专利名称：基于三种生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鲜剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种用于防治柑橘果实病害的生物防腐保鲜技术。
背景技术：
柑橘是产量最大的水果之一，栽培历史悠久。但柑橘产区一般均地处亚热带地区， 温湿度均较适合果实病原菌的生长，每年由于病理性腐烂导致的采后损失巨大。目前，化学杀菌剂是控制果实采后腐烂的主要和最有效方法。但是，随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的增强，化学类杀菌剂的使用范围越来越受限制。 此外由于长期使用杀菌剂，病原菌能进化产生了大量抗药性菌种。因此从可持续发展的角度出发，开发新型、高效且安全的有机、绿色的保鲜剂具有重大的社会意义和广阔的应用前
旦
ο近年来利用安全且有拮抗病原菌活性的酵母防治果实病害的研究受到了国内外广泛的重视，被认为是最有希望的替代化学杀菌剂的方法之一。但现有生防酵母的对病害的控制效力与化学杀菌剂相比仍有较大差距，例如即使是美国的已经商业化生产的产品(Aspire，基于酵母Candida oleophila的商业化产品)也只有在与低剂量杀菌剂 (thiabendazole, TBZ)联合使用时才能达到对柑橘或葡萄等果实主要病害的完全控制。酵母菌株 Rhodosporidium ρ aludigenum Fell&Tallman 是一株从海洋中分离得到的新型果实病害生防酵母。中国发明授权专利《一株水果蔬菜的生物保鲜剂及其制备方法》，专利号200610155209. 0，公开了一种基于红冬孢酵母和尼泊金乙酯钠或尼泊金丁酯钠制备水果蔬菜的生物杀菌剂的方法。中国发明授权专利《用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途》，专利号ZL 200610155062. 5，公开了一种用海洋酵母菌株 Rhodosporidium ρ aludigenum i^ell&Tallman抑制链格孢、灰葡萄孢、扩展青霉、指状青霉、多毛孢等多种果蔬采后主要真菌病害的生物防治方法。中国发明授权专利《一种海洋酵母的用途和相应微生物燃料电池及制备方法》。授权公告号CN101552340B，公开了一种利用红冬孢酵母制备微生物燃料电池的方法。中国发明申请专利《一种防治果蔬病害的生物保鲜剂及其制备方法》，申请号200910095643. 8，公开了一种基于红冬孢酵母和羧甲基纤维素钠等物质防治果蔬病害的生物保鲜方法。中国发明申请专利《海洋酵母Miodosporidum paludigenum Fell&Tallman的专用甘蔗糖蜜培养基》，申请号2010101485270，公开了一种海洋酵母I^hodosporidum paludigenum i^ell&Tallman液体培养的方法。中国发明申请专利《海洋酵母I^hodosporidum paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制》，申请号 2010101400817，公开了一种红冬孢酵母活性干粉制备的方法。中国发明申请专利《一种诱导提高海洋红冬孢酵母对果实病害防治效力的方法》，申请号2010105517M. 8，公开了一种利用几丁质物质诱导提高红冬孢酵母生防效力的方法。罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治酵母菌株。中国发明授权专利《一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基》，专利号ZL200510090063. 1，公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方；中国发明授权专利《酵母拮抗菌C. Iaurentii的真空冷冻干燥制品及其制备方法》，专利号ZL200510090065. 0，公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法；中国发明申请专利《一种生物拮抗菌及其应用》，申请号200310115336. 4，公开了一种利用罗伦隐球酵母和杀菌剂及氯化钙等防治甜樱桃、冬枣及苹果果实病害的方法；中国发明申请专利《一种生物活性果蔬保鲜膜》， 申请号200810128441. 4，公开了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法；中国发明申请专利《葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂》，申请号200910078858. 9，公开一种利用罗伦隐球酵母和硼酸盐等防治葡萄果实病害或脱粒的方法；中国发明申请专利《一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法》，申请号 200910079774. 7，公开了一种制备罗伦隐球酵母常温保存的胶囊剂制备方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种在不使用化学杀菌剂前提下能有效控制柑橘果实采后病害的生物防腐保鲜剂。为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于三种生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鲜剂，该保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液、红冬孢酵母悬浮液和水组成，每IL保鲜剂中含有1 X 101° 1 X IO11个罗伦隐球酵母细胞、1 X 101° 1 X IO11个粘红酵母细胞、IXIOltl IXlO12个红冬孢酵母细胞1，其余为水；罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO. 3590的罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10 ；红冬孢酵母是保藏号为IMI 394084的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&TalIman ；粘红酵母参椐的生物材料为ZJU 11，分类命名为粘红酵母Iihodotorula glutinis，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2010年1月20日，保藏号CGMCCN0. 3589。本发明所选用的罗伦隐球酵母的保藏名称为罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii) ZJU 10，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年1月20日，保藏号CGMCC NO. 3590。保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所。该罗伦隐球酵母在申请号为201010152108. 4的专利中有明确告知。本发明所选用的海洋酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Felieallman)被保藏于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心(International Mycological Institute, CABI Genetic Resource Collection)，保藏地址英国 TW209TY 萨里郡艾格镇贝克汉姆路国际农业与生物中心英国中心，保藏日期2006. 4. 19，保藏编号 IMI 394084。该菌株已经在申请号为200610155209. 0的专利中被公开。本发明的生物防腐保鲜剂，是将罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii ZJU 10，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号CGMCC NO. 3590)、粘红酵母 (Rhodotorulaglutinis ZJU 11，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号CGMCC NO. ；3589)、红冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman，英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心保藏编号IMI 394084〕悬浮液复合进行处理而得；其可以进行常温或低温贮藏。本发明的生物防腐保鲜剂只有在确保酵母活性的基础上才能发挥最佳的防腐效应，因此所用的酵母悬浮液是指经过菌种活化、并配制成的具有抑菌效果且浓度适宜的酵母菌悬液。本发明的生物防腐保鲜剂有效整合了 3种生防酵母的活性，从而能显著抑制柑橘果实病害的发生和发展；由于能根据具体情况大幅度降低拮抗酵母的使用量，从而显著降低成本。本发明的生物防腐保鲜剂具有安全高效、环境友好、病害防治效果突出等优点。使用本发明的生物防腐保鲜剂，能转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对确保食品安全、环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要
眉、ο实际使用时，可任选以下任意一种处理方式对果实进行处理处理方式一选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用自来水冲洗、并在室温(25°C左右)下放干。将果实在本发明的生物防腐保鲜剂中浸泡3分钟后，取出放干，然后放入保鲜薄膜袋中在室温(25°C左右)下保持20 24小时，接着将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。处理方式二 采前采用喷壶喷洒的处理方法，将本发明的生物防腐保鲜剂溶液喷在果实表面(湿润即可)，待干后取下果实放入保鲜薄膜袋中在室温(25°C左右)下保持 20 M小时，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。
具体实施例方式以下实施例中的果实为正常商业成熟度的柑橘(Citrus unshiu Marc.)果实，试验品种为早桔。选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用质量浓度0. 次氯酸钠溶液浸泡消毒1-2分钟后，用自来水冲洗，在室温下Q0-25°C )放干后备用。拮抗酵母为罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii ZJU 10)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis ZJU 11)禾口红冬抱酵母(Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman)；病原菌为病原菌为指状青霉(Penecillium digitatum)。3种酵母悬浮液的制备方法分别如下以下所用的NYDA培养基为牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，常规高压(lkg/cm2)12rC灭菌30分钟。。所用的NYDB种子培养基为牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，常规高压(lkg/cm2) 121°C灭菌30分钟。罗伦隐球酵母、粘红酵母，红冬孢酵母分别在低温)下保存在NYDA培养基中。 培养程序均依次为①、活化先在NYDA培养基中培养48小时，然后重复传代培养2次(每次均为在NYDA培养基中培养48小时)；将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYDB种子培养基中，28°C下培养M小时；然后在相同条件下重复培养1次(即将NYDB种子培养基中培养而得的酵母再次用接种环接到NYDB种子培养基中，28°C下培养 24小时)；②、液体培养用步骤①活化所得的酵母按照5% (重量比)的接种量接到NYDB种子培养基中，在200rpmJ8°C条件下培养M小时；③、离心分离将步骤②培养后的所得物在3000rpm条件下，离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；④、悬浮和确定浓度用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。实验并以酿酒酵母作为对照，保存方法和培养方法同上。该酿酒酵母为从啤酒中一般性分离得到的普通酵母。实施例1、一种生物防腐保鲜剂先分别单独活化和培养罗伦隐球酵母、粘红酵母，红冬孢酵母；将3种酵母的浓度均调整到5 X IO8个细胞/ml，取2升体积的罗伦隐球酵母悬浮液，加入2升体积的粘红酵母悬浮液，搅拌混勻3分钟；然后加入2升体积的红冬孢酵母悬浮液，完毕后继续搅拌混勻5 分钟，加水稀释到10升备用。该最终所得的每L生物防腐保鲜剂中分别含有IX IO11个的罗伦隐球酵母、1 X IO11个的粘红酵母，1 X IO11个的红冬孢酵母细胞，其余为水。为了证明本发明的生物防腐保鲜效果，发明人进行了如下实验实验、柑橘果实生物防腐保鲜剂的效果实验用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和的深度的伤口。将不同的组合试剂50 μ 1分别添加到不同的果实伤口处。病原菌接种在以上处理2小时后在每个伤口加入等量(30 μ 1)的病原菌孢子悬浮液(Penecillium digitatum浓度为104spores/ml)。处理完毕后27 下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理每重复12个果实， 每处理重复3次。试验结果见表1。具体处理安排如下处理1:水，即空白对照。处理2 处理液所含成分浓度分别为粘红酵母细胞悬浮液浓度为lX108CellS/ml， 红冬孢酵母细胞悬浮液浓度为ι χ 108cells/ml，罗伦隐球酵母悬浮液浓度为1 X IO8Cells/ ml。即实施例1。处理3 处理液所含成分为粘红酵母细胞悬浮液浓度为3X 108CellS/ml。处理4 处理液所含成分为红冬孢酵母细胞悬浮液浓度为3X 108Cells/ml。处理5 处理液所含成分为罗伦隐球酵母悬浮液浓度为3X 108Cells/ml。处理6 处理液所含成分为普通酵母悬浮液浓度为3X 108Cells/ml。处理7 处理液所含成分分别为粘红酵母细胞悬浮液浓度为2X108CellS/ml，红冬孢酵母细胞悬浮液浓度为lX108cells/ml。处理8 处理液所含成分分别为粘红酵母细胞悬浮液浓度为2X108CellS/ml，罗伦隐球酵母细胞悬浮液浓度为IX 108cells/ml。处理9 处理液所含成分分别为红冬孢酵母悬浮液浓度为2X 108Cells/ml，粘红酵母细胞悬浮液浓度为lX108cells/ml。处理10 处理液所含成分分别为红冬孢酵母悬浮液浓度为2X 108Cells/ml，罗伦隐球酵母细胞悬浮液浓度为IX 108cells/ml。处理11 处理液所含成分分别为罗伦隐球酵母悬浮液浓度为2X108CellS/ml， 粘红酵母细胞悬浮液浓度为lX108cells/ml。处理12 处理液所含成分分别为罗伦隐球酵母悬浮液浓度为2X108CellS/ml， 红冬孢酵母细胞悬浮液浓度为IX 108cells/ml。处理13 处理液所含成分为粘红酵母细胞悬浮液浓度为1 X 109cells/mL·处理14 处理液所含成分为红冬孢酵母细胞悬浮液浓度为1 X 109cells/mL·处理15 处理液所含成分为罗伦隐球酵母悬浮液浓度为1 X 109cells/mL·处理16 处理液所含成分为普通酵母悬浮液浓度为IX 109Cells/ml。具体结果如表1所示。表1、试验结果
权利要求
1.基于三种生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鲜剂，其特征是所述保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液、红冬孢酵母悬浮液和水组成，每IL保鲜剂中含有 IXlO10 IXlO11个罗伦隐球酵母细胞、IXlOici IXlO11个粘红酵母细胞、IXlOici IXio12个红冬孢酵母细胞1，其余为水；所述罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO. 3590的罗伦隐球酵母 Cryptococcuslaurentii ZJU 10 ；所述红冬孢酵母是保藏号为IMI 394084的海洋酵母Iihodosporidium paludigenum Fell&TalIman ；所述粘红酵母参椐的生物材料为ZJU 11，分类命名为粘红酵母Iihodotorula glutinis，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2010年1月20日，保藏号CGMCC NO 3589。
全文摘要
本发明公开了一种基于三种生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鲜剂，该保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液、红冬孢酵母悬浮液和水组成，每1L保鲜剂中含有1×1010~1×1011个罗伦隐球酵母细胞、1×1010~1×1011个粘红酵母细胞、1×1010~1×1012个红冬孢酵母细胞1，其余为水；罗伦隐球酵母的保藏号为CGMCC NO.3590，红冬孢酵母的保藏号为IMI394084，粘红酵母为保藏号为CGMCC NO.3589。该生物防腐保鲜剂，能在不使用化学杀菌剂的前提下有效控制柑橘果实的采后病害。
文档编号A23B7/155GK102224842SQ201110111499
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月2日 优先权日2011年5月2日
发明者余挺, 努尔哈音, 卢黄娉, 朱瑞瑜, 路来风, 郑晓冬, 郭峻 申请人:浙江大学