专利名称：：检测乙型肝炎病毒的pcr引物组，使用该引物组检测乙型肝炎的方法以及包含该引物组的...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种选自具有SEQIDNO1-40所示核苷酸序列的引物的引物组，一种使用该引物组实施PCR的检测乙肝病毒的方法，和包含该引物组的乙肝病毒试剂盒。
背景技术：
：乙肝是一种世界范围内普遍流行的代表性的病毒传染性疾病。其是一种普通的传染性疾病，被列为第九种致死性原因。全球有超过3亿的慢性乙肝病毒携带者。因此，每年慢性肝炎，肝硬化，肝癌等会夺去成百万的生命。在我国，据了解乙肝病毒携带者约占全人口5-10％。乙肝病毒(HBV)是一种由病毒蛋白所组成的蛋白，该病毒蛋白包括三种抗原蛋白，HBsAg，HBcAg，和HBeAg。HBVDNA被一种称为核心抗原(HBcAg)的蛋白结构所保护，核心由被认为是表面抗原或S抗原(HBsAg)的包膜蛋白所包被。乙肝的检测方法，广泛采用地是肝脏功能的检测，定量T蛋白，白蛋白，T胆红素，sGOT，sGPT，r-GPT，或碱性磷酸酶(ALP)，应用酶联免疫检测的HBsAg和HBeAg的血清学检测等。尽管这些方法在检测晚期乙肝方面是有效的，然而却有诸如早期诊断困难，可靠性低等困难。因此，最近广泛使用杂交捕捉(capature)试验，分支DNA试验和基于聚合酶链式反应(PCR)的遗传实验。具体地，由于基于PCR的遗传实验具有高灵敏度，快速的特点，并且针对乙肝的药物学作用可通过观察HBV的增生程度而知晓，因而，优选的是基于PCR的遗传实验。PCR是如下一种技术，其中在引物组与靶核酸序列互补链结合时，在两引物结合位点间的基因在很短的时间内被扩增至超过数百万个拷贝。PCR在相关的
技术领域：
中是所熟知的。在PCR中，互补于靶核酸序列的相应链的两核酸引物在杂交条件下与靶核酸序列退火，接着，正常情况下热稳定DNA聚合酶在杂交的引物末端起始延伸以得到DNA双链。重复上述程序以增加靶核酸序列。在核酸引物不与靶核酸序列杂交时，不能得到PCR扩增产物。该种情况下，PCR引物可作为杂交探针。由此扩增的PCR产物可通过使用标记引物在扩增链中观察标记的核苷酸而得以检测。标记的引物可以是用放射性物质，荧光染料，地高辛，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，acridiumester，生物素，刀豆脲酶标记的引物，但并不限于此。凝胶电泳后通过染色观察就可检测使用非标记引物获得的PCR产物。然而，就基于这些PCR技术的乙肝诊断而言，由于需要2-3小时的较长时间进行基因的扩增，可能会产生假阳性或假阴性的结果，由于存在不同的基因型很难进行精确诊断。因此，为了增加乙肝诊断的精确性，建议使用PCR和杂交的检测方法。不过，这些检测方法也需要过长的检测时间和较高的成本。
发明内容本发明提供一种快速精确检测乙肝病毒的引物组，通过使用该引物组的PCR检测乙肝的方法，和包括该引物组的乙肝病毒检测试剂盒。本发明的一方面提供一种选自如下各组的PCR引物组(a)包括具有SEQIDNO1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO2所示核苷酸序列的引物的引物组；(b)包括具有SEQIDNO1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO3所示核苷酸序列的引物的引物组；(c)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO5所示核苷酸序列的引物的引物组；(d)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO6所示核苷酸序列的引物的引物组；(e)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO7所示核苷酸序列的引物的引物组；(f)包括具有SEQIDNO8所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO7所示核苷酸序列的引物的引物组；(g)包括具有SEQIDNO9所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO10所示核苷酸序列的引物的引物组；(h)包括具有SEQIDNO11所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO12所示核苷酸序列的引物的引物组；(i)包括具有SEQIDNO13所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO14所示核苷酸序列的引物的引物组；(j)包括具有SEQIDNO15所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO16所示核苷酸序列的引物的引物组；(k)包括具有SEQIDNO17所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO18所示核苷酸序列的引物的引物组；(l)包括具有SEQIDNO19所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO20所示核苷酸序列的引物的引物组；(m)包括具有SEQIDNO21所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO22所示核苷酸序列的引物的引物组；(n)包括具有SEQIDNO23所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO24所示核苷酸序列的引物的引物组；(o)包括具有SEQIDNO25所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO26所示核苷酸序列的引物的引物组；(p)包括具有SEQIDNO27所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO28所示核苷酸序列的引物的引物组；(q)包括具有SEQIDNO29所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO30所示核苷酸序列的引物的引物组；(r)包括具有SEQIDNO31所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO32所示核苷酸序列的引物的引物组；(s)包括具有SEQIDNO33所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO34所示核苷酸序列的引物的引物组；(t)包括具有SEQIDNO35所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO36所示核苷酸序列的引物的引物组；(u)包括具有SEQIDNO37所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO38所示核苷酸序列的引物的引物组；或(v)包括具有SEQIDNO39所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO40所示核苷酸序列的引物的引物组；本发明另一方面提供一种检测乙肝病毒的方法，包括通过使用引物组的PCR扩增自生物体获得的核酸样品。本发明另一方面提供一种包括该引物组的乙肝病毒检测试剂盒。附图简述本发明上述的和其它的特征及优点通过下面例证性实施方案和所附附图的详细描述得以更明显显示。图1图示的是乙肝病毒(HBV)基因组序列，包括用于本发明PCR引物组的靶核苷酸序列，和与本发明SEQIDNO1-8引物结合的HBV基因组序列的位置。图2图示的是HBV基因型A-F的分支图(branchdiagram)和各基因型90％或更高同源性的区域，所述区域选作用以设计本发明PCR引物组的引物。图3图示的是下面40个PCR循环后的本发明各引物浓度的相互作用曲线图数据平均值(InteractionPlot-DataMeansforConcentration)95℃，20秒；58℃，30秒；72℃，40秒；使用MJResearchPTC-100仪器。图4A和图4B分别是在两步法PCR分析中，使用本发明的引物的PCR产物浓度相对于退火温度和PCR产物浓度相对延伸温度的图；图4C是使用本发明的引物在典型的三步法PCR分析和两步法PCR分析中PCR产物浓度相对于退火温度的图。图5图示的是本发明所用微芯片的顶视图和截面图(图5A)以及底视图(图5B)。图6对在使用本发明引物的微芯片上实施两步PCR后的PCR产物进行2％TAE琼脂糖凝胶电泳的结果。图7A为比较图，说明对于本发明和常规技术中几乎相同的DNA浓度所需的PCR时间，图7B仅是描述图7A浓度值的放大图。图8为使用本发明的和常规技术的肝炎检测试剂盒电泳后基于分子量标记的100个韩国人的检测结果。具体实施例方式本发明提供一种选自如下各组的PCR引物组(a)包括具有SEQIDNO1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO2所示核苷酸序列的引物的引物组；(b)包括具有SEQIDNO1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO3所示核苷酸序列的引物的引物组；(c)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO5所示核苷酸序列的引物的引物组；(d)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO6所示核苷酸序列的引物的引物组；(e)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO7所示核苷酸序列的引物的引物组；(f)包括具有SEQIDNO8所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO7所示核苷酸序列的引物的引物组；(g)包括具有SEQIDNO9所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO10所示核苷酸序列的引物的引物组；(h)包括具有SEQIDNO11所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO12所示核苷酸序列的引物的引物组；(i)包括具有SEQIDNO13所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO14所示核苷酸序列的引物的引物组；(j)包括具有SEQIDNO15所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO16所示核苷酸序列的引物的引物组；(k)包括具有SEQIDNO17所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO18所示核苷酸序列的引物的引物组；(l)包括具有SEQIDNO19所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO20所示核苷酸序列的引物的引物组；(m)包括具有SEQIDNO21所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO22所示核苷酸序列的引物的引物组；(n)包括具有SEQIDNO23所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO24所示核苷酸序列的引物的引物组；(o)包括具有SEQIDNO25所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO26所示核苷酸序列的引物的引物组；(p)包括具有SEQIDNO27所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO28所示核苷酸序列的引物的引物组；(q)包括具有SEQIDNO29所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO30所示核苷酸序列的引物的引物组；(r)包括具有SEQIDNO31所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO32所示核苷酸序列的引物的引物组；(s)包括具有SEQIDNO33所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO34所示核苷酸序列的引物的引物组；(t)包括具有SEQIDNO35所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO36所示核苷酸序列的引物的引物组；(u)包括具有SEQIDNO37所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO38所示核苷酸序列的引物的引物组；或(v)包括具有SEQIDNO39所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO40所示核苷酸序列的引物的引物组；本发明另一方面还提供一种检测乙肝病毒的方法，包括通过使用引物组的PCR扩增自生物体获得的核酸样品。PCR可以是两步法PCR，其包括变性步骤和退火及延伸步骤，可以实施30分钟或更短时间。可以使用0.2-1μM的各引物和0.01pg-1μg的模板DNA在微PCR芯片上实施PCR。PCR可以在86-97℃变性1-30秒，退火和延伸于60-70℃进行6-30秒。微PCR芯片可以包括硅片(siliconwafer)，其表面通过硅蚀刻术(lithography)制成的PCR室形成，而其它表面由用于加热PCR室的加热器构成；具有进口和出口的玻璃片。本发明还提供一种包括该引物组的乙肝病毒检测试剂盒。为了有利于理解本发明，一些术语如下定义。术语“核酸”指的是其中在一核苷酸中的戊糖3’-末端通过磷酸二酯键连接在相邻戊糖的5’-末端的分子，并且核苷酸残基以特定的序列存在，即线性序列。术语“靶核酸”或“核酸靶”指的是特异的目的核酸序列。因此，“靶”可以存在另一核酸分子或大的核酸分子中。在本文中，优选的是，术语“靶”指的是在乙肝病毒(HBV)基因中的两个或多个核苷酸序列。术语“核酸引物”指的是本发明方法中所用的寡核苷酸或多核苷酸。寡核苷酸可以用作PCR的扩增引物。然而，在本文中，扩增引物简称为“引物”。本文中，寡核苷酸或多核苷酸可以包括修饰的键，诸如硫代磷酸键(phosphorothioatebond)。用于本发明PCR引物组的靶DNA是这样一种遗传片段，其在HBV核心中包含很少的遗传变异。因此，诊断的精确性非常好，诊断各种基因型诸如基因型A，B，C，D，E和F是可能的。此外，诊断的精确性和重复性在需30分钟或更少时间的快速PCR仪器同一般需要2-3小时的PCR仪器一样非常好。图1图示了包括用于本发明PCR引物组的靶核苷酸序列的HBV基因组序列和与本发明SEQIDNO1-8的引物结合的HBV基因组序列的位置。尽管未显示，SEQIDNO9-12和23-26的引物附着于HBV基因的表面基因区，并且SEQIDNO13-22和27-36的引物附着于HBV基因的X基因区。图2图示了HBV的基因型A-F的分支图，其可以用本发明的PCR引物组检测。这种基因型的分支图表示相互之间具有高度同源性的基因组群，和各基因组群的基因组，所述的各基因组群通常具有特定基因区，而该特定基因区不存在于其它基因组群。本发明通过下面实施例进行更具体地描述。然而，下面所提供的实施例只是为了说明的需要，本发明并不限于此。实施例1引物的制备需要设计引物以使它们扩增包含各种突变体序列的HBV基因，将HBV基因与其它病毒基因区别开来。为此，本发明人(1)研究并分析了HBV基因组的特征，(2)筛选了HBV基因组的区域作为引物的候选区域，该区域在遗传上高度保守并具有很少的环境因子等所致的变异，(3)基于HBV基因组筛选区域设计引物。1.1HBV基因组的特征参见图1，HBV基因组大小为3.2kb，包含4个基因，S，C，P和X。由S基因编码的HBsAg具有用于确定血清学亚型的血清抗原位点。即HBsAg携带针对单克隆抗体可产生免疫反应的共同的决定簇“a”(氨基酸残基124-127)和亚型特异性决定簇，“dw，dr，yw和yr”(氨基酸122(d＝赖氨酸，y＝精氨酸)和氨基酸160(w＝赖氨酸，r＝精氨酸)。HBsAg所有亚型的共同决定簇“a”是抗HBs免疫反应的主要区域，且以各种突变体的形式存在于HBV中。在HBV基因型的分类中，比较了全病毒基因组(对于基因型A-D为8％，对于基因型F为14％)。利用S基因的核苷酸序列作为分类为新基因型的标准(MagniusLO等，Intervirology，1995；38(1-2)24-34)。由C基因编码的HBeAg和HBcAg具有临床上重要的遗传多态性。HBeAg是为宿主细胞免疫系统所识别的HBV的重要蛋白标记，并且具有遗传多态性以避免宿主细胞介导的免疫反应。具体地，导致preCore成熟前终止的preCore突变体(称为“翻译终止密码突变体”)是所熟知的(LiJS等，JVirol，1993Sep；67(9)5402-10和OkamotoH.等，1990年3月；64(3)1298-303)。P基因编码的HBV聚合酶具有反转录的活性，反转录活性为核苷类似物拉米夫定(lamivudine)所抑制，拉米夫定也可用于治疗HIV感染。已知长期的药物使用会诱导与反转录活性相关的YMDD基序的选择性突变(TipplesGA.等，Hepatology，1996，Sep；24(3)714-7)。如上所述，研究该已知HBV基因组的突变和基因型，将高度保守的基因区筛选为引物的候选区。1.2引物候选区的筛选在GenBank和专利文献中检索当前已知的HBV基因型A-F的基因群。分析这些基因群的核苷酸序列的同源性和突变位点，对于各基因型而言具有90％或更高同源性的区域筛选为引物的候选区。图2说明了基因型A-F的分支图，和筛选对于各基因型而言具有90％或更高同源性的区域为引物候选区，用以设计本发明PCR引物组。1.3设计引物i)快速PCR所需的引物必须满足各种要求以设计快速PCR的引物。PCR是基于温度的有效变化来最大化酶的活性。即，温度和酶活性是PCR的主要因素。在常规PCR中，三步法，即通过温度变化来变性，退火，和延伸。本发明中，为最小化聚合酶聚合作用所需的时间，同时实施常规退火和延伸步骤。此外，为维持较高的聚合作用产量，而使用具有高解链温度(Tm)的引物。因此，设计本发明的引物使得PCR产物具有至少100-200bp的差异。此外，设计本发明的引物以满足下面的需要仅特定区域扩增，生成充足的PCR产物以使PCR产物可用于下面分析步骤中，PCR期间引物间没有干扰，高Tm，没有发夹结构，没有引物的自身二聚物(self-dimer)或引物对二聚物(pair-dimer)，每个碱基不多于4个连续的重复，没有微卫星，没有重复序列。通过HYBsimulatorTM设计引物(AdvancedGeneComputingTechnologies，Inc.)。ii)引物的筛选利用ClustalX软件基于90％同源性的引物候选区分析所设计引物的具体序列。与候选区具有100％同源性的引物(例如引物13)被选为所需引物。另一方面，测序后，与候选区不具有100％同源性但用于重要扩增位点的引物(例如引物14)测序后被设计包含简并碱基而不是核苷酸错配位点的碱基。表1简并碱基序列和所设计的引物的特征在下面表2中概括。表2序列和引物特征F正向引物，R反向引物实施例2PCR试验为最小化PCR试验间的差异，除了DNA样品外，首先将其它的试剂混合以制备两倍浓缩的主(master)混合物。然后，将主混合物与DNA样品混合(体积比1∶1)以获得PCR混合物。主混合物组合物如下5×PCR缓冲液1.0μl蒸馏水1.04μl10mMdNTPs0.1μl20μM各引物混合物0.2μl酶混合物0.16μl2.1在常规的PCR试管中的PCR将先前制备的PCR混合物加样于MJRsearchPTC-100仪器上，PCR循环为，95℃，20秒；58℃，30秒；72℃，40秒，然后重复40次。为了筛选最佳的引物，根据引物的类型(引物1-5)，试验温度(50℃，53℃，56℃，59℃)，和Mgcl2的浓度(2.5mM和3.5mM)实施PCR。这些试验参数间的相关性显示于图3中。图3显示各引物浓度的相互作用曲线图数据平均值。根据这些实验结果，与用作对照的引物5(用红线表示)相比，其它引物间性能的差异不显著。2.2快速PCR试验在退火和延伸温度分析上述PCR混合物的性能，实施获得最佳PCR时间的两步温度法试验。实验结果显示在图4A和4B中。如图4A和4B所示，本发明的引物甚至在高退火温度由于高的Tm而显示高的扩增效率。结果显示退火温度在延伸温度范围内。基于上述的结果，实施三步法PCR(95℃，20秒；58℃，30秒和72℃，40秒)和两步法PCR(95℃，20秒和68℃，30秒)的比较试验以得到PCR所需最佳时间。结果显示于图4C中。如图4C中所示，两步法PCR显示与三步法PCR相同的PCR产物浓度模式。图4A为PCR产物的浓度相对于退火温度的示图，图4B为PCR产物相对于延伸温度的示图。2.3病毒间的交叉反应分析本发明的引物是否与其它病毒反应。首先，使用Blast检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行已知核苷酸序列间的比较分析。根据本发明比较分析结果，本发明的引物仅与HBV显示100％同源性。当使用下面的5种病毒和人gDNA进行PCR，没有观察到交叉反应。对于交叉反应的试验结果概括于下面的表3中。表3交叉反应的实验结果项目HIVCMVHPVHSV-1HSV-2人gDNA实验次数(n＝9)------序列匹配NSNSNSNSNSNSHIV人免疫缺陷型病毒；CMV人巨细胞病毒；HPV人乳头瘤病毒；HSV-11型人单纯疱疹病毒；HSV-22型人单纯疱疹病毒；NS无显著同源性2.4检出限分析使用国际标准的HBVDNA分析本发明PCR检出限，结果概括于下面的表4中。利用QiagenMinElute试剂盒提取血清中国际标准的HBVDNA样品并纯化。为了实施PCR，制备两倍浓缩的主混合物，然后与DNA样品混合(体积比1∶1)以得到PCR混合物。主混合物组合物如下5×PCR缓冲液1.0μl蒸馏水1.04μl10mMdNTPs0.1μl20μM各引物混合物0.2μl酶混合物0.16μl在如下所述的条件下实施PCR91℃，1秒和63℃，15秒。表42.5在微芯片上的PCR为了根据热转移率和不同温度间温度梯度研究本发明的引物对于PCR的效果，在微PCR芯片而不是常规PCR管上实施PCR。所用的微PCR芯片由硅制成，具有以下优点，由于比常规的PCR管快几百倍的热传导率而能在反应物中快速热转移，快速的温度升高速率，以及由于使用痕量的DNA样品而最大化热转移。图5图示了实施例中所用微芯片的顶视图和截面视图(图5A)和底视图(图5B)。参见图5A和5B，本发明方法中所用微芯片包括硅片1和玻璃片2。在硅片1表面形成由硅蚀刻制备的PCR微室3，在硅片1其它表面形成用于加热微室3的微热器(micro-heater)4。微热器4受微型温度传感器7控制以精确调控PCR。硅片1为具有样品入口5和样品出口6的玻璃片2覆盖。样品经入口5进入在硅片1形成的微室3，通过微热器4加热以实施PCR。在实施PCR之后，样品经样品出口6释放出来。为了在微PCR芯片上实施PCR，制备与常规PCR管中相同的PCR混合物。此处，使用表2中GS04引物组，该引物组产生较小的PCR产物并具有高的Tm。将1μlPCR混合物上样于微PCR芯片上，PCR循环为91℃，1秒；63℃，15秒，然后重复40次。使用Labchip(Agilent)定量试验所得物，并在2％TAE琼脂糖凝胶上鉴定扩增物。图6显示扩增后在2％TAE琼脂糖凝胶上的电泳结果。此处，106和104表示HBV模板的拷贝数，NTC(无模板对照)是PCR的阴性对照，SD(标准)是电泳的阳性对照。图7A和7B是在本发明微PCR芯片和常规PCR仪器中就PCR所需时间说明PCR产物浓度的比较图。参考图7A和7B，与使用常规PCR仪器获得40.88ng/μlPCR引物需要90分钟相比，在本发明微PCR芯片上获得40.54ng/μlPCR引物所需时间仅为28分钟。也就是说，使用本发明PCR技术获得预先确定浓度PCR产物所需时间仅约为使用常规PCR仪器获得几乎相同浓度的PCR产物所需时间的三分之一。2.6快速性和精确性评价使用本发明PCR技术和常规PCR试剂盒(比较实施例1Chiron(ProclleixUltrioTM)和比较实施例2Roche(AMLINATMPX))的快速性和精确性，结果显示于表5中。表5项目发明比较实施例1比较实施例2应用筛选检测血筛选血筛选LOD值18.4IU/mL(95％检出限)6.2IU/mL30个拷贝/ml扩增时间28.3分钟～1小时～2小时扩增靶基因rRNA基因(扩增和杂交)LOD检出限IU(国际单位)＝3-7个拷贝2.7重复性相对于天数和技术人员评价本发明PCR技术的重复性，并示于表6和7中。表6相对于天数的重复性(HBV模板＝106拷贝/μl)表7相对于技术人员的重复性(HBV模板＝106拷贝/μl)此外，相对于天数和技术人员评价本发明PCR技术的重复性和比较实施例1，结果表示于下面的表8中。表8<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="801">项目发明比较实施例1基于天数的重复性(最大15％，平均8％)HBV106个拷贝(最大44％，平均27％)HBV103-6个拷贝基于技术人员的重复性(最大21％，平均15％)HBV106个拷贝(最大35％，平均21％)HBV104-6个拷贝</table></tables>2.8特异性使用本发明的肝炎检测试剂盒和常规技术(比较实施例3SolgentTM，在我国可商业购得的临床诊断试剂盒)对100个韩国人进行肝炎诊断，结果示于表8中。参考图8，结合常规技术的肝炎诊断试剂盒，观察到显示非特异性反应性的条带。而在本发明的肝炎诊断试剂盒中，没有观察到显示非特异性反应性的条带。实施例3临床检测将待测受试者分为代表针对HBsAg和HBVDNA(Digene)阳性反应性的患者组和代表针对HBsAg和HBsAg阴性反应性的正常组。在对于患者组中的118个受试者和正常组中的61个受试者进行临床检测。诊断结果示于下面表9中。使用QiagenMinElute试剂盒自受试者血清提取DNA样品。为了进行PCR，制备两倍浓缩的主混合物，然后与DNA样品混合(体积比1∶1)以得到PCR混合物。主混合物组合物的组成如下5×PCR缓冲液1.0μl蒸馏水1.04μl10mMdNTPs0.1μl20μM各引物混合物0.2μl酶混合物0.16μl在如下所述的条件下实施PCR91℃，1秒；63℃，15秒。表9临床检测结果TP真阳性，FP假阳性；TN真阴性；FN假阴性。根据这些检测结果，118名患者组中3人(约2.5％)被判断为假阴性，61名正常组中1人(约1.6％)被判断为假阳性。由检测结果可知本发明的试剂盒可以非常精确地诊断乙型肝炎感染。此外，本发明诊断试剂盒的敏感性，特异性和有效性概括在表10中。表10项目结果敏感性97.5％特异性98.4％有效性97.8％敏感性患者组中真正患者的比例＝(TP/(TP+FN))×100(％)特异性正常组中真正正常人的比例＝(TN/(TN+FP))×100(％)有效性全部群体中真正患者和真正正常人的比例＝((TP+TN)/(TP+TN+FP+FN))×100(％)从上述说明明显可知，引物组，使用该引物组检测乙肝病毒的方法，包括本发明引物组的乙肝病毒检测试剂盒，能够快速，精确地，可重复地诊断乙型肝炎。虽然本发明已通过例证性实施方案得以具体显示和说明，应理解本领域技术人员进行的各种形式和细节上的变化都没有脱离本发明权利要求所限定的本发明之精神和范围。序列表<110>三星电子株式会社(samsungelectronics)<120>检测乙型肝炎病毒的PCR引物组，使用该引物组检测乙型肝炎的方法以及包含该引物组的乙肝病毒检测试剂盒<130>si4414<160>40<170>KopatentIn1.71<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gtggctttggggcatggacatt22<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2ctctaaggcctcccgatacag21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3tcgaatagaaggaaagaagtcaga24<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4gctttggggcatggacattgacc23<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gcttgcctgagtgctgtatggtga24<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6agcagaggcggtgtcgaggagat23<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7agagcagaggcggtgtcgaggagat25<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8ggctttggggcatggacattgacc24<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9taggacccctgctcgtgtaa20<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10agaaaattgagagaagtccacca23<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11tggtggacttctctcaattttc22<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12gaagatgaggcatagcagcag21<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13cgatccatactgcggaactc20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14gacgggacgtaaacaaagga20<210>15<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15gaatcccgcggacgac16<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16gaccgcgtaaagagaggtg19<210>17<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17gcggacgacccctctc16<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18gtgcagaggtgaagcgaagt20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19cacctctctttacgcggtct20<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20cgttcacggtggtctccat19<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21gaggctgtaggcataaattgg21<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22cttggaggcttgaacagtgg20<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23tctttgtattaggaggctgtaggc24<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24ataagggtcaatgtccatgc20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25taggacccctkcbcgtgtta20<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26mgaaaattgagagaagtcmaccm23<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27kggtkgacttctctcaattttc22<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>28gaagatgaggcatagmagcag21<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29cgatccatactgyrgaactc20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30gayggracgtasacsaagka20<210>31<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>31gaatcchgcggacgam16<210>32<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>32gwccgcgtaaagagaggyg19<210>33<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>33gcggacgamccbtctb16<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>34gtgcagaggtgaagsgaagt20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>35crcctctctttacgcggwct20<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>36cgttcacggtggtykccat19<210>37<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>37gaggctgtaggcataa16<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>38cttggaggcktgaamagt18<210>39<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>39tstttgtaytvggaggctgtaggc24<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>40atahgkrtcaatgtccatgc20权利要求1.选自下面各引物组的PCR组(a)包括具有SEQIDNO1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO2所示核苷酸序列的引物的引物组；(b)包括具有SEQIDNO1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO3所示核苷酸序列的引物的引物组；(c)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO5所示核苷酸序列的引物的引物组；(d)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO6所示核苷酸序列的引物的引物组；(e)包括具有SEQIDNO4所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO7所示核苷酸序列的引物的引物组；(f)包括具有SEQIDNO8所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO7所示核苷酸序列的引物的引物组；(g)包括具有SEQIDNO9所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO10所示核苷酸序列的引物的引物组；(h)包括具有SEQIDNO11所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO12所示核苷酸序列的引物的引物组；(i)包括具有SEQIDNO13所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO14所示核苷酸序列的引物的引物组；(j)包括具有SEQIDNO15所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO16所示核苷酸序列的引物的引物组；(k)包括具有SEQIDNO17所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO18所示核苷酸序列的引物的引物组；(l)包括具有SEQIDNO19所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO20所示核苷酸序列的引物的引物组；(m)包括具有SEQIDNO21所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO22所示核苷酸序列的引物的引物组；(n)包括具有SEQIDNO23所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO24所示核苷酸序列的引物的引物组；(o)包括具有SEQIDNO25所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO26所示核苷酸序列的引物的引物组；(p)包括具有SEQIDNO27所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO28所示核苷酸序列的引物的引物组；(q)包括具有SEQIDNO29所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO30所示核苷酸序列的引物的引物组；(r)包括具有SEQIDNO31所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO32所示核苷酸序列的引物的引物组；(s)包括具有SEQIDNO33所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO34所示核苷酸序列的引物的引物组；(t)包括具有SEQIDNO35所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO36所示核苷酸序列的引物的引物组；(u)包括具有SEQIDNO37所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO38所示核苷酸序列的引物的引物组；和(v)包括具有SEQIDNO39所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO40所示核苷酸序列的引物的引物组。2.一种检测乙肝病毒的方法，其包括通过使用权利要求1的引物组之PCR扩增自生物体获得的核酸样品。3.权利要求2的方法，其中PCR是两步法PCR，包括变性步骤和退火及延伸步骤。4.权利要求2的方法，其中PCR实施30分钟或更短时间。5.权利要求2的方法，其中PCR在微PCR芯片上进行。6.权利要求2的方法，其中PCR使用0.2-1μM的各引物和0.01pg-1μg的模板DNA实施。7.权利要求2的方法，其中PCR在下述条件下进行在86-97℃变性1-30秒，并于60-70℃退火和延伸6-30秒。8.权利要求5的方法，其中微PCR芯片包括硅片，其表面是通过硅蚀刻术制成的PCR室形成的，而其它表面由用于加热PCR室的加热器形成；和具有进口和出口的玻璃片。9.包含权利要求1中所述引物组的乙肝病毒检测试剂盒。全文摘要本发明提供一种选自具有SEQIDNO1－40所示核苷酸序列的引物的引物组，一种通过使用该引物组实施PCR的检测乙肝病毒的方法，和包含该引物的乙肝病毒检测试剂盒。文档编号C12Q1/70GK1626677SQ20041005657公开日2005年6月15日申请日期2004年8月10日优先权日2003年8月14日发明者李英善,韩程任,黄贞周,金美卿,赵允卿,林熹均,金玲雅申请人:三星电子株式会社