专利名称：一种低压直流控制的连续流细胞电融合芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物细胞电融合技术。具体涉及一种可以在低压直流电信号条件下实现连续不断细胞融合的芯片装置，包括微通道及微电极设计、细胞的进样、细胞的勻速流动、细胞电穿孔及融合、融合细胞的收集。
背景技术：
细胞融合方法源于动物细胞研究。1962年日本学者罔田善雄用紫外光灭活的仙台病毒在体外诱导艾氏腹水瘤细胞的融合，首次实现了人工细胞融合方法。但是，病毒诱导的细胞融合产率极低，难以满足日益增长的研究及应用需求，科学家开始寻求更好的融合诱导方法。1974年华裔加拿大科学家高国楠发现聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了化学诱导的细胞融合方法，使细胞融合率较病毒诱导方法有了很大提高。由于细胞融合在生物、医学、药学等方面的巨大应用潜力，来自生物、医学、物理学等领域的各国科学家相继投身该研究方向。上世纪八十年代，美国科学家Zimmermarm 将新兴的电子技术用于细胞融合，率先提出了细胞电融合方法，即在高频交变电场的作用下使细胞极化形成电偶极子，进而沿电力线方向彼此粘连成串，然后给予瞬时高压脉冲，使细胞膜可逆性电击穿，从而引起细胞融合。与传统病毒介导和化学融合方法相比，细胞电融合的优点在于融合率高，操作简便、快速，对细胞无毒害，可以显微观察，诱导过程可控性强，适于仪器应用和规范操作等。因此，细胞电融合方法自提出之后就得到了广泛应用。尽管传统电融合方法在细胞融合研究中得到了广泛应用，但异源细胞配对仍然是随机进行，融合方向不可控制，融合率较高但目标配型的融合成功率仍然很低。而且，操作的自动化、成本、产率、融合细胞分离等方面还难尽人意。从上世纪末到本世纪初，随着微加工技术和微机电系统(micro electro mechanical systems, MEMS)技术的迅猛发展，微操作方法对细胞的控制更加精确有效，细胞电融合研究也逐渐进入微观层次。如日本科学家 Musuda等人在1989年就开始用微流控装置来实现细胞电融合。最近几年，微芯片单细胞电穿孔和细胞介电电泳控制技术取得了很多新成就，国际上多个实验室相继将这些新技术与细胞电融合技术相结合，以期解决传统细胞电融合方法所遇到的困难。尽管微系统技术的应用使细胞电融合在可控性、可观察性以及融合率方面有了很大提高，但是还没有很好解决异源细胞的准确配对、大量融合细胞的快速获得以及融合细胞的有效分离等几个难题。利用显微条件下的微操作虽然可以实现准确配对，但它是以牺牲效率为代价的。美国MIT的Skelley等人最近提出了一种微流控细胞配对及融合方法， 使异源细胞的配对率有了很大提高。但是，该方法所采用的微芯片结构相当复杂，加工要求高，细胞大小也有限制。而且，和现有的绝大多数细胞电融合方法一样，细胞融合是批次进行的，即大量细胞同时进入芯片，完成一次融合操作后再同时进行分离提取操作。因此，整个装置的融合产率仍然不高。在二维微电极阵列细胞融合等方法中，采用大量电极可以提高融合量，但是由于融合腔体尺寸的限制，产量仍然很有限，难以满足那些需要大量融合细胞的研究或者应用需求。而且，电极数量大，加工难度也成倍提高。连续流操作是微流控系统中克服批次操作效率低下的有效方式，但是在早期细胞电融合芯片研究中一直找不到合适的结构设计来有效实现连续流操作。Wang等人曾提出了一种连续的直流电融合方法，利用微加工技术在一个直通道中形成一系列狭缝，在通道两端的电极加载上高压直流电。由于狭缝处的电力线更加密集，电场强度也更高，当细胞对连续通过这些狭缝时，在瞬时高场强作用下实现穿孔融合。这一方法为实现连续流细胞操作提供了一种新的思路，有望解决细胞融合效率不高、融合系统复杂等问题。但是，该方法中，高电压和大电极的使用对细胞活性和无菌操作都带来不利影响。国内外相关专利如下 200610054121. χ, 2006年，重庆大学，赵志强等； CN1482234，2003年，中国科学院上海技术物理研究所，张涛等； CN86210174,1995年，辽宁肿瘤研究所，梁伟；
4326934，April 27，1982，Pohl ； 441972, April 10，1982，Pohl ； 4578168，March 25， 1986， Hofman； 4695547， September 22， 1987， Hillard; 4699881， October 13， 1987， Matschke et. al； 5007995， April 16， 1991， Takahizuki。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提出一种基于微电极阵列和低压直流操作的连续流细胞电融合芯片，通过微电极阵列设计，在较小电压条件下实现细胞穿孔融合。采用低压直流电场而不是高压交流电场，对电控制部分的要求更低，降低了融合仪器的复杂性和成本，对细胞的损伤也相应减小。同时，连续流的操作可以让融合过程持续不断进行，大大提高融合产率。本发明的技术方案如下
一种用于连续流细胞电融合的微电极阵列芯片，所述芯片包括基底和盖片，所述基底上有微加工方法刻制而成的可供细胞悬液连续流动的微通道和给细胞电刺激的微电极阵列，盖片键合或粘合在基底上，其上有进出样孔道，与基底上的微通道连通。所述基底的底部两侧各固定有金属支撑片。所述基底从下至上依次由硅质基底层、二氧化硅绝缘层、低阻硅电极层和二氧化硅保护膜构成，采用微加工技术在低阻硅电极层7上刻蚀凹槽至二氧化硅绝缘层形成微通道，在基底与盖片键合后，微通道形成封闭的流路，液体只能在微通道中流动。在所述基底的微通道的中间区域的两侧，由低阻硅电极层向微通道中心线呈梳齿状突出形成一系列微电极，两侧的微电极成对分布，构成微电极阵列，相同一侧的微电极电气连通，两侧微电极之间由二氧化硅绝缘层进行隔离。 在所述微通道两侧的基底边缘，留出一部分未覆盖二氧化硅保护膜的低阻硅电极层，形成引线接出部，金属引线分别经由两侧的引线接出部，与基底底部两侧的金属支撑片连接，金属支撑片通过导线外接直流电源，将电信号引入到芯片。 细胞融合过程中，首先利用生化方法把两个细胞耦联在一起，然后使用微量进样泵将细胞悬液通过盖片上的进样孔道推进到芯片中并使其在微通道中勻速连续流动，直流电源产生的低压直流电信号通过金属导线加载到微电极阵列上，分布在微通道两侧的微电极上分别加载不同极性的电信号，电极对间微小的间距形成局部高场强电场，对流过它们之间的细胞对的瞬时作用类似于作用在细胞对上的电脉冲，从而使细胞膜穿孔并融合，融合的细胞通过出样孔道连续不断流出芯片进行收集。本发明的基底材料可采用硅、玻璃等硬质材料，在基底上通过微加工方法蚀刻一条或多条微通道。导电基底材料在微通道加工完成后需要处理通道表面及与金属支撑片相邻表面，保证它可以与后面加工的微电极和金属支撑片绝缘。所述微通道为直线通道。考虑到生物细胞的典型尺寸在广50 μπι，芯片中的微通道深度和宽度根据实验细胞的差异而改变，通常通道深度设定在4(Γ100 μ m，宽度设定在 100 200 μm0微电极宽度为2(Γ200 μ m,电极末端与中心线的距离根据微通道及实验细胞尺寸而定，一般在2(Γ50 μπι。所述微电极呈成对分布于微通道两侧，微电极对数目一般在;TlO 对。微电极在微通道两侧的相对排布方式分为对称形式，即两边的微电极呈现水平对称的排布方式，或者交错形式，即两边的微电极呈现相对交错的排布方式。交错形式的微电极对分布可以在相互垂直的方向给与细胞电刺激，有利于提高细胞的融合率。相同一侧的微电极加工在同一导电体上或者用导电材料相互连接，分布在通道两侧的微电极互相绝缘。微电极阵列经金属引线与基底下面的金属支撑片连接，然后通过导线与外接电源相连，微电极之间的微通道为细胞融合的工作通道。金属支撑片为分开的两块，分别连接来自通道一侧微电极的引线。所述微电极阵列中的微电极结构一致，均为圆形柱状、矩形柱状、多边形柱状或者为圆形锥状、矩形锥状、多边形锥状结构
基底与盖片合在一起后，微通道两端与进样孔道和出样孔道相连，外接导管插入通道孔中固定，使芯片内外流路连接形成完全封闭的流路，可以排除外来污染，实现融合过程的无菌化操作。细胞悬液可以通过进样孔道泵入芯片内，在微通道中连续勻速流动。在细胞对通过相对微电极时，由于该区域的高电场强度，细胞对会受到类似电脉冲的电刺激，在经过几个相同刺激后，细胞发生穿孔及融合。细胞融合是在流动过程中连续不断进行的，可以达到连续、大量融合细胞的目的、提高细胞的融合产率。基于微电极阵列的连续流细胞电融合芯片可以采用集成电路(IC)加工工艺、MEMS 加工工艺以及软光刻加工工艺等微加工方法。本发明与现有技术相比较，具有以下技术优点
1、连续流细胞融合细胞融合是在细胞悬液流动过程中连续不断进行的，不会受到传统细胞融合方法中融合池体积的限制，其产率，使用的自动化程度以及防污染、抗干扰程度都有很大提高。2、以微加工方法来制造微通道和微电极，缩短了相对电极的间距，在低电压条件下可以获得细胞融合需要的电场强度，保证了操作人员安全，也减小了细胞损伤。同时，利用细胞对流经电极间的电脉冲效应使细胞融合，只需要直流稳压输入即可实现，避免了传统方法中需要正弦交流信号、脉冲信号等非直流稳压信号输入，对电源信号设备要求大大降低，可靠性更好，系统成本更低。
3、芯片中电极对数量为3 10对，大大少于传统细胞电融合芯片中成千上万对的数目。因此，芯片结构简单，加工难度和造价都大大降低。
图1是基于微电极阵列的连续流细胞电融合芯片示意图； 图2是基于微电极阵列的连续流细胞电融合芯片结构装配图； 图3是基于微电极阵列的连续流细胞电融合芯片基底示意图； 图4A是微电极阵列结构示意图——对称形式；
图4B是微电极阵列结构示意图——交错形式。
具体实施例方式参见图1和图2，连续流微电极阵列细胞电融合芯片由基底1、盖片2、连通内外流路的进出样导管3、金属支撑片4组成。芯片的基底1的结构参见图3，采用硅材料，从下至上依次由硅质基底层5、二氧化硅绝缘层6、低阻硅电极层7和二氧化硅保护膜8构成，采用微加工技术在低阻硅电极层7 上刻蚀凹槽至二氧化硅绝缘层6形成微通道9，两边的微通道9是直线型的，中间区域的微通道在通道两侧分布有梳齿状的一系列微电极10，这些梳齿状的微电极是在微通道的两侧由低阻硅电极层7向微通道中心线方向呈梳齿状突出而形成的，两侧通道壁上的微电极成对分布，构成微电极阵列，两侧微电极之间由表面的二氧化硅绝缘层进行隔离，而同一侧的微电极这是导通的。在基底1与硅玻璃盖片2键合后，微通道形成封闭的流路，液体只能在通道中流动。根据芯片尺寸的不同，在芯片上可以集成一到多条微通道，电极的尺度及电极间的间距可以根据试验对象的不同进行调整，电极对数目为3 10对。在微通道两侧的基底边缘，留出一部分未覆盖二氧化硅保护膜的低阻硅电极层，形成引线接出部11，金属引线 12分别经采用键合或焊接工艺由两侧的引线接出部11引出，与各自一侧的金属支撑片4相连，金属支撑片4通过导线连接电源。该芯片上构造的直线型微通道有助于细胞悬浮液的流动，尽可能降低细胞在流动过程中的黏附，保证流动的稳定性并减少细胞淤积。芯片键合后，在盖片的进样口 13和出样口 14中分别插入进出样导管3。融合实验中，利用生化耦联 (如生物素细胞标记后，用亲和素把标记的细胞连在一起)把细胞悬液中的细胞连在一起形成细胞对，然后细胞悬液在微量泵的驱动下通过进出样导管3及进样口 13进入芯片，细胞悬液在微通道9中勻速运动，当细胞对流经一对微电极10时，微电极对间的高场强电场将对细胞对施加电刺激，由于细胞对流经微电极对的时间较短暂，该刺激类似传统细胞融合方法中的电脉冲，脉冲作用时间即细胞对流经该电极对的时间。细胞在一系列电刺激作用下发生穿孔融合，融合细胞经出样口 14和导管3流入收集容器。封闭的微通道9、进样口 13、出样口 14、导管3—起构成封闭的流路，可以对细胞悬液开展连续、自动操作，提高操作效率和可靠性，还可以排除外界干扰。连续不断的细胞融合操作也可以在短时间内获得大量融合细胞，提高产率，达到高效细胞融合的目的。图4显示的是微电极10所组成的阵列和微通道9的局部，微电极10分布于微通道9的两侧，相对微电极阵列上微电极排布方式分为对称形式(见图4A)，即微电极呈现水平对称的排布方式，或者交错形式(见图4B)，即微电极呈现交错对称的排布方式排布。微通道9的深度为50 μ m,宽度为140 μ m，微电极10的末端距离通道中心线为20 μ m。进样口 13和出样口 14的直径为2500 μ m，利用激光切割方法加工。进出样导管3的尺寸为内径800 μ m，外径2500 μ m,以充分保证细胞能够顺利的进入通道内部。图3中，硅质基底层5尺寸为2 cm X 3 cm，厚度为500 μ m，为芯片提供足够强度的支撑；二氧化硅绝缘层6的尺寸为2 cm X 3 cm，厚度为10 μ m，使芯片不怕高强度的静电击穿，保障芯片的电气稳定性；低阻硅电极层7尺寸为2 cm X 3 cm，厚度为50 μ m， 即融合通道的深度。低阻硅内应力很小、机械性能好，低电阻率可以改善芯片电气性能，提高融合效率。在低阻硅电极层7上由等离子增强化学气相沉淀法(PECVD)工艺实现二氧化硅保护膜8，提高芯片的抗氧化能力。金属支撑片4的尺寸为0. 5 cm X 3 cm，厚度为0.5 mmD上述连续流细胞电融合芯片的加工工艺为
(1)选取顶层硅有50μ m厚的绝缘体上硅结构材料；
(2)隔离扩散，完成顶层低阻硅深度推结；
(3)顶层低阻硅氧化，氧化层厚度为55(T600nm；
(4)光刻二氧化硅；
(5)溅射硅铝Si-Al形成引线层，引线层厚度为2士 0.2 ym；
(6)光刻引线;
(7)合金;
(8)等离子增强化学气相沉淀PECVD工艺实现二氧化硅绝缘钝化，二氧化硅钝化层厚度为 1. 5 士 0. 2 ym ；
(9)光刻;
(10)干法腐蚀二氧化硅；
(11)干法腐蚀硅，深度为50ym，直至绝缘层，以让各交叉梳状电极电器结构上互不相连，并形成微通道；
(12)干法去胶;
利用加工完成的微电极阵列基底与盖片键合，键合好的芯片与金属支撑片通过黏合剂进行固定，然后通过键合技术用金丝将芯片上各微电极阵列与对应金属支撑片相连，将导管插入进样口和出样口形成密闭的微通道。
权利要求
1.一种用于连续流细胞电融合的微电极阵列芯片，所述芯片包括基底和盖片，所述基底上有微加工方法刻制而成的可供细胞悬液连续流动的微通道和给细胞电刺激的微电极阵列，盖片键合或粘合在基底上，其上有进出样孔道，与基底上的微通道连通；其特征在于所述基底的底部两侧各固定有一个金属支撑片；所述基底从下至上依次由硅质基底层、二氧化硅绝缘层、低阻硅电极层和二氧化硅保护膜构成，采用微加工技术在低阻硅电极层上刻蚀凹槽至二氧化硅绝缘层形成微通道，在基底与盖片键合后，微通道形成封闭的流路，液体只能在微通道中流动；在所述基底的微通道的中间区域的两侧，由低阻硅电极层向微通道中心线呈梳齿状突出形成一系列微电极，两侧的微电极成对分布，构成微电极阵列，相同一侧的微电极电气连通，两侧微电极之间由二氧化硅绝缘层进行隔离；在所述微通道两侧的基底边缘，留出一部分未覆盖二氧化硅保护膜的低阻硅电极层， 形成引线接出部，金属引线分别经由两侧的引线接出部，与基底底部两侧的金属支撑片连接，金属支撑片通过导线外接直流电源，将电信号引入到芯片；细胞融合过程中，首先利用生化方法把两个细胞耦联在一起，然后使用微量进样泵将细胞悬液通过盖片上的进样孔道推进到芯片中并使其在微通道中勻速连续流动，直流电源产生的低压直流电信号通过金属导线加载到微电极阵列上，分布在微通道两侧的微电极上分别加载不同极性的电信号，电极对间微小的间距形成局部高场强电场，对流过它们之间的细胞对的瞬时作用类似于作用在细胞对上的电脉冲，从而使细胞膜穿孔并融合，融合的细胞通过出样孔道连续不断流出芯片进行收集。
2.根据权利要求1所述的用于连续流细胞电融合的微电极阵列芯片，其特征在于所述微通道为直线通道，微通道深度设定在4(Γ100 μ m,宽度设定在10(Γ200 μ m。
3.根据权利要求1或2所述的用于连续流细胞电融合的微电极阵列芯片，其特征在于 所述微电极的宽度为2(T200 ym，微电极末端与微通道中心线的距离为2(Γ50 μ m。
4.根据权利要求1、2或3所述的用于连续流细胞电融合的微电极阵列芯片，其特征在于所述微通道两侧的微电极相对的排布方式为对称形式，或者交错形式；微电极对的数目为3 10对。
5.根据权利要求1、2或3所述的用于细胞电融合的微电极阵列芯片，其特征在于所述微电极阵列中的微电极结构一致，均为圆形柱状、矩形柱状、多边形柱状或者为圆形锥状、矩形锥状、多边形锥状结构。
全文摘要
本发明提出了一种可用于连续流细胞电融合的微电极阵列芯片，由基底、盖片和金属支撑片三层组成，基底上有可供细胞悬液连续流动的微通道和给细胞电刺激的微电极阵列，微电极阵列刻制于微通道的两侧，微电极阵列通过微孔由金属引线与金属支撑片连接，然后通过导线连接直流电源，引入电信号。本发明结构简单，微电极数量很少，使加工难度大大低于高密度微电极细胞电融合芯片；所需融合电压为直流低电压，对设备要求很低，装置成本远低于传统细胞电融合方法；同时，细胞融合是在细胞对流经微通道过程中连续不断进行的，融合产率也大大高于传统细胞电融合方法，这些都有利于其推广应用。
文档编号C12N15/02GK102174387SQ20111002692
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者侯文生, 曹毅, 杨军, 杨静, 罗洪艳, 胡宁, 郑小林, 黄小玲 申请人:重庆大学