专利名称：一种用于黄酒弃糟饲料的益生菌添加剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及利用酿造工业废弃物生产高活性饲用益生菌制剂的领域。
背景技术：
黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒，距今已有5000多年的历史。 黄酒作为低度、营养、保健型的酿造酒，正适合当今社会新的消费价值取向，其消费量每年保持在10%以上增长，目前我国年产量超过250万吨。黄酒糟是黄酒企业生产黄酒的副产物，是发酵酒醪经压榨、分离去酒液后的留下的固体残渣。以干型黄酒为例，每万吨黄酒将会产生黄酒糟1400吨左右(含水量45% -55%不等)，如生产其他类型黄酒其酒糟的数量将更大。按照每年生产250万吨的黄酒计算，产生的黄酒弃糟约为40万吨。我国有700多家黄酒企业，每年生产大量的黄酒糟。弃糟水分含量大，酸度高，易腐烂变质，不易保管和运输，若不及时处理，将严重污染环境。少数酒厂只作为普通的饲料低价出售或作为发酵饲料，利用率很低，多数厂家由于弃糟量大，加之黄酒生产具有季节性，不同季节产生酒糟量的不平衡，养殖场不愿购买。大量黄酒糟至今无法有效利用，造成严重的资源浪费。更有甚者，部分厂家以海洋倾倒、土地填埋、焚烧、土地农用等方式处理弃糟，对土壤和地下水造成严重的污染。在焚烧过程中产生的二噁英、二氧化硫、盐酸等气体还造成对对大气的污染等。随着生态环境意识的加强，黄酒弃糟污染问题日显突出。解决弃糟的处理或有效再利用问题已经迫在眉睫。在国内外对酒糟的研究除了继续发酵生产醋、开发成调味品和提取酒糟蛋白以外，还有利用酒糟制取甘油，生产淀粉酶和纤维素酶，制取糖用活性碳，外敷用于治疗关节炎等。不过在各种研究中较深入和广泛的还是酒糟用来生产饲料，这不仅节省了资源，而且还减少了对环境的污染。但是，弃糟直接干燥作为动物饲料，存在粗纤维含量较高，消化性和适口性差的问题。黄酒糟的热能比较低，含有不溶性物质多，难以直接利用。而且干燥能耗大，不经济。且在生产中往往因饲喂不当、长期饲喂或突然大量饲喂，常会引起食后中毒现象。如贵州九仓镇养殖户用酒糟喂养黔北麻羊，饲喂后所有羊只出现兴奋不安、呼吸迫促、四肢站立不稳等异常状况，严重者出现死亡。根据剖检结果并结合临床症状诊断为酒糟急性中毒。酒糟中含有酒精和醋酸，大量饲喂，不仅易造成中毒，而且由于酒精所含营养不平衡而引起便秘，另外，在配种期间，也不宜大量使用酒糟。酒糟饲料一般不可单一使用，还要加入一定量的维生素D，配合玉米面、麸皮、骨粉和青绿饲料等。益生菌可产生各种酶，如水解酶、发酵酶和呼吸酶，这些酶有利于降解饲料中的蛋白质、脂肪和较复杂的碳水化合物，给动物提供营养物质。饲料对粘附其上的益生菌有携带作用，益生菌随发酵饲料颗粒进入动物体内，充分发挥益生作用。益生菌能粘附到肠壁细胞上起到屏障作用，竞争性抑制排斥病原菌，维持动物胃肠道菌群平衡。消化道内的益生菌是良好的免疫激活剂，能刺激肠道免疫器官的生长发育，提高动物抗体水平和巨噬细胞的活性，增强机体的体液免疫和细胞免疫功能，及时杀灭入侵的致病菌，增强动物对多种疫病的抵抗力，大幅度降低发病率和死淘率。经益生菌发酵后饲料有特别的香味，适口性好，可刺激食欲，提高采食量；同时由益生菌产生的蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶，可以帮助动物消化吸收，转化利用率较高，可以提高动物的生产性能。使用益生菌喂养动物，还可以可抑制肠道内腐败菌，减少氨、生物胺、吲哚等有害物质产生，芽胞杆菌产生的氨基氧化酶及分解硫化氢的酶类，可将吲哚类物质降解，从而降低畜禽舍内氨气、硫化氢的浓度和臭味，减少污染，改善环境。
发明内容
本发明发明了一种用于黄酒弃糟饲料的益生菌添加剂的制备方法。本发明采用自主获得的益生菌菌种丁酸梭菌，具有明显的调节肠道菌群和恢复抗生素引起的肠道菌群紊乱；发酵乳杆菌能够产生GABA，具有降低应急和热敏反应功能；发酵乳杆菌La-YI产生 a-半乳糖苷酶，可有效降解饼粕类饲料组分重的半乳糖苷类等营养拮抗因子，显著提高饲料报酬；动物双歧杆菌乳酸亚种QqOS具有耐氧特性，可以消耗基质中的微量氧气，为丁酸梭菌等严格厌氧菌提供良好的厌氧环境，同时具有良好降解胆固醇作用(去除率可达 56%)，减少肠道胆固醇在吸收，降低动物产品的胆固醇含量，多菌种复合，实现产品多功能。为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的一种用于黄酒弃糟饲料的益生菌添加剂，含多种功能不同的益生菌。通过将丁酸梭菌，发酵乳杆菌 ML7(Lactobacillus fermentum ML7),发酵乳杆菌 La-YI (Lactobacillus fermentum La- )，动物双歧杆菌乳酸亚种 Qq08 (BifidcAacterium animal is subsp. Iactis Qq08 CGMCCNo. 2844)高密度发酵后制备而成。通过饲用益生菌的评价指标对菌株进行耐热性、耐酸性、耐胆盐性、抗菌性、黏附性等进行体外综合评价。丁酸梭菌(Clostridium butyricum) ( 丁酸梭菌培养与发酵动力学以及调节腹泻小鼠肠道菌群平衡的研究，孔青，浙江大学博士论文)能产生降血压功能因子Y -氨基丁酸的发酵乳杆菌ML7 (Lactobacillus fermentum ML7)，经过发酵培养，Y-氨基丁酸的产量可达到117ang/L(产Y -氨基丁酸乳酸菌的研究与应用，穆琳，浙江大学硕士学位论文)能产生α-半乳糖苷酶发酵乳杆菌 La-YI (Lactobacillusfermentum La-ΥΙ)，有效消除饼粕中的抗营养因子半乳糖苷类化合物，发酵培养4小时，a-半乳糖苷酶活性达到17.35U/mL。(发酵乳杆菌增殖培养基营养因子优化研究，叶雪飞等，食品科学，2010， Vol. 31. No. 05，194-196)能够有效去除胆固醇的动物双歧杆菌乳酸亚种Qq08 (Bifidobacterium animal is subsp. Iactis Qq08)，去除率达到56. 以上保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC。保藏日期2009年1月4日，保藏号CGMCC No.观44。最终选定以上菌株作为申请的出发菌株。通过将上述菌株分别发酵达到一定菌体浓度，按比例混合，干燥后即得黄酒弃糟饲用益生菌添加剂成品，
具体实施方式
实施例11) 丁酸梭菌的发酵。液体种子种子培养基2. 44%葡萄糖(W/V)，2.08%酵母浸膏(W/V)，l%胰蛋白陈(w/v) ,0.1% (NH4) 2S04 (w/v) ,0.1% NaHC03 (w/v) ,0. 02 % MnS04 · H20 (w/v) ,0. 02 % Mgso4 ； · 7H20(w/v) ,0. 002% CaCl2 (w/v)，初始 pH 为 8. 5。丁酸梭菌的发酵培养基2%葡萄糖(w/v)，3. 98 %豆饼粉提取液，0. 1 % (NH4) 2S04 (w/v) ,0. 124 % NaHC03 (w/v)，0. 37 % 玉米菜(w/v) ,0. 02 % MnS04 · H20 (w/v)， 0. 02% Mgso ； · 7H20(w/v) ,0. 002% CaCl2 (w/v)，初始 pH 为 7. 5。培养条件为厌氧，37°C，24h。活菌数可达7. lxl08cFU/mL，2)发酵乳杆菌ML7的发酵。培养基成分为乳糖15g，酵母膏5g，胰蛋白胨5g，无水乙酸钠2g，MgS04 · 7H20， 0. 02g, MnS04 · 4H20 0. OOlg, NaCl 0. OOlg, FeS04 · 7H20 0. OOlg,麦芽汁(糖度 15° Τ) 10ml，蒸馏水1000ml，初始pH为6. 8。用此培养基，在37°C条件下厌氧培养20h后得到的ML7活菌数可达2. hl01Qcfu/ml。。3)发酵乳杆菌La-YI的发酵培养基成分为葡萄糖2. 0 %，牛肉膏0. 5 %，胰酶解酪朊0. 5 %，玉米浆2 %，柠檬酸二铵0. 2 %，乙酸钠0. 5 %，磷酸氢二钾0. 2 %，硫酸镁0. 05 %，硫酸锰0. 02 %，蒸馏水 1000ml。发酵乳杆菌La-Yl在优化后的MRS培养基中，37°C培养16 18h，达到了 IOltlCFU/ mL以上4)动物双歧杆菌乳酸亚种Qq08的发酵TPY液体胰酶解酪朊IOg ；蛋白胨5g ；酵母浸膏2. 5g ；葡萄糖15g ；土温80 Iml ； K2HPO4 2g ；MgC12 · 6H20 0. 5g ；CaCl2 0. 15g ；ZnCl2 · 7H20 0. 25g, FeCl 33g，半胱氨酸 0. 5g ； ρΗ6· 5 ；H2O 1000mL。培养条件厌氧，37°C，24h0上述菌株按丁酸梭菌1-5份，发酵乳杆菌ML7 1_3份，发酵乳杆菌La-YI 1_3份， 动物双歧杆菌乳酸亚种QqOS 1-3份的比例混合即得黄酒弃糟饲用益生菌添加剂。将1000ml上述黄酒弃糟饲用益生菌添加剂菌液在速度为6000r/min，温度为4°C 的条件下离心20min，弃去上清液，用生理盐水洗涤后收集菌泥。在离心所得的菌泥中加入菌泥两倍体积的复配保护剂，保护剂中脱脂乳海藻糖维生素C 谷氨酸钠(质量比) =15 4 1 1.5，并混勻。取500ml的烧杯，装入液氮，迅速用Iml枪头的移液枪往烧杯中滴入15ml菌泥，在液氮环境中放置池后，放入冷冻干燥仪中冻干，得黄酒弃糟饲用益生菌添加剂成品。
权利要求
1.一种用于黄酒弃糟饲料益生菌添加剂的制备方法，依次包含如下步骤1)丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的发酵液体种子种子培养基2. 44%葡萄糖(W/V)，2.08%酵母浸膏(W/V)，l%胰蛋白陈(w/v) ,0. 1 % (NH4) 2S04 (w/v) ,0. 1 % NaHCO3 (w/v)，0· 02 % MnSO4 · H2O (w/v)，0· 02 % MgSO4 · 7H20 (w/v)，0. 002 % CaCl2 (w/v)，初始 pH 为 8· 5 ；丁酸梭菌的发酵培养基2%葡萄糖(w/v)，3. 98%豆饼粉提取液，0. (NH4)2SO4(w/ ν) ,0.124 % NaHCO3 (w/v), 0. 37 % 玉米菜(w/v), 0. 02 % MnSO4 ‘ H2O (w/v), 0. 02 % Mgso4 ； · 7H20 (w/v)，0. 002 % CaCl2 (w/v)，初始 pH 为 7. 5 ；培养条件为厌氧，370C，24h,活菌数可达7. lxl08cFU/mL。2)发酵乳杆菌ML7 (Lactobacillus fermentum ML7)的发酵培养基成分为乳糖15g，酵母膏5g，胰蛋白胨5g，无水乙酸钠2g，MgSO4 · 7Η20，0· 02g, MnSO4 · 4H20 O.OOlg，NaCl 0. OOlg, FeSO4 · 7H20 O.OOlg，麦芽汁(糖度 15° Τ) 10ml，蒸溜水1000ml，初始pH为6. 8 ；用此培养基，在37°C条件下厌氧培养20h后得到的ML7活菌数可达 2. 2xl010cfu/mL·3)发酵乳杆菌La-YI (Lactobacillus fermentum La-YI)的发酵培养基成分为葡萄糖2. 0 %，牛肉膏0. 5 %，胰酶解酪朊0.5%，玉米浆2 %，柠檬酸二铵0. 2 %，乙酸钠0.5%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.05%，硫酸锰0.02%，蒸馏水1000ml ； 发酵乳杆菌La-Yl此培养基中，37°C培养16 18h，达到了 101(lCFU/mL以上；4)动物双歧杆菌乳酸亚种Qq08 (Bifidobacterium animal is subsp. Iactis Qq08)的发酵TPY液体胰酶解酪朊IOg ；蛋白胨5g ；酵母浸膏2. 5g ；葡萄糖15g ；土温80 Iml ;Κ2ΗΡ04 2g ；MgCl2 · 6H20 0. 5g ；CaCl2 0. 15g ；ZnCl2 · 7H20 0. 25g, FeCl3 3g，半胱氨酸 0. 5g ；ρΗ6· 5 ； H2O IOOOmL ；培养条件厌氧，37°C，24h;上述菌株按丁酸梭菌1-5份，发酵乳杆菌ML7 1-3份，发酵乳杆菌La-YI 1-3份，动物双歧杆菌乳酸亚种QqOS 1-3份的比例混合即得黄酒弃糟饲用益生菌添加剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法还包括冷冻干燥步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述冷冻干燥方法为将1000ml上述黄酒弃糟饲用益生菌添加剂菌液在速度为6000r/min，温度为4°C的条件下离心20min，弃去上清液，用生理盐水洗涤后收集菌泥；在离心所得的菌泥中加入菌泥两倍体积的复配保护剂， 保护剂中脱脂乳海藻糖维生素C 谷氨酸钠(质量比)=15 4 1 1. 5，并混勻； 取500ml的烧杯，装入液氮，迅速用Iml枪头的移液枪往烧杯中滴入15ml菌泥，在液氮环境中放置池后，放入冷冻干燥仪中冻干，得黄酒弃糟饲用益生菌添加剂成品。
全文摘要
本发明提供了一种用于黄酒弃糟饲料益生菌添加剂的制备方法，采用益生菌菌种丁酸梭菌，发酵乳杆菌ML7，发酵乳杆菌La-YI，动物双歧杆菌乳酸亚种Qq08，多菌种复合制备多功能黄酒弃糟饲料益生菌添加剂。该添加剂具有调节动物肠道菌群和恢复抗生素引起的肠道菌群紊乱，降低应急和热敏反应功能，有效降解饼粕类饲料组分重的a-半乳糖苷类等营养拮抗因子，显著提高饲料报酬，以及降解胆固醇作用减少肠道胆固醇在吸收，降低动物产品的胆固醇含量得作用。并能改善黄酒弃糟饲料的适口性，提高牲畜食欲增加采食量。
文档编号C12N1/20GK102239957SQ201110142478
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者周永山 申请人:绍兴市古煌酿酒有限公司