专利名称：鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，特别涉及鸭瘟病毒抗体的试剂盒及检测方法。
背景技术：
鸭瘟(Duck Plague, DP)是由疱疹病毒科中的鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV) 引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、热性、接触性传染的败血性传染病。该病可导致商品水禽产蛋量下降及死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的临床表现为精神沉郁，高热稽留，两腿麻痹、下痢、流泪，部分病鸭头颈肿大，是一种广泛嗜全身性感染的传染病，临床以急性败血症过程为特征；病理剖解特征是血管损伤，组织器官出血，消化道出血、炎症和坏死，消化道粘膜某些特定部位有疹状损害，淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化，其发病率和死亡率都甚高。近年来，随着养鸭业生产向集约化、规模化的方向发展，鸭瘟作为威胁养鸭业最严重的接触性传染病之一，造成了巨大的经济损失。过去对鸭瘟病毒血清抗体的检测方法主要是利用全病毒作为抗原进行检测，但传统的病毒分离鉴定方法大约需要4 5天，方法繁琐，费时费力，且纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，导致假阳性结果出现。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种鸭瘟病毒gG截段重组蛋白，该蛋白能作为鸭瘟病毒抗体的捕获剂。为实现上述方案，本发明的技术方案为
鸭瘟病毒gG截段重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。所述的鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。本发明的目的之二在于提供鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的制备方法，该方法可用于鸭瘟病毒gG截段重组蛋白大规模生产。为实现上述目的，本发明的技术方案为
所述的鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的制备方法，具体包括以下步骤
A、以DPV基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物PCR扩增得鸭瘟病毒gG截段基因片段，与pMDIS-T的连接，得pMD18_gGM;
B、限制性内切酶BamHI和Bio I分别双酶切pMD18_gGM质粒和原核表达载体 pET32a(+),并连接，得重组原核表达质粒pET3h-gGM;
C、并将上述提取的重组质粒pET3h-gGM转化到表达宿主菌诱导表达，得鸭瘟病毒gG 截段重组蛋白粗品。进一步，将步骤C所得鸭瘟病毒gG截段重组蛋白粗品经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后，得鸭瘟病毒gG截段重组蛋白；
进一步，步骤C中的宿主菌为菌株BL21 (DE3)，在IPTG浓度彡0. 2mmol/L,诱导温度为 30 0C条件下进行诱导表达2小时，得鸭瘟病毒gG截段重组蛋白。
本发明的有益效果在于鸭瘟病毒gG截段重组蛋白是选取鸭瘟病毒(DPV)gG基因编码蛋白的主要抗原域(68aa-377aa)，并命名为gGM;然后利用基因工程技术，将其进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌BL21(DE!3)表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是gGM/His融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为50kDa，将产品设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。经原核表达系统表达后的产品经Western blot进行鉴定后表面具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。采用本发明的方法生产的产品可用于
①本产品可作为检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法的检测抗原。②可作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。本发明的产品优点体现在
①由于该检测抗原是鸭瘟病毒gG截段重组蛋白，并非全病毒，以此应用该检测抗原进行检测时无散毒危险。②作为ELISA抗原检测鸭瘟病毒抗体，特异性强，无交叉反应。③性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。更多有益效果，将在实施例中体现。
图1为gG截段基因的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；其中1为gG截段基因PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带，M为DNA Marker.图2为重组质粒pMD18-gGM的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为DNA Marker, 1为重组质粒pMD18-gGM用BamH I和Bio I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。图3为pET3h_gGM的酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为DNA Marker, 1为重组表达质粒pET3h-gGM用B10 I单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的一条特异性条带，2为重组表达质粒pET3h-gGM用BamH I和)(h0 I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。图4为重组表达质粒pET3h-gGM表达的鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的SDS-PAGE 电泳图；其中M为蛋白质Marker，1为重组表达质粒pET3h_gGM用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果，2为重组表达质粒pET3h-gGM 用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果，3 为重组表达质粒pET3h-gGM未用IPTG诱导，经SDS-PAGE电泳所得结果，4为重组表达质粒 pET3^i-gGM用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果，5为空载体pET_32a(+)未用IPTG 诱导，经SDS-PAGE电泳所得结果，6为空载体pET-32a(+)用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果。图5为不同IPTG浓度下含有重组质粒pET3h-gGM的宿主菌E. coli BL21 (DE3) 表达鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质Marker，1为IPTG的终浓度为1. 2 mmol/L，2为IPTG的终浓度为1. 0 mmol/L，3为IPTG的终浓度为0. 8 mmol/ L，4为IPTG的终浓度为0. 5 mmol/L, 5为IPTG的终浓度为0. 2 mmol/L, 6为IPTG的终浓度为 0mmol/Lo图6为不同温度下含有重组质粒pET3h_gGM的宿主菌E. coli BL21 (DE3)表达鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质Marker，1为诱导温度为 25°C，2为诱导温度为30°C，3为诱导温度为37°C。图7为不同诱导时间下含有重组质粒pET3h-gGM的宿主菌Ε. coli BL21 (DE3)表达鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1为诱导12h， 2为诱导6h，3为诱导5h，4为诱导4h，5为诱导3h，6为诱导2h，7为诱导Oh。图8为镍琼脂糖凝胶(Ni2+-NAT)亲和层析纯化后的鸭瘟病毒gG截段重组蛋白 SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，l为经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后的gG截段重组蛋白。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。部分氨基酸相应的缩写如下
谷酰胺gin Q;甘氨酸gly G ；丝氨酸ser S ；丙氨酸ala A ；苏氨酸thr T ；缬氨酸 val V ；异亮氨酸ile I ；亮氨酸leu L ；酪氨酸tyr Y ；苯丙氨酸phe F ；组氨酸his H ；脯氨酸pro P ；天冬酰胺asn N ；甲硫氨酸met M ；谷氨酸glu E ；色氨酸trp W ；赖氨酸Iys K;半胱氨酸cys C;精氨酸arg R;天冬氨酸Asp D。
实施例1鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的制备一材料准备 1菌株、质粒和毒株
质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET3h (+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。羊抗鸭IgG-HRP (辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)和四甲基联苯胺(TMB)均购自美国KPL公司，羊抗鸭IgG-HRP的为冻干剂，分装为0. Img/瓶，使用时按说明书溶解为lmL。2试验动物
10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性。3实验方法
3. 1 DPV gG基因的克隆 3. 1.1引物设计
根据gG基因编码的氨基酸序列主要抗原域(68aa-377aa并命名为gGM)，利用 Primer Premier5. O软件设计一对引物。如SEQ ID N0:3所示的上游引物5，-RRatcccacacaRRacRatatRaR _3’(划线部分为 BamH I 位点)；如 SEQ ID N0:4所示的下游引物5，- CtCRaRatRaRRRtRattRtRRtaR _3，(划线部分为Β ο I位点)。引物合成后， 以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，_20°C保存备用。
3. 1. 2 DPV基因组DNA的提取
a、正常鸭胚成纤维细胞(DEF)的制作方法取IOd日龄健康鸭胚，分别用体积分数为 5%碘酒和体积分数为75%酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成Imm3大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(体积分数为2. 5%胰蛋白酶)150 μ L/胚，于37°C水浴中消化;3min。立即将细胞悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用6层纱布过滤，向滤液中加入体积分数为10%小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于 IOOmL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37°C细胞培养箱中进行培养。b、DPV增殖取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2-3mL覆盖细胞表面进行吸附，37°C吸附Ih后弃病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37°C培养。同时做未接毒的DEF 对照。c、DNA提取方法直接从感染的DEF中提取DPV基因组DNA，具体步骤如下(1) 选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达80%的DEF ；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500 μ L的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200 μ g/mL,轻轻混勻后，37°C孵育10分钟；(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用 500 μ L的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/L NaAC,混勻后，加入2倍体积冷无水乙醇，_20°C放置30-60分钟；(6) 13000r/分钟离心20分钟，沉淀用预冷的体积分数为70%的乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入IyL RNA酶，37°C 作用30分钟，-20°C保存备用。
权利要求
1.鸭瘟病毒gG截段重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID N0:1所示。
2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gG截段重组蛋白，其特征在于其DNA序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.权利要求1所述的鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的制备方法，其特征在于A、以DPV基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物PCR扩增得鸭瘟病毒gG截段基因片段，与pMDIS-T的连接，得pMD18_gGM;B、限制性内切酶BamHI和Bio I分别双酶切pMD18-gGM质粒和原核表达载体 pET32a(+),并连接，得重组原核表达质粒pET3h-gGM;C、并将上述提取的重组质粒pET3h-gGM转化到表达宿主菌诱导表达，得鸭瘟病毒gG 截段重组蛋白粗品。
4.根据权利要求3所述的鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的制备方法，其特征在于将步骤 C所得鸭瘟病毒gG截段重组蛋白粗品经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后，得鸭瘟病毒gG截段重组蛋白。
5.根据权利要求3所述的鸭瘟病毒gG截段重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤C 中的宿主菌为菌株BL21(DE3)，在IPTG浓度彡0. 2mmol/L,诱导温度为30°C条件下进行诱导表达2小时，得鸭瘟病毒gG截段重组蛋白。
全文摘要
本发明涉及生物工程领域，特别涉及鸭瘟病毒gG截段重组蛋白及其制备方法,其氨基酸序列如SEQIDNO1所示，核苷酸序列如SEQIDNO2所示;然后利用基因工程技术，将其核苷酸序列进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌BL21(DE3)表达系统进行诱导、表达的基因工程产品;该蛋白的表达形式是gGM/His融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为50kDa，将产品设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性;经原核表达系统表达后的产品经Westernblot进行鉴定后表面具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。
文档编号C12N15/70GK102250224SQ201110177128
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者杨晓圆, 汪铭书, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心