测成本也更低。
为达到上述目的，本发明采用的技术方法是一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括用于对BRAF基因第15号外显子的密码子600进行基因分型的特异性探针，所述的特异性探针包含密码子600的核苷酸序列，所述BRAF基因具有SEQ ID No 1的连续核苷酸序列。所述的特异性探针为SEQ ID No. 2。所述的特异性探针3’端经封闭处理、无法延伸。所述的试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶、特异性引物对、SYTO 9荧光染料、水和野生型对照，其中特异性引物选自
权利要求
1.一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括用于对BRAF基因第15号外显子的密码子600进行基因分型的特异性探针，所述的特异性探针包含密码子600的核苷酸序列，所述BRAF基因第15号外显子具有SEQ ID No 1的连续核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于 特异性探针为SEQ ID No. 2。
3.根据权利要求1所述的一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于 特异性探针3’端经封闭处理、无法延伸。
4.根据权利要求1所述的检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性弓|物对、SYTO 9荧光染料、水和野生型对照， 其中特异性引物选自
5.根据权利要求1所述的检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于每 20 μ 1 PCR反应体系终浓度组成为2 μ 1 10XPCR缓冲液、0.6-1. 0μ 1氯化镁溶液、1.6μ 1 dNTP、0. 1-0. 3 μ 1 Taq DNA聚合酶、100_200ηΜ正向引物和 20_40ηΜ反向引物、100_200ηΜ特异性探针，2-5μ1 SYTO 9荧光染料，其余为水。
6.一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤1)按照常规方法采集待分析的基因组DNA;2)对上述基因组DNA进行BRAF基因15号外显子的PCR扩增，再通过Cold-PCR富集扩增产物；反应完成后，将扩增产物再进行变性熔解；3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的BRAF基因进行突变位点检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤2中PCR扩增的过程为95°C15 分钟，95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，进行20个循环。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤2中Cold-PCR富集过程为 820C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，进行15个循环；72°C 2分钟；反应完成后，将扩增产物再进行变复性，90°C 30 #,50°C 1分钟。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤2中加入的DNA提取液的体积根据提取液中DNA浓度而调整，使加入的DNA量达到10ng。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤3中，PCR扩增产物样本在 LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析，仪器以0. 2V /s的速度从72°C升温到95°C，获得样品的熔解曲线。
全文摘要
本发明涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒，具体涉及一种检测BRAF基因突变的方法和试剂盒。其特征在于，所述试剂盒包括用于对BRAF基因第15号外显子密码子V600E进行基因分型的特异性探针，所述第15号外显子密码子V600E的特异性探针包含V600E密码子的核苷酸序列。本发明的试剂盒采用常规PCR扩增结合Cold-PCR富集扩增产物的技术和高分辨熔解曲线分析技术，完成对样本基因分型的判断。
文档编号C12Q1/68GK102586401SQ20111000114
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者侯青, 姬云, 张泓 申请人:苏州科贝生物技术有限公司