专利名称：一种固定化脂肪酶制备方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术：
酶与载体间的共价结合是基于化学反应，即酶表面(A)的活性氨基酸残基与载体表面(B)的活性官能团之间的反应。为了达到有效的共价连接，必须预先活化载体或酶上的有关官能团。一般情况下预先活化载体上的有关官能团，然后与酶发生共价结合。在少数情况下，如当需要控制结合方式或共价键数目时，则预先活化酶分子上的有关官能团，然后与载体发生共价结合。酶固定化后，既能保持酶的催化活性又能克服游离酶的一些不足，提高酶分子结构的稳定性能与反应物分开，有效地控制生产过程；能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤，简化生产工艺，使食品等产品更好地保持营养成分；固定化酶可在生产中反复连续使用，提高了酶的利用率。可是，酶固定化对载体材料具有很高的要求，如要有良好的机械强度，良好的热稳定性和化学稳定性，良好的抗微生物特性及酶的结合能力等。载体材料的价格还直接影响固定化酶能否真正用到实际生产中。由于难以找到理想的载体材料，再加上酶在固定化过程中不可避免地损失部分活力，甚至当固定方法不得当时会损失绝大部分活力等原因，到目前为止也只有十几种固定化酶应用于生产中。我国的固定化酶研究工作始于70年代初， 在这一领域的研究具有相当高的水平，如β 一硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)是我国首先使用的一种高效双官能团试剂，但我国尚未见商品的固定化酶专用载体。因此，近十年来，我国酶学专家与国外专家学者一样把酶固定化技术的研究重点集中于固定化方法和载体材料的开发上，以便找到更简便实用的固定化方法和性能优良的载体。葡聚糖也是固定化酶常用的载体材料，近年来，不断有葡聚糖的改性载体及其固定酶的方法被研究和发现。纤维素是最丰富的天然有机物，用不同取代基取代羟基可制得多种改性纤维素， 是固定化酶的良载体。日本用二乙氨乙基(DEAE)纤维素载体吸附固定葡萄糖异构酶，用于生产高果糖浆，用二乙氨乙基(DEAE)纤维素引入氨基以提供多价阳离子一弱碱性阴离子交换剂.它是最常见的酶固定化载体之一。DOW公司生产的空心纤维为酶固定化的专用载体， 它是由醋酸纤维素和其它纤维素构成的。目前商品化的固定化脂肪酶是诺维信公司(Novozymes)用大孔树脂吸附的脂肪酶。由于采用多种改性纤维素、树脂作为载体，使固定化酶的成本偏高，而且吸附法存在着酶有效截留率较低、PH及温度稳定性较差、酶易脱落、反应扩散阻力较大等问题。有报导以纤维素为主要成分的帆布作脂肪酶的固定化载体。相对于树脂而言，纤维素是天然可再生的材料，而且易得、价廉。纤维素结构中存在着大量的羟基，通过高碘酸钠将连接邻二羟基的碳键(C2、C3位键)氧化成醛基，继而与酶蛋白上的胺基进行醛胺缩合反应形成希夫碱，通过共价交联得到固定化脂肪酶。当以致密的帆布为载体时，醛基与酶的接触阻碍作用将可能成为影响酶活性的主要因素。一种原因是一部分醛基处于帆布的内部，遇水后相邻的羟基间形成分子内氢键，阻挡了醛基与酶蛋白的接触；另一个原因是致密的纤维充水膨胀后，表面水膜的静电张力阻挡了酶等大分子的进入，影响了传质。且干粉酶中一些不容易去除的吸附性物质也粘附于纤维基团表面，阻碍了交联反应的进行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是筛选出一种合适、价廉的固定化载体天然有机高聚物，它是以天然多年生宿根性草本植物的纤维素特别是天然纤维一苎麻作为载体。本发明根据固定化载体特点从上述常用的固定载体中筛选出一种合适、价廉的固定化载体天然有机高聚物天然纤维一苎麻。^5) [Boehmeria nivea (Linn.)Gaudich] ^4^Urticaceae, [ ] U 苎麻、白麻、圆麻，是多年生宿根性草本植物，是重要的纺织纤维作物。苎麻纤维成份是纤维素，其单纤维长、强度最大，单纤维长度为60-250mm，是麻类作物中最长的。直径17-64 μ m, 横断面呈多角形、椭圆形。采用天然纤维一苎麻为载体材料，利用高碘酸钠氧化法使苎麻表面纤维相邻羟基通过反应脱水得到醛基再与酶表面游离氨基酸生成希夫碱，从而达到固定化酶的目的。本发明提供的具体技术方案如下
一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征是以以天然多年生宿根性草本植物特别是天然纤维一苎麻和猪胰脂肪酶为原料，以苎麻为脂肪酶的载体，对苎麻进行活化、猪胰脂肪酶液制备，然后采用共价交联的方法进行脂肪酶的固定化； 本发明以苎麻为载体固定化猪胰脂肪酶的制备方法如下
本发明选择天然纤维一苎麻为载体，包括将苎麻的活化、猪胰脂肪酶液制备和交联三个步骤
(1)苎麻的活化剪取若干苎麻，用0. 5—l.Omol/ L KOH煮沸0. 5 — 1. O小时除去苎麻表面的杂质，然后用0. 1—0. 6 mol/L浓度的NaI04溶液氧化，5-12小时后取出用去离子水洗净，加甘油于苎麻表面静置30-60 min,以除去未反应的NaI04，用去离子水洗净待用。(2)酶液制备将一定量猪胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸缓冲液(0. 025-0. 500mol/ L，pH 7. 5)中，4°C低温下搅拌均勻，在10000r/min转速下离心10 min,然后取上清液贮于冰箱内备用。(3)交联将步骤(1)活化的苎麻置于锥形瓶中与步骤( 得到的酶液在4°C下进行交联，每交联30-60分钟，震荡10-30分钟，反应2-6个小时。交联完毕后，用去离子水在室温下反复洗涤固定化酶5-10次以上，以确保苎麻表面未交联上的游离酶被洗下。为提高醛基的交联度，采取重复步骤C3)的方法进行反复交联。每次取出苎麻后，用滤纸吸干苎麻表面水分，再放入酶液中进行交联。本发明实验结果如下 (1)固定化酶的稳定性比较
与游离猪胰脂肪酶相比，固定化后的酶对温度、PH和离子强度等的稳定性都得到了提高。如图1所示，固定化酶在较高温度下仍具有较高的催化活性(为初活的70%左右)，而游离酶的活性则只有原来的40%。温度越高则对比越明显。由此说明酶固定化后提升了其使用空间。由图2可以看出，游离酶在强碱条件下，出现了酶蛋白必需基团的电离，使酶出现肤键水解、脱氨基等现象，导致酶的速速失活。固定化后的猪胰脂肪酶对PH值的灵敏度降低，提高了运用范围。金属离子对酶具有激活作用，但是游离酶对金属离子的浓度比较敏感，高浓度的金属离子浓度反而会抑制酶的活性。固定化酶在强金属离子浓度中表现出了较高的稳定性。添加有机溶剂可以促使反应体系中油水两相的互溶，并且可以降低甲醇对酶的毒性，但是由于有机溶剂会改变酶的疏水基团微环境，从而影响酶活。从图4可以看出，游离猪胰脂肪酶受有机溶剂添加的影响显著。与游离酶相比较，固定化后的猪胰脂肪酶几乎没受到影响。这点在生物柴油的制备过程中尤为重要。实验表明，以天然纤维一苎麻为载体，利用高碘酸钠将其氧化成醛残基。通过在载体上的醛基与酶分子中的氨基之间形碱而实现固定化的方法是可行的。通过氧化剂的浓度和氧化时间的实验，是载体表面的醛残基达到较高的浓度。并比较了游离猪胰脂肪酶与固定化后的猪胰脂肪酶在温度、PH、金属离子、有机溶剂等方面的差异性。实验证明固定后的猪胰脂肪酶在各方面的特性明显优于游离的猪胰脂肪酶。将固定化脂肪酶在酯化反应后回收连续重复使用13次，脂肪酶的活性保持率大于80.096，提高了脂肪酶的利用率，降低了因脂肪酶所致的产品成本。而未固定化的脂肪酶则无法回收重复使用。本发明技术方案带来的有益效果
本发明采用天然纤维一苎麻为载体材料，利用高碘酸钠氧化法使苎麻表面纤维相邻羟基通过反应脱水得到醛基再与酶表面游离氨基酸生成希夫碱，从而达到固定化酶的目的。固定化酶的稳定性是实际应用的一个重要的特征参数，因为较好的稳定性可以使固定化酶具有较长的使用寿命，并可以重复使用。固定化酶的重复利用使催化剂的成本在最终生产成本中占很低的比列。由于所用苎麻来源广泛，价格低廉。固定化脂肪酶催化制备生物柴油，可以反复使用，可大大提高固定化脂肪酶的使用稳定性和催化效果，降低生产生物柴油的生产成本。
图1是温度对固定化酶及游离酶的影响。图2是不同pH值对固定化猪胰脂肪酶及游离猪胰脂肪酶的影响。图3是不同浓度的Ca2+对固定化猪胰脂肪酶和游离猪胰脂肪酶的影响。图4是游离猪胰脂肪酶和固定化猪胰脂肪酶在有机溶剂中的相对稳定性比较。
具体实施例实施例1
本发明选择天然纤维一苎麻为载体，将苎麻的活化、猪胰脂肪酶液制备和交联三个步骤
(1)苎麻的活化剪取若干苎麻，用0. 5mol/ L KOH煮沸0.5小时除去苎麻表面的杂质，然后用0. 1 mol/L浓度的NaI04溶液氧化，6小时后取出用去离子水洗净，加甘油于苎麻表面静置40 min,以除去未反应的NaI04，用去离子水洗净待用。(2)酶液制备将一定量猪胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸缓冲液(0. 025mol/ L， PH 7.5)中，4°C低温下搅拌均勻，在lOOOOr/min转速下离心10 min，然后取上清液贮于冰箱内备用。(3)交联将步骤(1)活化的苎麻置于锥形瓶中与步骤( 得到的酶液在4°C下进行交联，每交联35分钟，震荡15分钟，反应3个小时。交联完毕后，用去离子水在室温下反复洗涤固定化酶5次以上，以确保苎麻表面未交联上的游离酶被洗下。为提高醛基的交联度，采取重复步骤(3)的方法进行反复交联。每次取出苎麻后，用滤纸吸干苎麻表面水分， 再放入酶液中进行交联。实施例2
本发明选择天然纤维一苎麻为载体，将苎麻的活化、猪胰脂肪酶液制备和交联三个步
骤
(1)苎麻的活化剪取若干苎麻，用0. 8mol/ L KOH煮沸0.6小时除去苎麻表面的杂质，然后用0.3 mol/L浓度的NaI04溶液氧化，8小时后取出用去离子水洗净，加甘油于苎麻表面静置50 min,以除去未反应的NaI04，用去离子水洗净待用。(2)酶液制备将一定量猪胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸缓冲液(0. 0. 500mol/ L，pH 7.5)中，4°C低温下搅拌均勻，在lOOOOr/min转速下离心10 min，然后取上清液贮于冰箱内备用。(3)交联将步骤(1)活化的苎麻置于锥形瓶中与步骤( 得到的酶液在4°C下进行交联，每交联50分钟，震荡30分钟，反应5个小时。交联完毕后，用去离子水在室温下反复洗涤固定化酶8次以上，以确保苎麻表面未交联上的游离酶被洗下。为提高醛基的交联度，采取重复步骤(3)的方法进行反复交联。每次取出苎麻后，用滤纸吸干苎麻表面水分， 再放入酶液中进行交联。实施例3
本发明选择天然纤维一苎麻为载体，将苎麻的活化、猪胰脂肪酶液制备和交联三个步骤 (1)苎麻的活化剪取若干苎麻，用1. Omol/ L KOH煮沸1.0小时除去苎麻表面的杂质， 然后用0.6 mol/L浓度的NaI04溶液氧化，12小时后取出用去离子水洗净，加甘油于苎麻表面静置60 min,以除去未反应的NaI04，用去离子水洗净待用。(2)酶液制备将一定量猪胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸缓冲液(0. 025-0. 500mol/ L，pH 7. 5)中，4°C低温下搅拌均勻，在10000r/min转速下离心10 min,然后取上清液贮于冰箱内备用。(3)交联将步骤(1)活化的苎麻置于锥形瓶中与步骤( 得到的酶液在4°C下进行交联，每交联60分钟，震荡30分钟，反应6个小时。交联完毕后，用去离子水在室温下反复洗涤固定化酶10次，以确保苎麻表面未交联上的游离酶被洗下。为提高醛基的交联度， 采取重复步骤C3)的方法进行反复交联。每次取出苎麻后，用滤纸吸干苎麻表面水分，再放入酶液中进行交联。
权利要求
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征是以以天然多年生宿根性草本植物天然纤维比如苎麻和猪胰脂肪酶为原料，以天然纤维为脂肪酶的载体，对天然纤维进行活化、猪胰脂肪酶液制备，然后采用共价交联的方法进行脂肪酶的固定化。
2.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征是，用苎麻为载体，包括将苎麻的活化、猪胰脂肪酶液制备和交联三个步骤(1)苎麻的活化剪取若干苎麻，用0.5—1. Omol/ L KOH煮沸0. 5—1. 0小时除去苎麻表面的杂质，然后用0. 1—0. 6 mol/L浓度的NaI04溶液氧化，5-12小时后取出用去离子水洗净，加甘油于苎麻表面静置30-60 min,以除去未反应的NaI04，用去离子水洗净待用，(2)酶液制备将一定量猪胰脂肪酶干粉溶于50mL的磷酸缓冲液(0.025-0. 500mol/ L，pH 7. 5)中，4°C低温下搅拌均勻，在lOOOOr/min转速下离心10 min，然后取上清液贮于冰箱内备用；(3)交联将步骤(1)活化的苎麻置于锥形瓶中与步骤( 得到的酶液在4°C下进行交联，每交联30—60分钟，震荡10—30分钟，反应2-6个小时；交联完毕后，用去离子水在室温下反复洗涤固定化酶5-10次以上，以确保苎麻表面未交联上的游离酶被洗下，为提高醛基的交联度，采取重复步骤(3)的方法进行反复交联；每次取出苎麻后，用滤纸吸干苎麻表面水分，再放入酶液中进行交联。
全文摘要
一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征是以以天然多年生宿根性草本植物特别是天然纤维-苎麻和猪胰脂肪酶为原料，以苎麻为脂肪酶的载体，对苎麻进行活化、猪胰脂肪酶液制备，然后采用共价交联的方法进行脂肪酶的固定化。苎麻来源广泛,价格低廉。固定化脂肪酶催化制备生物柴油，可以反复使用,可大大提高固定化脂肪酶的使用稳定性和催化效果，降低生产生物柴油的生产成本。
文档编号C12N11/02GK102191236SQ201110092848
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者刘光斌, 刘苑秋, 张露, 杜天真, 胡冬南, 邱自兵, 黄忠, 黄长干 申请人:江西农业大学