专利名称：用于去除所选择dna序列的方法和手段的制作方法
技术领域：
本发明涉及在去除步骤期间不求助于体外(in vitro)培养，允许高效去除事先已导入所述植物内的目的DNA序列中所选择部分例如选择标记基因或筛选标记基因的方法和手段。去除方法可以作为用于在植物细胞和植物中将靶DNA序列经同源重组精确交换为目的DNA序列的方法的一部分使用，由此随后可以去除同源重组阶段期间为临时选择基因替换事件所用的选择标记或筛选标记，而不会留下痕迹并且在去除步骤期间 不求助于体外培养。
背景技术：
去除导入植物细胞或植物内，但在导入后随即因多种原因变成无用或甚至是多余的外源DNA中所选择亚片段已经是热点研究的主题。此类序列的实例例如是需要用于分离转基因植物而在成熟植物内不再需要的选择标记基因。实现高效消除选择标记基因的方法主要依赖位点特异性重组或转座(见例如Hohn等，Plant BioTechnology第139-143页)。Siebert和Puchta(2002)描述可以通过同源重组和通过非同源末端连接从高等真核生物的基因组内高效地切除侧翼为切点罕见限制酶位点的转基因序列。W003/004659涉及重组系统并涉及用于从真核生物的染色体DNA中去除核酸序列的方法。该文件还涉及含有所述系统或通过该方法产生的转基因生物(优选地是植物)。然而该方法基本上需要利用体外培养方法来鉴定或选择其中待去除DNA序列的缺失已经有效发生的那些植物细胞并从此类细胞再生植物。美国专利申请2005/0060769提出从第一个转基因玉米(Zea mays)植物细胞中制备重组的转基因玉米植物或植物细胞的方法，其中相对于第一个转基因植物细胞内的转基因的遗传结构，重组植物或植物细胞内的转基因由于同源重组介导性转基因缺失作用而具有改变的遗传结构。在下文，包括在权利要求书内，描述如此方法和手段的不同实施方案，该方法和手段可不求助于体外培养方法，高效去除已事先导入植物细胞内的DNA分子的部分中所选择的亚序列。W097/30166或美国专利6，407，314描述可以用于在小孢子内表达基因的来自烟
草的小孢子特异性基因的启动子片段。由本发明解决的另一个问题涉及定向和精确地将植物细胞内的靶DNA序列通过同源重组交换成替换性DNA序列，而不留下方法的痕迹，并且在同源重组的初始步骤后不求助于体外培养方法。为此目的，可以方便地施用如此方法，即其可以经染色体内同源重组而高效地去除事先已插入基因组、优选地是植物细胞的核基因组内DNA分子的部分中所选择亚序列。
早已认识到需要对植物内转基因整合的位点进行控制，并且已经开发数种方法试图满足这种需要(综述见 Kumar 和 Fladung，2001，Trends in Plant Science,6， PP155-159)。这些方法基本上依赖于以同源重组为基础的转基因整合，该策略已经成功地应用于原核生物和低等真核生物(见例如EP0317509或相应的出版物Paszkowski等， 1988,EMBO J.，7，第4021-4026页)。然而对于植物，用于转基因整合的主导机制以很少涉及重组DNA链间同源性的异常重组为基础。因而，此领域内的主要挑战是检测由所导入外源DNA经异常重组的极高效整合所掩盖的稀有同源重组事件。解决此问题的一种方式是选择通过异常重组发生的整合事件，如W094/17176内举例。 解决此问题的另一种方式是通过切点罕见内切核酸酶如I-SceI诱导双链DNA断裂而激活靶基因座。已经使用农杆菌(Agrobacteria)送递修复性DNA至植物细胞证实这种技术增加同源重组频率至少2个数量级(Puchta等，1996，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.， 93，第 5055-5060 页)。W096/14408描述编码I-SceI酶的分离的DNA。该DNA序列可以并入克隆载体及表达载体、转化的细胞系和转基因动物。该载体用于基因作图和基因的位点定向性插入。W000/46386描述通过I-SceI双链断裂而修饰、修复、减弱和失活细胞内的基因或其它染色体DNA的方法。还公开了治疗或预防有需要的个体内遗传疾病的方法。还公开了嵌合的限制性内切核酸酶。Chilton 和 Que (2003，Plant Physiol. 133 第 956-965 页)和 Tzifira 等(2003， Plant Physiol. 133 第1011-1023页)报道T-DNA偏好性地整合至由切点罕见酶I-SceI 或I-CeuI人工诱导的双链DNA断裂内。该报道还包括包含相应切点罕见酶的识别位点的供体T-DNA载体。然而，现有技术内的方法常常依赖于通过同源重组重新形成或产生完整的选择标记基因或筛选标记基因。因此，仍需要允许通过替换性DNA定向交换几乎任何靶DNA序列的方法。这些问题和其它问题如下文所述在本发明不同的详述实施方案内并在权利要求书内得到解决。发明简述在本发明的一个实施方案中，描述了用于将目的DNA分子导入植物细胞或植物的基因组内，随后去除目的DNA分子的亚序列(优选地包含选择标记或筛选标记)的方法，该方法包括步骤a.将目的DNA分子导入植物细胞的基因组，目的DNA分子包含侧翼为同向重复排列的两个DNA序列的DNA分子的亚序列并且还包含至少一个切点罕见双链DNA断裂诱导 (DSBI)酶的识别位点，其中所述识别位点位于以同向重复排列的两个DNA序列附近，优选地位于它们之间；b.选择在其中目的DNA分子整合进入基因组内的植物细胞并从植物细胞再生植物；c.将此植物与包含编码DSBI酶的嵌合基因的第二个植物杂交，其中所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段i小孢子特异性启动子片段，如选自核苷酸序列SEQ ID No. 3的启动子片段；
ii DNA区域，其编码识别所述识别位点的切点罕见双链断裂诱导酶，如选自I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-CivI、PI-Ctr I、PI-Aae I,PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-MavI、PI-Mch I、 PI-Mfu I,PI-Mfl I,PI-Mga I,PI-Mgo I,PI-MinI,PI-Mka I,PI-Mle I,PI-Mma I,PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-RmaI、PI-Spb I、 PI-Ssp I,PI-Fac I,PI-Mja I,PI-Pho I、PI-TagI、Pi-Thy I,PI-Tko I 或 PI-Tsp I 的内切核酸酶或包含Zn指DNA结合结构域及DNA切割结构域的嵌合内切核酸酶；iii转录终止和聚腺苷酸化区域；d.选择包含目的DNA分子和编码DSBI酶的嵌合基因的后代植物(Fl植物)；e.将后代植物与另一植物杂交，由此使用后代植物作为花粉供体；f.选择包含编码DSBI酶的嵌合基因的后代植物的群体(F2群体)；和g.选择在其中DNA分子的亚序列已经通过以同向重复排列的两个DNA序列间的同源重组被缺失的后代植物，并且任选地h.将其中DNA分子的亚序列已经缺失的后代植物与另一植物杂交；和i.得到后代植物(F3植物)的群体并选择不含编码切点罕见的DSBI酶的嵌合基因的植物。在本发明的另一个实施方案中，提供用于将植物基因组、特别是植物的核基因组内的靶DNA序列交换为目的DNA序列的方法，该方法包含如下步骤a.在植物细胞基因组内预先选择位点处诱导第一个双链DNA断裂，所述预先选择位点位于靶DNA序列内或位于靶DNA序列附近；b.将目的DNA分子导入植物细胞，该DNA分子包含 i.位于两个侧翼DNA区域之间的目的DNA序列，其中所述的侧翼DNA区域与植物细胞基因组内靶DNA序列的侧翼DNA区域并且优选预先选择位点的侧翼DNA区域具有至少 80%序列同源性、优选100%序列同源性；ii.位于侧翼DNA区域之间的选择标记基因或筛选标记基因，该选择标记基因或筛选标记基因还位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的部分侧翼DNA区域之间， 其中所述的部分侧翼DNA区域包含侧翼DNA区域之一的一部分；iii.位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的部分侧翼DNA区域之间的 DSBI酶的识别位点；c.选择包含选择标记或筛选标记的植物细胞的群体；d.选择在其中目的DNA序列(和选择标记或筛选标记)已经借助侧翼DNA区域通过同源重组导入的植物细胞，并从植物细胞再生植物；e.将包含选择标记基因的再生植物或其后代植物与包含编码切点罕见双链断裂诱导(“DSBI”)酶的嵌合基因的植物杂交，其中该嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段i.小孢子特异性启动子；ii.编码识别位于目的DNA内的识别位点的双链DNA断裂诱导酶的DNA区域；iii.转录终止和聚腺苷酸化区域；f.选择包含选择标记基因或筛选标记基因和编码DSBI酶的嵌合基因的后代植物 (Fl植物)；
g.将后代植物与另一植物杂交，由此使用后代植物作为花粉供体；h.选择包含编码DSBI酶的嵌合基因的后代植物的群体(F2群体)；和i.选择这样的后代植物，在其中选择标记基因或筛选标记基因通过侧翼DNA区域之一与包含侧翼DNA区域之一的一部分的部分侧翼DNA区域间的同源重组被缺失。
本发明涉及通过以上所述方法可得到的植物。在本发明的又另一个实施方案中，本发明涉及包含编码切点罕见的DSBI酶的嵌合基因，如SEQ ID NO 6中从核苷酸1941至核苷酸3913的嵌合基因的植物，该嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段i.小孢子特异性启动子，如小孢子特异性启动子片段，如选自SEQID No 3的核苷酸序列的启动子或其功能性片段；ii. DNA区域，其编码识别位于目的DNA内的识别位点的双链DNA断裂诱导酶，如选自 I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I,PI-Fli I,Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、 I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I,PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、 PI-Mch I,PI-Mfu I,PI-Mfl I,PI-Mga I,PI-Mgo I,PI-Min I,PI-Mka I,PI-Mle I,PI-Mma I,PI-Msh I,PI-MsmI,PI-Mth I,PI-Mtu I,PI-Mxe I,PI-Npu I,PI-Pfu I,PI-RmaI,PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-TagI、PI-Thy I、PI-Tko I 或 PI-Tsp I 的内切核酸酶或包含Zn指DNA结合结构域及DNA切割结构域、特别是包含SEQ ID No 1或 SEQ ID No 2的核苷酸序列的DNA区域的嵌合内切核酸酶；和iii.转录终止和聚腺苷酸化区域。本发明还涉及以上所述的嵌合基因。在本发明的另一个实施方案中，提供如此DNA载体，其借助在靶序列内或其附近预先选择位点处诱导双链断裂而将植物细胞基因组内的靶DNA序列交换为目的DNA序列， 该DNA载体包含a.位于两个侧翼DNA区域之间的目的DNA序列，其中所述的侧翼DNA区域与靶 DNA序列的侧翼DNA区域和预先选择位点的侧翼DNA区域具有至少80%序列同源性、优选 100%序列同源性；b.位于侧翼DNA区域之间的选择标记基因或筛选标记基因，该选择标记基因或筛选标记基因还位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的包含侧翼DNA区域之一的一部分的部分侧翼DNA区域之间；和c.位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的部分侧翼DNA区域之间的 DSBI酶的识别位点。附图简述
图1至3代表用于去除导入或已经导入植物细胞内的目的DNA中所选择亚部分的方法的不同实施方案。这些实施方案仅用于说明目的并且不应当用来以限制性方式解释权利要求书。图1是用于将具有所选择亚部分的目的DNA导入植物细胞并随后去除目的DNA中所选择亚部分的方法的示意图，其中所述的亚部分包含选择标记基因或筛选标记基因特征代表任何目的DNA序列；DSB 双链断裂诱导酶(“DSBIE”)的识别位点； SMGl 选择标记基因或筛选标记基因；drs 同向重复序列；SMG2 与编码DSBIE的嵌合基因连接的选择标记基因或筛选标记基因；MSP 小孢子特异性启动子；3’ 转录终止和聚腺苷酸化信号； 图2是允许用替换性DNA序列精确替换靶DNA序列的方法的示意图。DSBl 第一个双链断裂诱导酶的识别位点；FSl 侧翼序列1 ；FS2 侧翼序列2 ；DSB2 第二个双链断裂诱导酶的识别位点；SMGl 选择标记基因1或筛选标记基因1 ;SMG2 选择标记基因2或筛选标记基因2 ；DSBIE 双链断裂诱导酶；drl 同向重复序列1 (其与作为侧翼序列2的一部分的同向重复序列2相似或相同；本文中也称作“部分侧翼DNA区域”)；MSP:小孢子特异性启动子；3’ 转录终止和聚腺苷酸化信号。图3是与图2内所示方法类似的允许用替换性DNA序列精确替换靶DNA序列的方法的示意图。drl在此情况下是这样的同向重复序列，其是来自侧翼序列1的一部分并与同向重复序列2(dr2)相似或相同。发明的详细实施方案本发明基于如此发现，即可以高效地去除侧翼为两个同向重复序列并位于切点罕见双链DNA断裂诱导酶的识别位点附近的DNA分子中所选择序列，这在当包含此DNA的植物首先与包含处于小孢子特异性启动子控制下的编码切点罕见双链DNA断裂诱导酶的嵌合基因的植物杂交并将所得植物的花药用来对受体植物授粉时实现。因此，本发明在一个实施方案内涉及包含处于小孢子特异性启动子的控制下的、 编码切点罕见双链DNA断裂诱导内切核酸酶的嵌合基因的植物的用途，以便通过杂交去除位于切点罕见双链DNA断裂诱导内切核酸酶的识别位点附近并还位于以同向重复方向存在的两个序列之间的DNA片段(见图1)。切点罕见的DSBI内切核酸酶在花药形成期间于小孢子内的表达足以诱导双链DNA断裂并因而显著刺激同向重复序列间的染色体内同源重组，导致去除位于这些同向重复序列之间的序列。也就是说，在本发明的一个实施方案中，提供用于将目的DNA分子导入植物细胞或植物的基因组内，随后去除该DNA分子的亚序列的方法，该方法包括步骤a.将此目的DNA分子导入植物细胞的基因组，此目的DNA分子包含侧翼为同向重复排列的两个DNA序列的该DNA分子的亚序列，并且还包含至少一个切点罕见双链DNA断裂诱导(DSBI)酶的识别位点，其中所述的识别位点位于以同向重复排列的两个DNA序列之间；b.选择在其中目的DNA分子整合进入基因组内的植物细胞并从植物细胞再生植物；c.将此植物与包含编码DSBI酶的嵌合基因的第二个植物杂交，其中所述的嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段i.小孢子特异性启动子；ii.编码识别所述识别位点的切点罕见双链断裂诱导酶的DNA区域；iii.转录终止和聚腺苷酸化区域；d.选择包含目的DNA分子和编码DSBI酶的嵌合基因的后代植物(Fl植物)；e.将后代植物与另一植物杂交，由此使用后代植物作为花粉供体；f.选择包含编码DSBI酶的嵌合基因的后代植物的群体(F2群体)；和g.选择在其中目的DNA分子的亚序列已经通过以同向重复排列的两个DNA序列间的同源重组被缺失的后代植物。如本文中所用，“切点罕见双链DNA断裂诱导内切核酸酶”是能够在称作“识别位点”的特定核苷酸序列内诱导双链DNA断裂的酶。切点罕见内切核酸酶，有时又称作大范围核酸 酶，具有14至40个连续核苷酸的识别位点。因此，切点罕见内切核酸酶具有非常低的切割频率，即便在较大的植物基因组内亦如此。归巢内切核酸酶构成此类切点罕见内切核酸酶的一个家族。它们可以由内含子、独立基因或间插序列编码，并展示出使之与通常来自细菌限制性修饰II型系统更常见的限制酶相区别的醒目结构特性和功能特性。它们的识别位点具有广泛非对称性，这与绝大多数限制酶识别位点的特征性二重对称相反。已经证实由内含子或内含肽编码的数种归巢内切核酸酶可促进它们各自的遗传元件归巢至无内含子或无内含肽的等位位点内。通过在无内含子或无内含肽的等位基因内产生位点特异性双链断裂，这些核酸酶产生重组性末端，该重组末端参与了复制编码序列并在DNA水平引起内含子或间插序列插入的基因转变过程。充分得到表征的归巢内切核酸酶是I-SceI。Ι-Scel是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisea)内负责线粒体中内含子移动的位点特异性内切核酸酶。该酶由21S rRNA基因的任选内含子Sc LSU. 1编码并在内含子插入位点处诱导双链DNA断裂，产生带3’0H突出端的4bp交错切口。I-SceI内切核酸酶的识别位点延伸超过18bp非对称性序列(ColIeaux等 1988Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 6022-6026)。I-SceI 的氨基酸序列和与线粒体 I-SceI 基因等效的通用密码子已经例如由WO 96/14408提供。W096/14408也公开了仍有功能的 I-SceI蛋白的众多变体。PCT申请PCT/EP04/013122(本文中引用作为参考)提供已经优化用于植物中表达的I-SceI的合成性核苷酸序列变体。此合成性I-Sce I编码区的核苷酸序列以UIPAC 密码子描述于SEQ ID No 1。UIPAC密码子的符号具有它们的常用含义，即N = A或C或G 或 T;R = A 或 G;Y = C 或 T;B = C 或 G 或 T (非 A) ；V = A 或 C 或 G(非 T) ；D = A 或 G 或 T (非 C) ；H = A 或 C 或 T (非 G) ；1( = 6或11;1 =八或(；5 = 6或(；1 =八或11。其它切点罕见的DSBI酶及它们相应的识别位点的列表提供于W003/004659的表1 内(第17至第20页)(本文中引用作为参考)。它们包括I-SceI、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、Ι-SceII、I-Sce III、HO、PI-Civ I,PI-Ctr I、 PI-Aae I,PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I,PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、 PI-Mgo I、 PI-Min I、 PI-Mka I, PI-Mle I、 PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I、 PI-MthI、 PI-Mtu I,PI-Mxe I,PI-Npu I,PI-Pfu I,PI-Rma I,PI-Spb I、PI-SspI、PI_Fac I,PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、Pi-Thy I、PI-Tko I 或 PI-TspI。此外，可获得设计基本上识别任何所选择靶核苷酸序列的客户定制型切点罕见内切核酸酶的方法。简而言之，嵌合性限制酶可以使用为识别特定核苷酸序列所设计的锌指结构域与来自天然限制酶如FokI的非特异性DNA切割结构域的杂合体加以制备。此类方法已经描述于WO 03/080809、W094/18313或W095/09233以及Isalan等， 2001, Nature Biotechnology 19,656-660 ；Liu 等 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530内。通过从变体的文库中选择而产生客户定制型大范围核酸酶的另一个途径描述于 W02004/067736 内。如本文中所用，“侧翼为同向重复排列的两个DNA序列”表示两个DNA区域分别紧接在待从导入的DNA分子中去除的序列的每一端，其中所述的两个DNA区域在核苷酸序列上基本上相似。同向重复序列不必完全相同，但是可以在约75%至约100%序列同一性之间变化。重复序列越短，对序列相似性的要求越严格。然而，为了恢复DNA序列而不留下痕迹，如下文中所述，以同向重复排列的DNA序列优选应当完全相同。为避免疑问，如果在核苷酸序列上基本上相似的两个DNA区域包含于双链DNA分子内，则这些DNA序列应当位于同一 DNA链上，处于相同的5，一3，方向。重复的DNA序列可以是至少10个、50个或100个核苷酸长度，不过，序列当然可以更长。然而，已经发现长度超过300个核苷酸的重复序列不再显著地增强导致位于同向重复序列之间DNA序列去除的染色体内同源重组。为本发明的目的，表述为百分数的两个相关性核苷酸序列或氨基酸序列的“序列同一性”指在两个优化比对序列内具有完全相同残基的位置数除以所比较的位置数 (X100)。将空位(即对比中一个残基存在于一个序列内而不存在于另一序列的位置)视作不具有完全相同残基的位置。两个序列的对比通过Needleman和Wunsch算法(Needleman 和Wunsch 1970)开展。计算机辅助的序列对比可以使用标准软件程序，如作为Wisconsin Package Version 10. 1 (Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin,USA)部分的GAP, 利用具有空位生成罚值50和空位延伸罚值3的默认计分矩阵方便地开展。虽然DSBI识别位点优选地位于同向重复的DNA序列之间，但是这既非重要，也非需要。实际上，DSBI识别位点还可能是重复DNA序列中一个序列的一部分。如本文中所用“位于附近”指DSBI的位置距离同向重复DNA序列在500bp、lkbp至 IOkbp之间。本文中所述的方法需要利用编码切点罕见双链断裂诱导酶的嵌合基因，由此内切核酸酶的编码区处在小孢子特异性启动子片段的控制下。如本文中所用的“小孢子特异性启动子区域”或“小孢子特异性启动子”或“小孢子特异性启动子片段”是能够选择性地、优选是特异性地在植物的单细胞性小孢子内促进转录的启动子区域或启动子或启动子片段。在被子植物中，有性繁殖需要产生有活力的雄性配子体和雌性配子体。作为雄性配子体的花粉在花药内形成并从造孢细胞开始，发育成性母细胞。性母细胞发生减数分裂以形成单倍体细胞的四分体，四分体随后释放至花药室。 随着扩张和空泡形成，小孢子的非对称性有丝分裂产生含有营养细胞和生殖细胞的双细胞性花粉。在大部分物种内，花药在双细胞条件下散发。在WO 97/30166(本文中引用作为参考；还见SEQ ID No 3)内描述了作为合适小孢子特异性启动子区域的烟草NTM19基因启动子区域。其功能性片段已经整合入实施例的嵌合基因(SEQ ID No 6)内。小孢子特异性启动子片段可以包括SEQ ID No 3中从位置1至位置954或从位置1至位置993的核苷酸序列或SEQ ID No 6中从位置1941至2926的核苷酸序列。 如本文中所用“切点罕见双链断裂诱导内切核酸酶的编码区”或“切点罕见双链断裂诱导酶的编码区”是编码特征为切点罕见的DSBI酶，如归巢内切核酸酶或在本申请内其它处所描述的嵌合内切核酸酶的核苷酸序列。编码区因此可以包含编码下表内所列归巢内切核酸酶中任意氨基酸序列的任意核苷酸序列，其中所述的归巢内切核酸酶可以在提到的登录号下于公共数据库内找到(它们在本文中均引用作为参考)
权利要求
1.用于将植物基因组内的靶DNA序列交换成目的DNA序列的方法，包括如下步骤a.在植物细胞基因组内预先选择位点处诱导第一个双链DNA断裂，所述预先选择位点位于所述靶DNA序列内或位于所述靶DNA序列附近；b.将目的DNA分子导入所述的植物细胞，所述的DNA分子包含i.位于两个侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，其中所述的侧翼DNA区域与所述植物细胞基因组内所述靶DNA序列的侧翼DNA区域并且优选所述预先选择位点的侧翼DNA 区域具有至少80%序列同源性；ii.位于所述侧翼DNA区域之间的选择标记基因或筛选标记基因，所述选择标记基因或筛选标记基因还位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的至少部分的所述侧翼 DNA区域之一的另一拷贝之间，其中所述另一拷贝标示为部分侧翼DNA序列；iii.位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的所述部分侧翼DNA区域之间的 DSBI酶的识别位点；c.选择包含所述选择标记或筛选标记的植物细胞的群体；d.选择在其中所述选择标记或筛选标记已经借助所述侧翼DNA区域通过同源重组而导入的植物细胞并从所述植物细胞再生植物；e.将包含所述选择标记基因的所述再生植物或其后代植物与包含编码DSBI酶的嵌合基因的植物杂交，所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段iv.小孢子特异性启动子；v.编码可识别位于所述目的DNA内的所述识别位点的双链DNA断裂诱导酶的DNA区域；vi.转录终止和聚腺苷酸化区域；f.选择包含所述选择标记基因或筛选标记基因和编码DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物(Fl植物)；g.将所述的后代植物与另一植物杂交，由此使用所述后代植物作为花粉供体；h.选择包含编码DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物的群体(F2群体)；和i.选择如此的后代植物，在所述后代植物中所述的选择标记基因或筛选标记基因通过在所述侧翼DNA区域之一与包含所述侧翼DNA区域之一的一部分的部分侧翼DNA区域之间的同源重组被缺失。
2.权利要求1所述的方法，其中在所述预先选择位点处的所述第一个双链断裂通过导入第一个DSBI酶诱导，所述的第一个DSBI酶不识别位于所述目的DNA内的DSBI酶的所述识别位点。
3.权利要求2所述的方法，其中所述的第一个DSBI酶和识别位于所述目的DNA内的所述识别位点的所述 DSBI 酶是选自 I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I,Pt-Mtu I,I-Ceu I,I-Sce II,I-Sce III,HO,PI-Civ I,PI-Ctr I,PI-Aae I,PI-BSU I、 PI-DhaI、PI-Dra I、PI-MavI、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I,PI-MkaI,PI-Mle I,PI-Mma I,PI-Msh I,PI-Msm I,PI-Mth I,PI-Mtu I,PI-MxeI,PI-Npu I、 PI-Pfu I、 PI-Rma I、 PI-Spb I、 PI-Ssp I、 PI-Fac I、 PI-MjaI、 PI-Pho I、 PI-Tag I、 PI-Thy I,PI-Tko I或PI-Tsp I或包含Zn指DNA结合结构域和DNA切割结构域的嵌合内切核酸酶的两种不同DSBI酶。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中识别位于所述目的DNA内的DSBI酶的所述识别位点的所述DSBI酶是I-SceI。
5.权利要求4所述的方法，其中编码所述双链DNA断裂诱导酶的所述DNA区域包含SEQ ID No 1或SEQ ID No 2的核苷酸序列。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述小孢子特异性启动子包含选自SEQ ID No 3的核苷酸序列的启动子或其功能性片段。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中编码DSBI的所述嵌合基因包含SEQID No. 6中从核苷酸1941至3913的核苷酸序列。
8.植物细胞，其通过权利要求1至7中任一项所述的方法可得到。
9.用于通过在所述靶序列内或在其附近的预先选择位点处诱导双链断裂而将植物细胞基因组内的靶DNA序列替换成目的DNA序列的DNA载体，所述DNA载体包含 a.位于两个侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，其中所述的侧翼DNA区域与所述靶DNA序列的侧翼DNA区域和所述预先选择位点的侧翼DNA区域具有至少80%序列同源性；b.位于所述侧翼DNA区域之间的选择标记基因或筛选标记基因，所述选择标记基因或筛选标记基因还位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的包含所述侧翼DNA区域之一的一部分的部分侧翼DNA区域之间；和c.位于所述侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的所述部分侧翼DNA区域之间的 DSBI酶的识别位点。
全文摘要
本发明描述用于使用处于小孢子特异性启动子控制下表达切点罕见双链断裂诱导DNA内切核酸酶通过在两个同向重复DNA序列间的染色体内重组而从DNA分子内精确去除所选择亚片段的方法。本方法可以应用于用来将植物细胞和植物内的靶DNA片段精确交换成目的DNA片段的方法内。
文档编号C12N15/63GK102286456SQ201110177668
公开日2011年12月21日 申请日期2006年3月31日 优先权日2005年4月4日
发明者K·达伦, R·鲁伊特 申请人:拜尔生物科学公司