专利名称：一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液的制作方法
技术领域：
本发明属于农业-畜牧兽医领域，具体地说，涉及一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液。
背景技术：
胚胎冷冻是长期保存动物种质资源的一项实用技术。胚胎冷冻技术的发展和应用减少了时间和空间对胚胎操作造成的限制，并可有效避免因家畜的活体运输所造成的疾病传播。自Rail和Fahyl985年报道玻璃化冷冻方法以来，该法因不需要昂贵的冷冻设备、操作简便、冷冻过程短，而受到广泛的重视，得到迅速的发展。玻璃化冷冻法是利用高浓度冷冻保护剂在快速降温过程中形成的玻璃态，有效地避免冷冻过程中有害冰晶的形成，从而使胚胎避免所受的物理性伤害1997年，Vajta等报道，用OPS法(open pulled straw，开放式拉长麦管)玻璃化冷冻牛体外生产胚胎获得成功。在小鼠原核胚、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、桑椹胚、囊胚、孵化囊胚、转基因胚胎及其他大家畜胚胎的冷冻保存上都得到了广泛的应用。随后又有多种可提高冷冻降温速度的冷冻载体被相继用于胚胎的冷冻保存，使冷冻降温速度大大提高，冷冻损伤得以减少。但玻璃化冷冻法所用的高浓度冷冻保护剂对胚胎的化学毒害作用很大，虽然有个例报道复苏后仅剩1个卵裂球存活的胚胎移植后也获得了妊娠，但通常认为超过50%卵裂球损伤的胚胎为死亡胚胎，其发育潜能差、着床率约为 1 %。着床率降低的原因可能是损伤后的卵裂球分解代谢产生某些毒性物质，不利于胚胎发育。因此，研究者迄今仍在不断探索冷冻后解冻胚胎体外培养或移植时胚胎质量提高的方法。褪黑素(Melatonin，MT)是主要由动物松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，具有调节生长和繁殖等多方面的生理功能。近年来研究报道表明，MT可以促进卵母细胞的体外成熟和胚胎的体外发育。例如，MT浓度在10_6 10_4mol/L时，能显著增加小鼠的体外受精率(27.6% vs 43. 9%或40. 4% )，在10_8 10_6mol/L时，可提高胚胎发育到4-细胞胚(16. Ovs 26. 7% )、8_ 细胞胚(12. Ivs. 25. 8 或 23. 5% )和囊胚的比率(8. 9vs 23. 5 或17. 5% MIshizuka等，2000)。常规慢速(细管)冷冻绵羊桑椹胚解冻后在含有MT的发育液中培养Mh，囊胚的孵化率增加，胚胎的退化率降低(Abecia等，200 。另外，在牛胚胎的体外发育液中添加MT的试验组囊胚发育率68. 85% (42/61)显著高于对照组50. 79% (32/63) (Papis等，2007)；在猪的卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎体外发育的研究中也发现，培养液中添加10_9mOl/LMT显著增加胚胎的卵裂率和囊胚细胞数，囊胚率没有显著提高(N.Rodriguez-Osorio等，2007) ； 10ng/mL MT能显著提高猪卵母细胞体外成熟过程中极体的排出率(84.6% vs75.6% )和孤雌激活后胚胎发育到囊胚的比率，但对卵裂率和囊胚细胞数的影响不显著(Jung-Teak Kang等，2008)。这些研究说明在不同时期的培养液中添加MT对卵母细胞的体外成熟和胚胎的体外发育都有积极的影响
发明内容
本发明的目的是提供一种促进OPS法玻璃化冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液。为了实现本发明目的，本发明的一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液，所述培养液的配方见表1 表1培养液配方
权利要求
1. 一种促进冷冻胚胎解冻后体外发育的培养液，其特征在于，所述培养液的配方见下表
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液的配方见下表
3.根据权利要求1或2所述的培养液，其特征在于，褪黑素的浓度为10_9 10_7mol/L。
4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于，褪黑素的浓度为10_9mOl/L。
5.权利要求1-4任一项所述的培养液在促进冷冻胚胎解冻后体外发育中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其是将冷冻胚胎解冻后在权利要求1-4任一项所述的培养液中进行培养，体外发育成囊胚。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，培养时间为90 96h。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述胚胎为2-细胞胚胎。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述2-细胞胚胎为OPS冷冻后的哺乳动物胚胎。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述2-细胞胚胎为OPS冷冻后的小鼠胚胎。
全文摘要
本发明提供了一种促进胚胎OPS法玻璃化冷冻解冻后体外发育的培养液，其是将冷冻2-细胞胚胎解冻后在含10-9mol/L褪黑素(MT)的培养液中进行培养，提高了胚胎的囊胚发育率、增加胚胎内细胞数，从而提高胚胎的质量，并为进一步开展家畜胚胎的OPS冷冻保存研究提供有益的参考。
文档编号C12N5/073GK102250832SQ20111014247
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者刘国世, 史文清, 张洪海, 朱士恩, 田秀芝 申请人:中国农业大学