专利名称：一种构建t载体的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是涉及一种构建T载体的方法。
背景技术：
基因克隆技术是现代基因工程研究的一项基本技术，是研究基因结构与功能的前提，利用T载体进行基因克隆是其中一种最简捷、方便的方法。T载体是聚合酶链反应产物的克隆用载体，线性化后两侧3'端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。在利用Taq DNA聚合酶对基因进行PCR扩增时，PCR产物的3'末端会多加上一个脱氧腺苷酸(A)碱基，可与T载体的3'末端突出的T碱基配对，在DNA连接酶的作用下形成闭合环状分子，然后转化入大肠杆菌感受细胞，培养长成克隆菌落。利用菌落PCR和抽提质粒后限制性酶切的方法来初步筛选阳性克隆，最后通过测序来鉴定克隆到的基因片段是否是目的基因片段。PCR产物与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率，因此 T载体在基因克隆方面应用非常广泛。目前T载体售价大多偏高，而且存在连接效率低、连接不稳定等缺陷。因此制备高质量、稳定、价廉的T载体是广大分子生物学研究者关心的问题，也是生物试剂厂商感兴趣的业务之一。目前T载体的构建方法主要是用产生平末端的限制性内切酶(如EcoRV)将质粒DNA切开，利用Taq DNA聚合酶和ddTTP在线性质粒两条链的3 ‘端加T制成T载体，如 Takara的pMD系列T载体和!Iomega的pGEM系列T载体。但该方法存在两方面的缺陷一是线性质粒3'末端在DNA聚合酶作用下加T可能不完全，造成克隆过程中自身环化率高， 假阳性率较高；二是该方法需要经过EcoRV酶切、DNA聚合酶加T、电泳凝胶回收DNA片段等多个步骤，需要进行质量控制的环节较多，影响T载体克隆效率的因素也很多，T载体质量较低。同时由于T载体的生产过程繁琐，成本较高，最终导致商业化T载体的价格较高。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种简便高效构建T载体的方法，利用该方法可获得高质量、高稳定性的T载体，其克隆效率和正确率高。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种构建T载体的方法，包括步骤1、将两端含有特异限制性内切酶识别序列的抗性基因定向克隆到出发载体的两个多克隆位点之间，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体；步骤2、用步骤1所述特异限制性内切酶识别序列对应的特异限制性内切酶消化步骤1所得T载体前体，回收大片段，得到T载体；其中，所述特异限制性内切酶为其识别序列被酶切后突出末端位点可以是T的限制性内切酶，步骤1所述抗性基因与出发载体所含抗性基因不同。本发明所述构建T载体的方法是利用限制性酶切法原理，将两端含有特异限制性内切酶识别序列的抗性基因定向克隆到出发载体上，在出发载体质粒的多克隆位点引入酶切后突出末端位点可以是T的限制性内切酶酶切位点和与出发载体所含抗性基因不同的抗性基因的片段，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体，然后用特异限制性内切酶识别序列对应的特异限制性内切酶酶切消化产生3'端具有单个突出T的线性T载体。由限制性内切酶酶切产生的T载体具有酶切产量高、质量稳定、易于操作等特点， 然而由于定向克隆到出发载体中经常会发生出发载体环化现象，造成假阳性。为了提高克隆效率，减少假阳性，需要把阳性克隆从部分假阳性中分离出来。本发明在构建T载体前体质粒时引入与出发载体所含抗性基因不同的抗性基因进行筛选，以便能很容易区分阳性克隆，方法简便高效，可操作性高。优选的，本发明所述构建T载体的方法，步骤1具体包括步骤la、以含有抗性基因的载体为模板，利用上游引物和下游引物扩增抗性基因片段，回收抗性基因片段备用，其中，所述上游引物和下游引物均含有一个特异限制性内切酶识别序列和一个出发载体中具有的限制性内切酶的识别序列，限制性内切酶的识别序列位于特异限制性内切酶识别序列的5'端，且上游引物和下游引物含有的限制性内切酶的识别序列不同；步骤lb、分别利用识别步骤Ia所述限制性内切酶识别序列的限制性内切酶消化出发载体和步骤Ia所得抗性基因片段；步骤Ic 回收线性化出发载体和消化后抗性基因片段，混合，在T4 DNA连接酶作用下连接，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体。优选的，所述特异限制性内切酶为AhdI、BmrI、HPyAV、MnlI、BciVI、HphI、MboII、 XcmI、Bst4CI、TaaI、Tsp4CI、AspEI、BmeRI、Hpy 1881 或 HpyCH4III，这类酶的识别序列被酶切后突出末端位点可以是T。在一个实施方案中，所述特异限制性内切酶为Ahdl，即扩增抗性基因片段的上、下游引物均含有AhdI识别序列。AhdI的识别序列为GACNNTNNGTC，N为A， C，T，G中任一种碱基，该识别序列被酶消化后3'端留下的末端突出的T碱基。AhdI的识别序列GACNNTNNGTC也可被任一种具有相似酶切特点的限制性内切酶的识别位点所替代， 如Bst4CI的识别序列ACTGT，Bst4CI酶消化DNA后会在3 ‘端留下一个末端突出的T碱基。本发明所述构建T载体的方法所述出发载体可以为本领域技术人员熟知的任意一种基因工程所用的克隆载体。克隆载体是指可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子，该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记， 常用于外源基因的克隆，如PUC系列、pMD系列、pGEM-T Easy Vector、pBS_T、pSURE-T等。 在具体实施方式
中，所述出发载体为pUC-19，在一些实施例中，pUC-19载体也可为其他载体如pUC-18所代替，所选用限制性酶位点也应根据所选载体多克隆位点做相应变化。抗性基因可赋予宿主细胞对某些物质的抗性，直接用于选择转化子。本发明所述构建T载体的方法所述抗性基因可以为本领域技术人员熟知的任意一种抗性基因。抗性基因可以为抗生素抗性基因、重金属抗性基因或代谢抗性基因，其中，以抗生素抗性基因使用最广泛。因此，本发明所述抗性基因优选为抗生素抗性基因。抗生素抗性基因常常赋予宿主细胞对抗生素产生抗性，而抗生素往往对宿主细胞是致死的。抗生素抗性基因包括氨苄青霉素抗性基因(Apr)、四环素抗性基因(Tcr)、氯霉素抗性基因(Cmr)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、G418抗性基因(G418r)、潮霉素抗性基因 (Hygr)、新霉素抗性基因(Neor)。在具体实施方式
中，所述抗性基因为具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的卡那霉素抗性基因，在一些实施例中，卡那霉素抗性基因也可为其他抗性基因如氯霉素抗性基因所代替，但该抗性基因应与所选出发载体如PUC-19所含抗性基因不同。在一些实施例中，卡那霉素抗性基因也可为其他具有可筛选特点的基因片段所代替， 如铜抗性基因(Cur)，胸苷激酶基因(TK)。
作为优选，步骤Ia所述含有卡那霉素抗性基因的载体为pEGFP-Cl载体。为了将两端含有特异限制性内切酶识别序列的抗性基因定向克隆到出发载体中， 扩增抗性基因片段的上游引物和下游引物末端还分别含有一个出发载体中具有的限制性内切酶的识别序列。为了防止出发载体自身环化上游引物和下游引物中含有的限制性内切酶的识别序列不同。其中，步骤Ia所述上游引物和下游引物末端含有的限制性内切酶的识别序列可以为所用出发载体中满足定向克隆条件的任一对多克隆位点。在具体实施方式
中，本发明步骤Ia所述上游引物含有的限制性内切酶识别序列为BamHI的识别序列，下游引物含有的限制性内切酶识别序列为HindIII的识别序列。在一些实施方式中，BamHI 和HindIII的识别序列也可为其他满足定向克隆条件的限制性酶位点所替代，如EcoRI和 SalI ο作为优选，在步骤Ia所述限制性内切酶的识别序列5'端还分别含有1 6个碱基的保护序列，以提高酶切活性。所选用的保护序列的碱基数目和种类应根据所选限制性内切酶做相应变化。作为优选，步骤Ia所述上游引物为SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，步骤Ia所述下游引物为SEQ ID NO 3所示核苷酸序列。本发明还提供了上述制备方法制备的T载体。在具体实施例中，本发明所述T载体如图5所示。本发明所述构建T载体的方法简单高效，在制备过程中利用引入的抗性基因片段来控制T载体的质量。与常规方法相比，操作步骤和控制环节明显减少，生产效率和T载体的质量和稳定性明显提高。利用此方法所获得的T载体不仅保留有出发载体的优点，而且还具有质量稳定、自身环化率低、克隆效果高等特点。
图1示实施例1用含AhdI识别序列的上、下游引物对以pEGFP-Cl质粒为模板经 PCR扩增得到的产物的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为PCR扩增得到的SOObp左右大小的目的条带，泳道2为回收后的PCR产物，泳道3为PCR产物经BamHI和HindIII双酶切电泳回收后的片段，泳道M为DL2000DNA分子量标志物(购自Takara公司)；图2示实施例2筛选得到的阳性T载体前体克隆经BamHI和HindIII双酶切鉴定的凝胶电泳结果。泳道M为DL2000DNA分子量标志物，泳道1，2，3分别为挑选的三个阳性 T载体前体克隆酶切结果，均有一条2000bp和SOObp大小的目的条带，2000bp大小的片段为出发载体PUC-19质粒，而800bp对应的是扩增得到的PCR产物kanar基因片段；图3示实施例3本发明所述构建T载体的方法构建的T载体与IlOObp大小的PCR 产物片段连接后转化，随机挑选的6个克隆进行菌落PCR鉴定，所获产物的1 %琼脂糖凝胶
5电泳图，泳道M为DL2000 DNA分子量标志物，泳道1 6为随机挑选的6个克隆的菌落PCR产物。图4示实施例4随机挑选的6个克隆中含有目的片段的单菌落的质粒用BamHI、 HindIII双酶切，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为DL-2000DNA分子量标志物， 泳道1 6为随机挑选的6个克隆的双酶切鉴定结果。图5示实施例3本发明所述构建T载体的方法构建的pVC-T载体的图谱。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种构建T载体的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种构建T载体的方法，包括步骤1 用具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的下游引物以PEGFP-Cl载体为模板扩增卡那霉素抗性基因片段，利用PCR回收试剂盒回收纯化卡那霉素抗性基因片段；步骤2 分别利用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对卡那霉素抗性基因片段和pUC-19质粒进行消化，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；步骤3 将回收的卡那霉素抗性基因片段和pUC-19质粒以适当比例(摩尔比为 1 幻混合，在T4DNA连接酶作用下连接成闭合环状分子，然后转化入大肠杆菌DH5ci感受态细胞，利用卡那霉素筛选得到阳性克隆，即为T载体前体质粒；步骤4 =T载体前体质粒经限制性内切酶AhdI消化，回收大片段，即为T载体。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种构建T载体的方法进行详细说明。实施例1 含AhdI位点的抗性基因片段的扩增以pEGFP-Cl质粒为模板，用具有SEQ ID No :2所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No :3所示核苷酸序列的的下游引物，进行PCR扩增，得到含AhdI位点的卡那霉素抗性基因片段。PCR扩增反应体系为
10 Xtaq buffer(with 1. 5mM Mg2,2 ド L
pEGFP-Cl 质粒(IOng/ドL )I^iL
IOpM上游引物IpL
IOpM下游引物IpL
Premix Taq(Takara, 5U/(iL)0.5(iL 加入灭菌蒸馏水补足体系总量20 μ L0
PCR反应程序为
权利要求
1.一种构建T载体的方法，其特征在于，包括步骤1、将两端含有特异限制性内切酶识别序列的抗性基因定向克隆到出发载体的两个多克隆位点之间，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体；步骤2、用步骤1所述特异限制性内切酶识别序列对应的特异限制性内切酶消化步骤1 所得T载体前体，回收大片段，得到T载体；其中，所述特异限制性内切酶为其识别序列被酶切后突出末端位点可以是T的限制性内切酶，步骤1所述抗性基因与出发载体所含抗性基因不同。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1具体包括步骤la、以含有抗性基因的载体为模板，利用上游引物和下游引物扩增抗性基因片段， 回收抗性基因片段备用，其中，所述上游引物和下游引物均含有一个特异限制性内切酶识别序列和一个出发载体中具有的限制性内切酶的识别序列，限制性内切酶的识别序列位于特异限制性内切酶识别序列的5'端，且上游引物和下游引物含有的限制性内切酶的识别序列不同；步骤lb、分别利用识别步骤Ia所述限制性内切酶识别序列的限制性内切酶消化出发载体和步骤Ia所得抗性基因片段；步骤Ic 回收线性化消化后出发载体和抗性基因片段，混合，在T4 DNA连接酶作用下连接，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述特异限制性内切酶为Ahdl、 BmrI、HPyAV,MnlI、BciVI、HphI、MboII、XcmI、Bst4CI、TaaI、Tsp4CI、AspEI、BmeRI、Hpy1881 或 HpyCH4III。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述出发载体为PUC18或pUC19。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗性基因为具有SEQID N0:1所示核苷酸序列的卡那霉素抗性基因。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤Ia所述含有抗性基因的载体为 pEGFP-Cl 载体。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤Ia所述上游引物含有的限制性内切酶识别序列为BamHI的识别序列，下游引物含有的限制性内切酶识别序列为HindIII的识别序列。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，在步骤Ia所述限制性内切酶的识别序列 5'端还分别含有1 6个碱基的保护序列。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤Ia所述上游引物为SEQID N0:2所示核苷酸序列，步骤Ia所述下游引物为SEQ ID NO :3所示核苷酸序列。
10.权利要求1 9任意一项所述方法制备的T载体。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种构建T载体的方法，为将两端含有特异限制性内切酶识别序列的抗性基因定向克隆到出发载体的两个多克隆位点之间，用上述抗性基因对应的抗生素筛选阳性克隆，得到T载体前体；然后用所述特异限制性内切酶消化所得T载体前体，回收大片段，得到T载体；其中，所述特异限制性内切酶为其识别序列被酶切后突出末端位点可以是T的限制性内切酶，所述抗性基因与出发载体所含抗性基因不同。本发明所述构建T载体的方法简单高效，在制备过程中利用引入的抗性基因片段来控制T载体的质量。利用此方法所获得的T载体不仅保留有出发载体的优点，而且还具有质量稳定、自身环化率低、克隆效果高等特点。
文档编号C12N15/66GK102286515SQ201110177458
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者周江宁, 方辉, 赵君 申请人:中国科学技术大学