专利名称：长链无模板dna的高通量高保真自动化合成方法
技术领域：
本发明属于DNA合成领域，具体涉及一种长链无模板DNA的高通量高保真自动化合成方法。
背景技术：
1970年Agarwal等人花费了 20人年合成75喊基对(base pair,简称bp)( K. L. Agarwal, H. Buchi, Μ. H. Caruthers, N. Gupta, H. G. Khorana, K. Kleppe, A. Kumar, E. Ohtsuka, U. L. Rajbhandary, J. Η. V. de Sande, V. Sgarame 11 a, H. We- ber, and T. Yamada. Total synthesis of the gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast. Nature, 227 (5253) : 27 - 34, Jul 1970)。如今随着化学合成技术的进步，DNA合成公司可以以相对合理的时间和费用合成上千碱基对序列。然而当前的合成技术主要还是依靠人力完成，且错误率随着合成序列的长度迅速上升。传统的分子生物学方法依赖于自然DNA模板的存在，通过设计适当的引物进行PCR反应得到需要的DNA片段，而后将这些片段用ligation反应拼接在一起，但是这种传统方法不适用于无模板的合成DNA。近年来麻省理工学院提出了 BioBrick方法，即将常用的DNA片段置于预先定义好的一组酶切位点中(所谓的BioBrick),每次要将两个BiroBrick用限制内切酶切开再拼合，但是会在两个BioBrick中间产生一个scar (伤痕),可以想见对于长链DNA这种方法会产生大量的伤痕，从而造成不可预测的表型影响。所以长链无模板DNA(>10，OOObase pair)的合成仍然是当今合成技术的难点。
发明内容
为了解决现有长链无模板DNA合成中存在的技术问题，本发明提供了一种以自动移液工作站为核心的方法，可以在极少的人工干预下进行对乃至真核基因组(>10000，000 base pair)的DNA序列进行自动化合成。由于该自动化合成中心仅需要最小化的人工干预，整个合成过程在无菌条件下进行，极大程度的减少了对样品的污染。其次自动化移液站可以非常精准的提取和释放定量的试剂，避免了人工操作的引入的误差，使得成功率大大提高。该自动化合成中心的操作速度大大超过了人工操作，而且可以无休全速工作，使得生产效率上升，同时通过减少误差减少人力和时间，达到了大片段DNA的高通量高保真自动化合成和合成成本的大幅下降。本发明所说的长链无模板DNA的高通量高保真自动化合成方法，包括以下步骤
(1)用户指定需要合成的DNA序列；
(2)系统通过运行内置的计算机辅助设计程序对DNA序列进行分析计算。该计算机程序将长链DNA分隔成多个750碱基(bp)大小的生物组件(Building block)，相邻两个生物组件之间有一定的重叠序列(一般60 - 75bp)。这些生物部件最终可以拼接成用户指定的合成DNA序列。计算机程序进一步将每个生物组件分隔成16 - 20个有一定重叠的长度为60 — 79bp的单链核苷酸。这些单链核苷酸已经有成熟且价格合理的合成方法，可以从多种来源获得，或者可以自己合成。(通过进行多次聚合酶链反应(PCR)可以将这些核苷酸精确构成双链的生物组件，并且在每次聚合酶链反应后进行长度检测(可以通过凝胶电泳或者bioanalyzer等方式)。最后将这些生物组件拼成目的合成DNA序列；
(3 )计算机程序最终输出机器代码用于操作自动化移液站。经过编程，该自动化移液站可以精确无误的将单链核苷酸进行混合，并添加定量的反应酶及各种试剂，而后进行聚合酶链反应，质粒转座和后续的质量监控步骤；
(4)通过进行多次聚合酶链反应(PCR)可以将这些核苷酸精确构成双链的生物组件，并且在每次聚合酶链反应后进行长度检测(可以通过凝胶电泳或者bioanalyzer等方式)。在生物组件合成之后，将进行DNA分析保证每个碱基都是正确的。最后自动化中心将挑选正确的生物组件，最终拼装成目的合成DNA送交用户。本发明的自动化合成工作站的核心部分是多个可自由旋转，可抓取目标物品的机械臂；多个自动移液装备，可以定量提取和释放试剂；一个可供机械臂进出的一 20°C冰箱用以存放生物样品；多个气动滑动装置，可以将各种孔板从起始位置移动到目标位置；条形码读取器，用以读取孔板上面的条形码从而迅速确定孔板的类型；可控温部件，可以对生物样品进行定温处理；多台过滤风扇，将无菌冷空气不断吹入合成中心内部，使中心保持压强大于外界，从而避免外界空气污染；多台可由机械臂操作的高速离心机；多台可由机械臂操作的，可控温的孵化器；多台可由机械臂操作的PCR机器；一台生物分析仪；一台光密度分析仪；多台用以控制自动化合成中心的计算机。
具体实施例方式实施例I :合成大片段DNA序列代号“SEQ”。I)用户指定需要合成的DNA序列如某序列代号“SEQ”。2)自动化合成工作站系统通过运行内置的计算机辅助设计程序对DNA序列 “SEQ”进行分析计算。该计算机程序将长链DNA分隔成多个750碱基(bp)大小的生物组件 (Building block)，相邻两个生物组件之间有一定的重叠序列(一般60 — 75bp)。计算机程序进一步将每个生物组件分隔成16 - 20个有一定重叠的长度为60 - 79bp的单链核苷酸。3)用DNA合成仪合成单链核苷酸或者通过外包给基因公司等方式获得60_79bp 的目标单链核苷酸，并储存在自动化工作站的一 20 V冰箱内。4)计算机程序最终输出机器代码用于操作自动化移液站。经过编程，该自动化移液站可以通过机械臂将单链核苷酸提出，经由自动化移液装备精确无误的将单链核苷酸进行混合，并精确添加定量的反应酶及各种试剂，而后由机械臂送入PCR仪中进行多次聚合酶链反应。5)通过进行多次聚合酶链反应(PCR)可以将这些核苷酸精确构成双链的生物组件，由机械臂将每次聚合酶链反应后的生物组件送入生物分析仪进行长度检测，之后再送入光密度分析仪进行DNA分析保证每个碱基都是正确的。6) 最后自动化中心将挑选正确的生物组件，最终拼装成目的合成DNA送交用户。
权利要求
1.长链无模板DNA的高通量高保真自动化合成方法，包括以下步骤(I)用户指定需要合成的目的DNA序列；(2)分割为生物组件对要合成的DNA序列进行分析计算，将长链DNA分隔成多个750 碱基大小的生物组件，相邻两个生物组件之间有一定的重叠序列；(3)分割为单链核苷酸将每个生物组件分隔成16- 20个有一定重叠的长度为60 -79bp的单链核苷酸；(4)合成单链核苷酸常规方法合成上述单链核苷酸；(5)合成生物组件计算机程序最终输出机器代码用于操作自动化移液站；经过编程， 该自动化移液站可以精确无误的将单链核苷酸进行混合，并添加定量的反应酶及各种试剂，而后进行聚合酶链反应，质粒转座和后续的质量监控步骤；通过进行多次聚合酶链反应将这些核苷酸精确构成双链的生物组件，并且在每次聚合酶链反应后进行长度检测；在生物组件合成之后，将进行DNA分析保证每个碱基都是正确的；(6)最后挑选正确的生物组件，最终拼装成目的DNA。
全文摘要
长链无模板DNA的高通量高保真自动化合成方法。本发明提供了一种以自动移液工作站为核心的方法，可以在极少的人工干预下进行对乃至真核基因组(>10000,000basepair)的DNA序列进行自动化合成。由于该自动化合成中心仅需要最小化的人工干预，整个合成过程在无菌条件下进行，极大程度的减少了对样品的污染。其次自动化移液站可以非常精准的提取和释放定量的试剂，避免了人工操作的引入的误差，使得成功率大大提高。该自动化合成中心的操作速度大大超过了人工操作，而且可以无休全速工作，使得生产效率上升，同时通过减少误差减少人力和时间，达到了大片段DNA的高通量高保真自动化合成和合成成本的大幅下降。
文档编号C12N15/10GK102604930SQ201110024308
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月22日 优先权日2011年1月22日
发明者郑涛, 陈怡露 申请人:郑涛, 陈怡露