专利名称：一种用于病毒噬斑纯化和克隆混合胶溶液配制的新方法
技术领域：
本发明涉及病毒噬斑纯化和克隆混合胶液的配制，采用的新方法与常规方法相比，提高了单位面积的细胞数量和单克隆纯化病毒粒子的数量，降低了实验成本，提高实验功效。
背景技术：
常规的病毒噬斑、纯化和(细胞)克隆方法是使用(2 10)X培养基与低熔点胶按相应比例混合后，覆盖于接毒后的单层细胞，但是使用(2 10)X培养基用于病毒噬斑、纯化和(细胞)克隆，需要提前将(2 10) X培养基配制好，低熔点胶提前高压灭菌后备用； 此方法程序烦琐，且培养基与胶混合后溶液的PH值、渗透压将会发生改变，影响了细胞的生长状态，进而影响病毒克隆的效果。文献检索披露的病毒克隆纯化SOP 2%胶的配制；称取2克胶，加入100 ml去离子水，0. 112MPa高压灭菌30分钟，置于4°C保存，使用前充分熔化，置于40 — 45°C水浴备用；2X培养基的配置=IOgMEM干粉培养基、45ml注射用水、胎牛血清20ml、0. 238克的 HEPES、0.06克的L-谷氨酰氨，1克的水解乳蛋白、3%碳酸氢的aiil、0. 5%中性红1.2ml 配制而成，PH值调至7. 3;使用时需将预先高压灭菌好的胶溶液与2X培养基1 :1混合，待混合胶溶液降至37°C左右覆盖细胞。本发明构思将IX培养基(培养细胞常规液体)、(2 10) X培养基分别与低熔点胶混合，在初始细胞数量相等的情况下在细胞表面覆盖低熔点胶培养细胞；和在初始细胞数量相等的情况下同时接种等量稀释的病毒后覆盖低熔点胶培养病毒，进行细胞计数和毒价测定，结果表明前者可有效提高单位面积的细胞数量和单克隆和纯化病毒粒子的数量，简单实用，达到了设计要求。
发明内容
本发明的目的在于提供的用于病毒噬斑纯化和克隆混合胶溶液配制的新方法， 替代(2 10) X培养基用于病毒噬斑、纯化和(细胞)克隆常规方法。本发明是这样实现的一种用于病毒噬斑纯化和克隆混合胶溶液配制的新方法， 包括IX细胞培养基的制备、低熔点胶的制备、混合胶溶液的制备与铺胶；
其中IX细胞培养基的制备由4-6克MEM干粉培养基，0. 02-0. 04克的L-谷氨酰氨，0. 4-0. 6克的水解乳蛋白，94-98ml注射用水和胎牛血清3_5ml混合均勻，pH值调至 7. 2-7. 3 备用；
其中低熔点胶的制备取0. 6克的低熔点胶粉，倒入三角瓶中，加入40ml去离子水，将瓶口用硫酸纸和牛皮纸扎紧，在微波炉上煮沸細in，呈半固体状时备用； 其中含1%的低熔点胶的混合胶溶液的制备与铺胶
将上步的IX细胞培养基，加温38°C，取60ml与上步制备的全量低熔点胶混合均勻， 用无菌的吸管轻轻吹打，使胶充分溶解并无气泡产生；取出预先制备好的培养成单层并接种产生细胞病变的病毒，即为原代细胞和传代细胞的细胞板；用移液器将细胞板里的培养基吸尽，然后将制备的胶溶液吸出，沿培养板壁将胶缓缓铺在细胞表面，铺完后在室温放置 IOmin使其充分凝固，然后放入37°C、5%的(X)2培养箱中培养，观察细胞病变3_5天，挑取单个病毒克隆。所述的方法，能使常规的细胞数量提高了 1. 5倍，使单克隆病毒传3代后的毒价提高了 8. 6倍(以10为底数)。本发明的新方法，使用IX培养基方法培养细胞每孔细胞数量为8. 5X105是常规方法(细胞数为5. 6X IO5 )的1. 5倍，用IX培养基方法克隆出的病毒TCID5tl的平均值为 ΙΟ7'2 ；而用2X培养基方法克隆出的病毒TCID5tl的平均值为10 6 55，前者是后者的3. 55倍； 该方法不仅提高了细胞的数量，同时提高了单克隆病毒的毒价，简化了程序，缩短时间，彰显技术进步。
具体实施例方式下面将结合实施例对发明作进一步说明。采用IX培养基与低熔点胶混合进行病毒的克隆和纯化； 其中细胞的制备(以Marc-145细胞为例)
将生长致密的Marc-145单层细胞用D Hanks洗2次，加入浓度为0. 25%的EDTA 胰酶消化细胞，消化完毕后，加入适量的培养基用吸管轻轻吹打，使细胞分散成单个细胞； 取其中ΙΟΟμΙ，加900μ1的Hanks液，混勻后滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法，于低倍镜下计数四角的4个大方格内的细胞；计数完毕后将细胞稀释到2. OX 104/ml，铺入6孔细胞培养板内，使每孔细胞数均为4. OX IO4个，然后置于37°C、5%的(X)2培养箱中培养，培养 M小时后备用；
其中病毒的接种，不同方法低熔点胶的配制使用[以猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)活疫苗为例]
抽取IOOPIPRRSV活疫苗，用细胞培养基作10倍的梯度稀释，取10 6 10 7的滴度样， 分别加入上述的致密单层中，每孔500μ1，同时设对照每孔加细胞培养基，放入37°C、5%的 CO2培养箱中静置1小时；
IX培养基与低熔点胶混合
1小时后弃取细胞培养基，首先将ι χ培养基预热达到38°c后，称取0. 4克低熔点胶粉，将胶粉倒入三角瓶中，加入40ml去离子水，用硫酸纸和牛皮纸将三角瓶口扎紧，在微波炉上用高温档煮沸細in后，此时胶是无菌的呈半固体状(水已蒸发完毕)，取预热的IX培养基60ml与上步制备的全量低熔点胶混合均勻，用无菌的吸管轻轻吹打，使胶充分溶解同时避免气泡的产生；然后用移液器把细胞板里的液体吸尽，用吸管将将胶溶液快速吸取，沿培养板壁将胶缓缓铺在细胞表面，铺完后在室温放置IOmin使其充分凝固，然后放入37°C、 5%的(X)2培养箱中培养，每日观察细胞状态和病毒病变情况，观察细胞病变5天，挑取单个病毒克隆，将挑取的单克隆病毒冻融3次接种Marc-145单层细胞，传3代分别测TCID50 ； 2X培养基与低熔点胶混合
接毒方法同上；洲胶的配制称取2克胶粉，加入100 ml去离子水，0. 112MPa高压灭菌30分钟，置于4°C保存，使用前充分熔化，置于45°C水浴备用；2X培养基的配置IOgMEM 干粉培养基、45ml注射用水、胎牛血清20ml、0. 238克的HEPES、0. 06克的L 谷氨酰氨，1 克的水解乳蛋白、3%碳酸氢的aiil、0. 5%中性红1. 2ml配制而成，pH值调至7. 3，使用时将预先高压灭菌好的低熔点胶溶液与2X培养基体积比1 :1混合。本方法所用细胞培养液由5gMEM干粉培养基，90ml注射用水，胎牛血清IOml配制而成，PH值调至7. 3。本方法所用细胞培养基由5gMEM干粉培养基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成，PH值调至7. 3。本方法所用IX培养基由5gMEM干粉培养基，0.03克的L 谷氨酰氨，0.5克的水解乳蛋白，96ml注射用水，胎牛血清配制而成，pH值调至7. 3。实验选用的Marc-145细胞购自中国兽医药品监察所；MEM培养基为Hyclone公司生产，货号:SH30024. OlB ；胎牛血清为Hyclone公司生产，货号:SV30087. 02 ；EDTA 胰酶消化液为兰州百灵公司生产；低熔点胶粉为irwitrogen公司生产，货号Cat. no.16520-050。实验选用的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HPRRSV)活疫苗是新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产的产品，农业部核发的产品生产批准文号为农医药便函[2010] 号。上述的实验结果分析，见表1、2、3。
权利要求
1.一种用于病毒噬斑纯化和克隆混合胶溶液配制的新方法，其特征在于包括IX细胞培养基的制备、低熔点胶的制备、混合胶溶液的制备与铺胶；其中IX细胞培养基的制备由4-6克MEM干粉培养基，0. 02-0. 04克的L-谷氨酰氨，0. 4-0. 6克的水解乳蛋白，94-98ml注射用水和胎牛血清3_5ml混合均勻，pH值调至 7. 2-7. 3 备用；其中低熔点胶的制备取0. 6克的低熔点胶粉，倒入三角瓶中，加入40ml去离子水，将瓶口用硫酸纸和牛皮纸扎紧，在微波炉上煮沸細in，呈半固体状时备用；其中含1%的低熔点胶的混合胶溶液的制备与铺胶将上步的IX细胞培养基，加温38°C，取60ml与上步制备的全量低熔点胶混合均勻， 用无菌的吸管轻轻吹打，使胶充分溶解并无气泡产生；取出预先制备好的培养成单层并接种产生细胞病变的病毒，即为原代细胞和传代细胞的细胞板；用移液器将细胞板里的培养基吸尽，然后将制备的胶溶液吸出，沿培养板壁将胶缓缓铺在细胞表面，铺完后在室温放置 IOmin使其充分凝固，然后放入37°C、5%的(X)2培养箱中培养，观察细胞病变3_5天，挑取单个病毒克隆。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于该方法使常规的细胞数量提高了1. 5倍， 使单克隆病毒传3代后的毒价提高了 8. 6倍。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于MEM干粉培养基为Hyclone公司生产， 货号SH30024. OlB ；胎牛血清为Hyclone公司生产，货号SV30087. 02 ；低熔点胶粉为 invitrogen 公司生产，货号:Cat. no. 16520-050。
全文摘要
本发明提供的一种用于病毒噬斑纯化和克隆混合胶溶液配制的新方法，其中1×细胞培养基的制备由4-6克MEM干粉培养基，0.02-0.04克的L-谷氨酰氨，0.4-0.6克的水解乳蛋白，94-98ml注射用水和胎牛血清3-5ml混合均匀，pH值调至7.2-7.3备用；其中低熔点胶的制备取0.6克的低熔点胶粉，倒入三角瓶中，加入40ml去离子水，将瓶口用硫酸纸和牛皮纸扎紧，在微波炉上煮沸4min，呈半固体状时备用；其中含1%的低熔点胶的混合胶溶液的制备与铺胶；用移液器将细胞板里的培养基吸尽，然后将制备的胶溶液吸出，沿培养板壁将胶缓缓铺在细胞表面，铺完后在室温放置10min使其充分凝固，然后放入37℃、5%的CO2培养箱中培养，观察细胞病变3-5天，挑取单个病毒克隆。该方法使常规的细胞数量提高了1.5倍，使单克隆病毒传3代后的毒价提高了8.6倍。
文档编号C12N7/02GK102206614SQ201110114800
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月5日 优先权日2011年5月5日
发明者李俊辉, 李延涛, 杜久斌, 贺笋 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司