专利名称：一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌es026的制作方法
技术领域：
本发明属于药用植物和农业微生物技术领域，具体涉及从药用植物蛇足石杉中分离一株内生真菌，该菌株为炭疽属胶孢种(c. gloeosporioides),它能产生石杉碱甲或类似物，可用于大量生产石杉碱甲或类似物。
背景技术：
随着世界人口老龄化,阿尔茨海默病(Alzheimers' disease, AD,老年痴呆)已经成为全球性的公共健康问题。老年痴呆患病率高、病程长，是所有慢性疾病中致残率最高的疾病之一，这将给家庭和社会都带来极大的疾病负担。根据国际阿尔茨海默联合会2009年发布的最新预测，到2010年，全球痴呆患者人数将达到3，560万，2030年达到6570万，
2050年痴呆患者数量将达到I. 154亿，其中59%的患者在亚洲。几十年来，随着人们对AD的认识，增强胆碱能神经的传递已经成为减缓相关的认知障碍症状主要战略之一。如多奈哌齐、他克林或加兰他敏，在临床治疗上已被证明具有治疗潜力，已被美国和一些欧洲国家批准用于AD的治疗。分离自我国药用植物蛇足石杉(Hupperzia serrata)(俗称千层塔)的生物碱石杉碱甲(huperzine A, Hup A)类似或优于那些已被批准临床应用的AChE抑制齐U，具有长效、低毒、口服利用度高等特点，是治疗AD的一个前景药物。目前石杉碱甲生产还是依赖于从蛇足石杉植株中提取，存在以下缺点1.蛇足石杉属于高等蕨类植物，由于其生长缓慢，孢子萌发率低，使得野生资源匮乏(Ma X，etal. The Lycopodium alkaloids [J]. Nat. Prod. Rep. , 2004, 21 :752-772. ) 2.人工栽培技术尚未攻克(Li N. Study on the effect of Promote growth on host and fermentationProducts of endophytic fungi from Huperzia serrata[D]. 2007.) 3.植株体内 HupA含量相对较低(王峻，等.湖南省石杉属植物中石杉碱甲含量的研究[J].中国药学杂志，2005,21 :1616-1618. ) 0 20世纪90年代，掀起了人工合成Hup A的热潮，虽取得一定成绩，但因合成的石杉碱甲活性低、成本高、毒副作用大而无法工业化生产(陈业高，等.石松类生物碱成分研究的新进展[J].云南师范大学学报，2010，30 (6) :12-24. )0以上因素最终导致HupA来源十分短缺，因此寻找石杉碱甲新药源成为必须。目前有从石杉科植物中分离得到的内生菌产石杉碱甲及其类似物的相关报道(见表I)，这些研究表明利用微生物发酵生产石杉碱甲成为一种可能，而采用植物内生真菌发酵生产石杉碱甲无疑是解决石杉碱甲原料来源的绿色途径。但是目前所报道的菌株石杉碱甲产量都存在一个瓶颈问题产量低。这和实现工业化生产所需要的毫克级仍有一段距离。与其它报道中产石杉碱甲的菌株相比，本发明中炭疽属胶孢种(c. gloeosporioides)石杉碱甲产量明显较高，向实现工业化生产更迈进一步。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从蛇足石杉中分离得到一株内生真菌ES026,该菌株为炭疽属胶孢种(C. gloeosporioides),它能产生石杉碱甲或类似物,可用于大量生产石杉碱甲或类似物。本发明的技术方案如下本发明采用逆向筛选的方法，从石杉科植物蛇足石杉活体植物中分离得到植物内生菌的候选菌ES026，经18S rDNA鉴定和微生物学鉴定证明该菌株属于炭疽属胶孢种(Colletotrichum. gloeosporioides), 2011年2月23日将该菌株送交湖北省武汉市武汉大学内的保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO :M2011046。具体地,本发明所述的炭疽属胶孢种(C. gloeosporioides)ES026菌株的分离及筛选流程如下先从野外(中国湖北省利川市)采集蛇足石杉活体植株，连土一起带回实验室，再选择健康完好的植株进行表面清洁和消毒，无菌条件下对不同组织部位进行切段，接着放置于含有PDA的培养瓶中进行培养，观察菌落生长情况，一般5-7天可看到组织段有丝状真菌长出；对长出的菌落分离纯化培养后进行液体发酵培养，提取菌丝体中的总生物碱，以标准品石杉碱甲做对照，进行HPLC检测，根据图谱筛选产石杉碱甲类似物的菌株；对疑似菌株发酵培养，再次提取总生物碱，利用HSCCC对总生物碱中的石杉碱甲类似物做分离纯化，进行LC-MS分析；对分析后确定产石杉碱甲的菌株进行系统分类学研究，包括形态学和分子生物学水平鉴定。菌株分类学地位的鉴定I.固体培养特征采用PDA培养基(按常规方法，成分土豆200g，切小块后加少量水煮沸，葡萄糖20g，琼脂15g，加水定容至1L)培养炭疽属胶孢种ES026菌株。菌落形态25°C培养3天，菌落直径为30mm，7天时基本长满整个培养皿，菌落为圆形，前期为白色，后变为青灰色；菌落中间深灰色，绒毛状，生长稍微蓬松，菌落边缘相对整齐，菌落背面可见黑色同心轮纹，外缘呈现黄褐色。菌丝形态无色有隔菌丝。产孢特征产孢细胞瓶颈式，分生孢子圆筒形或长椭圆形，有时一端稍小，单细胞无色，具有I 2个油球；在PDA培养基上，产孢量低，孢子大小为10. 62 21. 38(15. 21) X 4. 65 6. 02(5. 16) u m。2. ITS序列测定I)提取菌丝体总DNA (见实施例I)。2)以 ITSl(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)和ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATAGC-3，)为引物，扩增出18S rDNA序列，经过测序，得到如序列表SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。3)将测序结果递交 http: //blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast 进行序列比对，根据BLAST结果并结合其形态学特征得出结论，证明该分离的菌株属于炭疽属胶孢种(C. gloeosporioides)。本发明的效果 I.本发明为新药源石杉碱甲的开发提供了一株新的微生物。2.本发明所述对象属于微生物领域，具有生长繁殖迅速，不受季节、气候和地域限制，产量提升空间大等优点。 3.本发明成功避免过度采挖蛇足石杉野生植物资源，有效保护生态环境，实现环境友好型和资源节约型的资源永续利用。本发明具有潜在的开发应用前景，其发明效果见表I所示。表I本发明与现有技术的比较
权利要求
1.一株从石杉属植物蛇足石杉植物活体中分离得到的内生真菌，其特征在于该菌株是炭疽属胶孢种(Colletotrichum gloeosporioides) ES026,保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO :M2011046，该菌株产生石杉碱甲。
2.根据权利要求I所述的胶孢炭疽菌在提取石杉碱甲或石杉碱类化合物的应用。
全文摘要
本发明属于药用植物和农业微生物技术领域，具体涉及从药用植物蛇足石杉中分离一株内生真菌，它能产生石杉碱甲或类似物，可用于大量生产石杉碱甲或类似物。本发明分离的内生真菌ES026经分子生物学和形态学鉴定为炭疽属胶孢种Colletotrichum gloeosporioides)，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM2011046。本发明显著的特征是该菌株经液体发酵后能产具有可逆性抑制乙酰胆碱酯酶的活性物质，经高效液相色谱和质谱分析表明该化合物为石杉碱甲(HupA)，为治疗老年痴呆症提供了新药源。
文档编号C12P17/18GK102653720SQ20111005052
公开日2012年9月5日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者徐晓苗, 徐海杰, 王沫, 舒少华, 赵昕梅 申请人:华中农业大学