专利名称：一种检测RNA病毒hMPV的方法、试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测RNA病毒hMPV的方法及试剂盒，具体讲涉及一种利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法及试剂盒。
背景技术：
RT-LAMP技术是在实验过程中使核酸链通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，而达到检测的目的。由于反应中使用了三对特异性引物，只有在三对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进行，因此这种检测方法的特异性很高。其中一对特殊的引物的5’端含有一端与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就可形成一个类似哑铃状回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，从而保证了扩增的持续进行，最终，扩增产物在核酸电泳胶上形成连续 的梯状条带。从RT-LAMP的原理和特点不难看出，该方法在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检测时间可以缩短到两小时以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在65°C等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会。第三，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第四，RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁沉淀，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。人偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)是2001年首次由荷兰科学家发现的一种新型呼吸道病原。该病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属成员，是一种单股负链RNA病毒,基因全长约13. 4kb。到目前为止，hMPV已经在北美洲,南美洲，欧洲,亚洲,非洲和大洋洲全球许多国家和地区的急性呼吸道感染患者中检出。血清学研究发现，在荷兰几乎所有儿童都曾经感染过hMPV或是处在该病毒的威胁之下，该病毒在人群当中的传播至少已有50年之久。hMPV可导致各年龄段急性呼吸道感染，临床表现与人呼吸道合胞病毒所致疾病相似，由于流行季节与RSV相似，故经常与RSV合并感染，造成急性呼吸道疾病。重症患者多为婴幼儿、老年人及心肺疾病者。2003年我国学者在北京地区婴幼儿呼吸道感染患者中的存在。但我国相关hMPV的报道尚不多见，主要原因是缺乏针对该病毒灵敏、特异、快速、有效的检测手段。为了更加深入了解该病毒感染的流行病学特点，发病机理及临床表现等情况，需要建立针对该病毒快速灵敏有效的实验室诊断方法。目前hMPV的检测方法有病毒分离、RT-PCR、巢式PCR、Real-time PCR、酶联免疫、单抗与免疫荧光结合等。但是常用的核酸和抗体检测的缺点是检测试剂和仪器成本要求较高，病毒分离时间长或者不能分离，这远远不能满足实际工作中高通量高效率的要求，对于病毒病的预防控制受到一定限制。因此，利用LAMP方法检测特异性强，所用时间短，所需成本低，结果又可视性的特点，开发针对hMPV的LAMP检测方法，对于进行大规模流行病学研究和基层的现场检测是非常有意义的。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一种利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法。本发明的第二发明目的在于提出一种检测RNA病毒hMPV的试剂盒。本发明的第三发明目的在于提出该检测RNA病毒hMPV的试剂盒的用途。为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为
本发明提出了一种利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，包括以下步骤根据人偏肺病毒的N基因的相对保守区，分别设计了六条引物，包括两条外引物F3、B3和两条内引物FIP、BIP，两条环结合弓丨物LF、LB ;处理待测标本，提取样本的RNA后，进行RT-LAMP反应；然后通过电泳检测或肉眼观察，最终得到实验结果；其中，所述的引物的核苷酸序列为外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，或由SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；内引物FIP(Flc+F2)的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；内引物BIP(Blc+B2)的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，或由SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，或由SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，或由SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。其中，SEQID NO 1 所示的核苷酸序列为5’ ACAGGAGTCTATTCATTGAGT-3’ ；SEQ ID NO 2 所示的核苷酸序列为5’ ACCAAATCATAAACCTCTGTG-3’ ；SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列为5， CGGCTCCATAAGCTTGCATAAATAT-GGGAAAGCTTTAGGCTCA-3，，SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列为5’ -ACAATGCTAAGGTGGGGTGTCCTTCAATTCAGCTTGCACAG-3’ ；SEQ ID NO 5 所示的核苷酸序列为5’ -CAAACAAACTTTCTGCTTTGCTTCC-3’ ；SEQ ID NO 6 所示的核苷酸序列为5’ -CATCTAACAACATAATGCTAGGGCA-3’。本发明的第一优选技术方案为所述RT-LAMP的反应体系Bst DNA 聚合酶缓冲液(10 X)，2. 5 μ I ;
BstDNA 聚合酶(8u/ μ I)，I μ I ;AMV 反转录酶(lOu/ μ I)，I μ I ;dNTP(IOmM)，2· 5μ I ;Betaine (25mM), I μ I ；MgCl2 (150mM), I μ I ；W_F3、B3(5yM)Hul;内引物FIP、BIP(10yM)，各 1μ I ;环引物LF、LB(20yM)，各1μ I ;
DNA, I μ I ；ddH20，9yl;总体积25 μ I。本发明的第二优选技术方案为，所述RT-LAMP的反应条件为60 68°C恒温反应I 2h，优选65°C恒温I. 5h ;然后75 85°C灭活3 lOmin，优选80°C灭活5min。本发明的第三优选技术方案为所述提取样本RNA的方法为以hMPV阳性RNA核酸为模板，使用两步法反转录试剂盒先进行第一步反转录以获取cDNA ;以cDNA为模板并RT-PCR引物进行PCR反应，扩增条件为95°C预变性5min，95°C变性30s，52 °C退火30s，72°C延伸358，35个循环，721延伸10min，4°C保存；其中，RT-PCR引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示，或由SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；RT-PCR引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示，或由SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。其中SEQID NO 7 所示的核苷酸序列为5’ -CCCTTTGTTTCAGGCCAA-3’ ；SEQ ID NO 8 所示的核苷酸序列为5’ -GCAGCTTCAACAGTAGCTG-3’。本发明的第四优选技术方案为采用电泳法进行检测，电泳采用1%琼脂糖凝胶电泳，阳性结果在416bp处产生条带。本发明的第五优选技术方案为采用肉眼检测，浑浊有白色沉淀的为阳性，清亮透明的为阴性。本发明的第六优选技术方案为采用肉眼检测，在RT-LAMP的反应体系加入羟基萘酚兰，阳性反应为蓝色，阴性反应为紫色；羟基萘酚兰(HNB)的剂量优选为(3mM) I μ I。本发明还涉及一种检测检测RNA病毒hMPV的试剂盒，所述的试剂盒中包括病毒RNA提取试剂盒和RT-LAMP的反应体系。本发明还涉及该试剂盒在流行病学监测、大规模筛查中的应用。下面对本发明的内容进行进一步的解释和说明本发明是环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)用于hMPV病毒N基因的检测。用于各种生物制品，病人呼吸道标本等中的hMPV病毒的监测，其应用范围包括人用、兽用及其它生物防御用。本发明是对目前RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。第三，所有的扩增过程都可在65°C同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。本发明通过AlignX和在线软件PrimerExplorer,选择人偏肺病毒的N基因的相对保守区，对保守区分别设计了六条引物，其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(LF、LB)。所有引物的具体序列见表I。表I :LAMP检测hMPV的引物序列
权利要求
1.一种利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤根据人偏肺病毒的N基因的相对保守区，分别设计了六条引物，包括两条外引物F3、B3和两条内引物FIP、BIP，两条环结合引物LF、LB ;处理待测标本，提取样本的RNA后，进行RT-LAMP反应；然后通过电泳检测或肉眼观察，最终得到检测结果； 其中，所述的引物的核苷酸序列为 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，或由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；， 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列 内引物FIP(Flc+F2)的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列 内引物BIP(Blc+B2)的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，或由SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列 环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，或由SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列 环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示,或由SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反应体系为 Bst DNA 聚合酶缓冲液(10 X)，2. 5 ill ;BstDNA 聚合酶(8u/ u I), I U I ； AMV 反转录酶(10u/iil)，liil ； dNTP(lOmM) ,2. 5u I ；Betaine(25mM), Iu I ； MgCl2 (150mM), I U I ； 外引物卩3、83(511] )，各 Iu I ；内引物 FIP、BIP (IOiiM)，各 Iu I ； 环引物1^、1^(2011] )，各 Iu I ；DNA, IuI ；ddH20,9u I ； 总体积25 u Io
3.根据权利要求I所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反应条件为60 68°C恒温反应I 2h，优选65°C恒温I. 5h ;然后75 85°C灭活3 IOmin,优选80°C灭活5min。
4.根据权利要求I所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述提取样本RNA的方法为以hMPV阳性RNA核酸为模板，使用两步法反转录试剂盒先进行第一步反转录以获取cDNA ；以cDNA为模板并RT-PCR引物进行PCR反应，扩增条件为95°C预变性5min，95°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸35s，35个循环，72°C延伸10min，4°C保存；其中，RT-PCR引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示，或由SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； RT-PCR引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示，或由SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。
5.根据权利要求I所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述的电泳采用1%琼脂糖凝胶电泳，阳性结果在416bp处产生条带。
6.根据权利要求I所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，采用肉眼检测，浑浊有白色沉淀的为阳性，清亮透明的为阴性。
7.根据权利要求I所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，采用肉眼检测，在RT-LAMP的反应体系加入羟基萘酚兰，阳性反应呈蓝色，阴性反应呈紫色。
8.一种检测检测RNA病毒hMPV的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括病毒RNA提取试剂盒、RT-LAMP的反应体系、定量参考品、阴性质控品、阳性质控品。
9.根据权利要求8中所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中的定量参考品为阴性质控品为纯水，阳性质控品为浑已经测序确认的包含hMPVN基因的质粒。
10.权利要求8所述的检测RNA病毒hMPV的试剂盒在流行病学监测、大规模筛查中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种检测RNA病毒hMPV的方法及试剂盒，具体讲涉及一种利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法及试剂盒。该检测方法为根据人偏肺病毒的N基因的相对保守区，分别设计了六条引物，包括两条外引物F3、B3和两条内引物FIP、BIP，两条环结合引物LF、LB；处理待测标本，提取样本的RNA后，进行RT-LAMP反应；然后通过电泳检测或肉眼观察，最终得到结果。本发明建立了hMPVN基因的RT-LAMP检测方法，灵敏度可以达到10个拷贝，灵敏度远高于传统PCR方法，并且该方法还具有良好的特异性，不与RSV，HBoV和H1N1的核酸发生交叉反应。
文档编号C12Q1/68GK102827946SQ201110115340
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者郑丽舒, 王翔, 侯云德 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京金迪克生物技术研究所