专利名称：小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用。
背景技术：
土壤盐渍化和干旱是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子， 是制约农业生产和发展的全球性问题，盐害与干旱不仅严重影响植物的生长发育，造成作物减产，而且使生态环境日益恶化。盐渍土可引起植物生理干旱，为害植物组织，影响植物正常营养吸收，阻碍植物正常生长。土壤盐渍化是影响植株生长发育较为严重的环境胁迫之一。植株在摄取了过量的Na等离子后，细胞内离子浓度增高，破坏离子平衡，造成矿物元素的毒害效应，还会导致酶活性丧失，进而导致植株体内正常的代谢过程及生理功能受到不同程度的损坏。因此，了解植株的耐盐机理，研究盐胁迫下植株的生理生化变化，提高作物的抗旱和/或耐盐能力已经成为现代作物育种工作中亟待解决的关键问题之一。随着对植物抗旱、耐盐的基础分子生物学研究的不断深入和对抗性基因的不断发现和挖掘，利用转基因手段分离克隆耐盐基因，培育耐盐新品种来获得抗干旱耐盐渍的转基因植物，已经成为当今植物生物技术领域研究的热点之一。目前利用基因工程技术开展植物耐盐、抗旱方面的研究已取得了较大的进展。研究表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力提高。在植物逆境胁迫的信号转到通路中，转录因子起到中心调控的作用。目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的转录因子。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显提高植物的耐盐能力。MYB是一类在植物生长发育和胁迫应答中发挥重要作用的转录因子家族。广泛参与植物细胞周期的调控、形态建成、次级代谢及胁迫响应等过程。水稻0sMYB3R-2在拟南芥中的异位表达也能够提高转基因株系对冷、旱及盐胁迫的抗性。AtMYB44过表达拟南芥对 ABA敏感性增加，ABA诱导气孔关闭更迅速，进而使得植株抗旱性提高。AtMYB96通过整合 ABA和生长素信号通路来调控旱胁迫响应。但有关小麦MYB转录因子在耐盐方面的研究报道的还很少。小麦是重要的农作物，克隆耐盐、抗旱基因，培育耐盐、抗旱小麦新品种已成为当前一个十分迫切的任务。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明首先根据小麦的表达谱芯片数据选出在小麦幼苗根中显著受盐诱导表达的MYB转录因子基因(探针)，然后根据探针序列设计基因特异性引物，从小麦全长cDNA文库中克隆TaMYB转录因子全长cDNA，在拟南芥中进行功能验证。本发明提供了一种小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用。本发明小麦的耐盐、抗旱基因，名称为TaMYB33，其cDNA是序列表中SEQ ID No. 1的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No. 1由7 个碱基组成。以上所说的小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33的编码蛋白，是下述氨基酸序列之一
(1)序列表中SEQID No. 2序列；
(2)将序列表中的SEQID No. 2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控耐盐、抗旱复苏能力的蛋白质。以上所说的小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33的编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID No. 2由242个氨基酸残基组成。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系、转基因植株也在本发明的保护范围之内。扩增TaMYB33中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围还包括基因TaMYB33在培育耐盐、抗旱植物中的应用，该植物为小麦或拟南芥。提高含有小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，是将小麦基因 TaMYB33导入宿主植物的细胞、组织或植株个体，得到具有耐盐、抗旱性能的植株。提高含有小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33通过含有小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33的植物表达载体 pCAMBIA-superl300/TaMYB33导入细胞、植物组织或植物个体，用于构建植物表达载体的出发载体为 pCAMBIA-superl300。以上所说的植物宿主为小麦或拟南芥。MYB家族在结构上具有由1到3个MYB重复单元组成的MYB结构域，每个MYB重复通常包含50 53个氨基酸，在每个重复的内部又会形成螺旋一转角一螺旋的结构，参与对靶序列的识别。根据MYB结构域所含MYB重复的数量，MYB家族转录因子被分为3种类型，即包含3个MYB重复的3R。MYB、包含2个MYB重复的R2R3—MYB和MYB—related类型，其中，R2R3—MTO是植物中存在最广泛的类型。研究表明，MTO家族转录因子在植物抗逆性方面具有重要作用。AtMYB2、AtMYB41、AtMYB44和AtMYB102是在拟南芥中克隆的4个与抗逆相关的MYB转录因子。AtMYB2是一个受干旱诱导表达的基因，当植物处于缺水的生长条件时，它会作为转录激活因子调节一些受乙烯诱导表达基因的转录，以此来响应生长环境的变化。AtMYB41在正常的生长条件下是不表达的，但经干旱、ABA及盐胁迫诱导后， 则高水平表达，它通过参与调控表皮的合成及细胞增殖来响应各种逆境胁迫。AtMYB44通过依赖于ABA的信号传导网络，参与植物的非生物胁迫响应过程，过表达AtMYB44可以促使植株气孔关闭，从而增加对非生物胁迫的抗性。AtMYB102是一个参与植物渗透胁迫响应的基因，其表达受渗透胁迫及ABA的诱导。水稻0smyb4基因在拟南芥中过量表达后能增强转基因植株对低温和冻害的抗性 1卅；水稻0sMYB3R—2基因在拟南芥中过量表达后能增强转基因植株对冻害、高盐和干旱的抗性，TaMYBl是在小麦中克隆的一个R2R3—MTO类型的转录因子，该基因的表达与根中氧的浓度相关，同时又受盐、PEG和ABA的诱导。本发明的有益效果在于，首次克隆得到了小麦MYB转录因子基因TaMYB33，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，与野生型拟南芥植株相比，含有本发明的TaMYB33基因的转基因拟南芥植株的耐盐、抗旱能力明显提高。
图1为TaMYB33基因全长cDNA序列的扩增结果，M =DNA分子量marker，下同； 图2 NaCl、PEG和ABA处理后TaMYB33基因在小麦山融3号幼苗根和叶中的RT-PCR
分析，Actin为内参；leaf 叶；root 根；
A :200mM NaCl 处理；B 15% PEG 处理；C :100 μ M ABA 处理； 图3构建的植物表达载体pCAMBIA-superl300/TaMYB33的酶切验证结果； 图4转基因拟南芥的PCR鉴定。Tl、T2、T5、T6 :TaMYB33转基因拟南芥株系，WT野生型拟南芥植株；
图5转基因拟南芥株系的表型鉴定；
图5中A 野生型拟南芥和转TaMYB33基因的转基因拟南芥株系幼苗在50mM NaCl处理下的表型；
图5中B 野生型拟南芥和转TaMYB33基因的转基因拟南芥株系干旱15天后的表型； 图5中C 野生型拟南芥和转TaMYB33基因的转基因拟南芥株系干旱20天、复水3天后的表型；
图5中WT 野生型拟南芥株系；T1、T2、T5、T6 转化pCAMBIA_superl300/TaMYB33的拟
南芥株系。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。以下实施例中如无特别说明均为常规方法。实施例1 TaMYB33基因cDNA序列的克隆 TaMYB33基因全长cDNA序列的克隆和序列测定 1.引物序列
根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物，与文库的5'端锚定引物进行配对，以小麦幼苗全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA，引物序列为Myb3 ‘ 5' -CGAACGATTATTGTTCCCTTCAC-3‘ ，NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3，。2. PCR 反应体系(50 μ L)
2XGC buffer I10 μ 1模板cDNA文库1 μ 1dNTPs (2. 5mM each)0. 5μ 1Primerl (10 μ Μ)1 μ 1Primer2(10yM)1 μ 1LA Taq(TaKaRa)0. 5μ 1(MH2O加至终体积50
3. PCR反应程序为94°C预变性:3min;94°C变性45sec，58°C复性lmin，72°C延伸 2min，循环 35 次；72°C 延伸 5min。
4. 琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测后发现在750bp处有一条目的条带如附图1 所示。5.扩增片段的回收、与T载体的链接
对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行，PCR产物与 pGEM-T (ftOmega)载体连接，连接体系为 回收的PCR产物7μ1
10 X Τ4连接酶缓冲液 μ
pGEM-T 载体(50ng/ μ 1) μ
T4DNA 连接酶(3U/ μ 1) (Takara) μ ClH2O至10μ1于16 °C水浴连接过夜。6.回收片段的克隆与测序 (1)大肠杆菌感受态细胞的制备
①从-80°C冰箱中拿出保存于甘油中的E.coli Dffia菌株(购自天为时代生物公司)，放在冰上缓慢解冻；
②在超净工作台上用接种环划线(LB固体培养基，不含Amp)；
③将平板于37°C恒温培养箱倒置培养过夜；
④挑取平板上的单菌落接种于含5mlLB液体培养基的试管中，37°C振荡培养14 16 小时；
⑤取0.5ml菌液接种于含50mlLB液体培养基的250ml的三角瓶中，37 °C振荡 (260rpm)培养 2 3 小时(OD260=O. 5)；
⑥将培养的菌液置冰上1小时；
⑦4°C离心4分钟(4000rpm)，去上清；
⑧用25ml冰预冷的溶液A将菌体轻轻悬浮起来，再在冰上放置40 45分钟；
⑨重复步骤⑧；
⑩用2.5ml冰预冷的溶液B将菌体轻轻悬浮起来，然后将菌液分装到1. 5ml离心管中 (每管ΙΟΟμΙ)，放入_80°C冰箱备用。(2)连接产物的转化
①从-80°C的冰箱中取出1管αοομ )感受态细胞，置冰上缓缓解冻30分钟；
②超净工作台上向管中加入5μ1连接反应物，轻轻摇勻，置冰上30分钟；
③42°C水浴热激90秒，迅速置冰上3 5分钟；
④在超净工作台上向离心管中加入ImlLB液体培养基(不含Amp)，混勻后37°C振荡培养 1 小时(260rpm)；
⑤室温下5000rpm离心6分钟，弃掉900μ1上清液，将剩余ΙΟΟμΙ上清液重新悬浮菌体，加入40μ1的X-gal和4μ1的IPTG，混勻，然后用涂布器将其均勻涂到准备的平板上，放置30分钟；
⑥倒置平板于37°C恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出；
⑦放入4°C冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明；
⑧用灭菌的牙签挑取白斑于装有10mlLB液体培养基(含6(^g/mlAmp)的试管中，37°C 摇菌过夜。
(3 )重组质粒的PCR鉴定及测序
本实验所用的PGEM-T载体的克隆位点的上游有T7启动子，下游有SP6启动子，所以可以用这两个启动子序列做引物对插入片段进行扩增，对重组质粒进行鉴定；
①PCR程序:94°C预变性IOmin；94°C变性lmin，58°C复性lmin，72°C延伸lmin，循环 35 次；72°C延伸 5min ；
②PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序，测序结果见 SEQ ID No. 1。实施例2
NaCl、PEG、ABA处理条件下TaMYB33转录因子基因的表达分析 1.材料处理
小麦材料山融3号的种子正常萌发，1周后去掉胚乳，在Hangload培养液继续培养1周后进行胁迫处理。盐胁迫为在液体培养基中施加50mM NaCl，干旱胁迫为施加15%的PEG， ABA处理为施加100 μ M ΑΒΑ，处理后0、3、12、24，48小时取幼嫩的叶片和根系，提取小麦总 RNA。2. Trizol 法提取小麦 iTotal RNA
(1)将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2)待液氮挥发干，立即转移到aiil的离心管中，每IOOmg材料约加入Iml的 Invitrogen公司的TRIzol提取液，剧烈振荡混勻样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；
(3)加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混勻15秒，室温放置10分钟；
(4)4°C, 12000rpm 离心 15 分钟；
(5)用移液器吸出上层水相，加入到1.5ml的新离心管中，再在该离心管中加入500μ1 的异丙醇，上层水相与异丙醇的体积比为1:1，将两者充分混勻，在_20°C下，沉淀30min ；
(6)在4°C，12000rpm的转速下离心lOmin，弃去上清液；
(7)用Iml的75%乙醇洗涤RNA沉淀，在4°C，8000rpm的转速下离心lOmin，收集沉淀；
(8)重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；
(9)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10 15分钟，RNA略显透明，加入30 50 μ 1的RNase-free水充分溶解(可放于-80°C长期保存)；
(10)用紫外分光光度法及l%Agr0Se凝胶电泳检测RNA浓度及质量
a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，10D=40ug/ml。根据在 260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值在2. O 士0. 1左右。b)用l%Agr0Se凝胶电泳检侧RNA的质量及大小，吸取Iul RNA加入3 μ 1的 RNase-free水，加1 μ 1上样缓冲液6 5°C变性5分钟，电泳后用EB染色，另取3 μ 1的21Λ DNAMarker作为对照。3.第一链cDNA的合成
采用PrimekriptTM RT-PCR Kit进行，反应步骤如下 (1)在Microtube管中配制下列混合液
dNTP Mixture (10 mM) Oligo dT Primer (2. 5 μ Μ) Total RNA
1 μ 1 1 μ 1 4μ 1RNase free H2O4 μ 1
(2)在PCR仪上进行变性、退火反应温度时间
65 °C 5 min 4 0C1 min
(3)离心至RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部
(4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液
上述变性、退火后反应液10μ 15 X PrimerScript Buffer4μ 1RNase Inhibitor (40U/μ 1)0.,5 μPrimScript RTase0.5 μRnase Free ddH 05 μ
(5)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应 42 0C15 30 min
95 0C5 min
4 0C
4. PCR反应及电泳
(1)以cDNA为模板，进行PCR反应，引物如下 TaAct-S 5’ - GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3’ TaAct-A: 5’ - GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3’ MybRt1 5' -GTCGTCCGCCACAGATTACTC-3’ Myb3' 5' -CGAACGATTATTGTTCCCTTCAC-3‘
(2)PCR体系
(MH2O4. 7 μ 1
IOX buffer2μ 1
Primerl (2 μ Μ)1 μ 1
Primer2 (2 μ Μ)1 μ 1
dNTP (IOmM each)0. 2 μ 1
rTaq polymerase (5U/μ 1)0. 1 μ 1
逆转录cDNA模板1 μ 1
Total Volume10 μ 1
(3)PCR程序
94°C 5min ;25 30 cycles, 94°C 20s ； 57°C 60s, 72°C 45s ；72°C 5min。根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。(4) 1%琼脂糖凝胶电泳，结果见附图2。实施例3启动子植物表达载体的构建
植物表达载体pCAMBIA-superl300是含有CaMV35S启动子和NPT II基因的双元载体， 在其多克隆位点上含有限制性内切酶)(bal和KpnI位点。根据基因TaMYB33的cDNA序列，设计包含完整ORF的基因特异性引物，引物序列为Mybo5: 5 ‘ -GCTCTAGAATGGGGAGGTCTCCTTGCTGC-3‘ (XbaI), Mybo35‘ -GGGGTACCCTAAATCTGAGACAAACTCTG-3 (KpnI)，用该对引物扩增TaMYB33的cDNA序列，然后分别用限制性内切酶)(bal和KpnI双酶切载体 pCAMBIA-SUper1300和目的基因片断。完全酶切的载体在1%琼脂糖凝胶上电泳分离后， 经胶回收，然后与双酶切的cDNA片段连结，构建获得植物表达载体pCAMBIA-superl300/ TaMYB330 (1)质粒pCAMBIA_superl300空载体和目的基因片断XbaI和KpnI双酶切
酶切体系如下
XbaI1 μ 1
KpnI1 μ 1 pCAMBIA-superl300 载体
(或目的基因片段)5μ1
IOXBuffer M1 μ 1
ddH20 To20 μ 1
于37°C恒温水浴锅酶切3小时以上；
(2)酶切产物的电泳与回收
双酶切完成后，以IXTAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pCAMBIA-SUper1300中载体的大片段和目的基因片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
(3)连接
经酶切的pCAMBIA-SUper1300载体片段和目的基因片段以摩尔比1:4的比例进行 16°C连接过夜；
(4)转化
连接产物热激法转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，转化菌在含Kan 50 μ g/ml的LB固体平板上37°C培养16小时左右；
(5)重组子的鉴定
质粒酶切鉴定，提取阳性克隆质粒，对质粒进行)(bal和KpnI双酶切，酶切体系同实施例3中的(1)步骤，酶切产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳后，检测到已切开的合适大小的目的基因条带和载体条带，证明载体构建正确，如附图3所示。实施例4 农杆菌感受态的制备与转化 1.农杆菌GV3101感受态的制备
①从YEP平板(含50μ g/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50 μ g/ml 利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min, 下培养过夜；
②取anl过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD6tltl达0. 5 ；
③菌液冰浴30min，在4°C，于5000rpm的转速下离心lOmin，收集菌体；
④将菌体重悬于冰浴的IOml0. 15mol/L的NaCl中，离心收集菌体；
⑤再悬浮于Iml20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中，以200 μ 1/管将菌液分装在 1. 5mlEppendorf管中，置液氮中速冻Imin，_70°C保存备用。2.冻融法转化根癌农杆菌GV3101①在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μ g表达载体质粒DNA，混勻后冰浴30min ；
②置液氮速冻lmin，迅速移至37°C保温^iin；
③加入无抗生素的YEP800μ 震荡培养!3hr ；
④7000rpm的转速下离心30s，收集菌体，涂于含50μ g/ml利福平、50yg/ml Kan 的YEP平板上，28°C倒置暗培养2 3天。3. 菌体PCR鉴定
菌体PCR所用引物同实施例3，方法及程序同实施例2中的(4 )。实施例5转基因功能验证——拟南芥转化、筛选及表型分析
1.拟南芥的种植
将野生型拟南芥种子用7. 5%次氯酸钠溶液(包括7. 5%次氯酸钠和0. 01% Triton-X 100)消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5 6次，点播于MS平板上，于4° C春化2 3天， 然后移植到营养钵中(营养土与蛭石按等比例混合)，在23° C下培养，16/8 h光周期，光强30 40μπιΟ1·πΓ2 -S-1 ；待植株开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展，在剪枝后的4 6天内，进行农杆菌转化；
2.拟南芥转化
把200 ml菌液倒入浅盘中，将修剪好的拟南芥倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，轻轻搅动沾花30 sec^1 min，取出花盆侧放于托盘中，用保鲜袋包裹以保湿，将托盘置暗处培养 24 h，然后取出营养钵并直立放置，恢复光照，继续培养植株至成熟；
3.阳性植株的筛选T0代种子用7.5%次氯酸钠溶液(包括7. 5%次氯酸钠和0. 01% Triton-ΧΙΟΟ)消毒后，点播在MS选择培养板(30 mg/L潮霉素)上，于4°C下春化2_3天， 移入培养室中培养，大约10天左右，挑选潮霉素抗性植株(长出真叶1 2对，根伸长至培养基中)并移栽到营养钵中，培养直至种子成熟，采用同样的方法筛选Tl代种子得到T2代植株，并在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系，并获得纯合T3代株系进行转基因拟南芥的分子检测和表型鉴定；
4.转基因拟南芥的PCR鉴定 (1)拟南芥基因组DNA的提取
①取IOOmg左右的新鲜叶片，放入1.5ml离心管中，液氮速冻，研磨器中磨碎，加入 600 μ 1预热至65°C的2 X CTAB提取缓冲液，混勻置于65°C水浴中放置90min ；
②混合物冷至室温后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混勻，4°C，12000rpm离心 IOmin ；
③取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，混勻，4°C，12000rpm离心IOmin；
④取上清，加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5. 3)和0. 7倍体积的异丙醇，仔细混勻， 室温放置15min，沉淀DNA;
⑤用一玻璃钩将DNA钩出，并转移至一装有800μ 1 70%乙醇的干净Eppendorf管中， 室温放置数分钟洗涤沉淀，6000g离心5min ；
⑥尽量去尽上清，空气干燥数分钟，溶于适量TE缓冲液中。(2) PCR 扩增
以上面提取的拟南芥基因组DNA为模板，用基因特异性引物(同实施例3)进行PCR扩增。
PCR体系同实施例2中的(4)，PCR反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性 45sec，58°C复性45sec，72°C延伸lmin，循环35次；72°C延伸7min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到在转基因拟南芥植株中扩增出一 750bp左右的目的条带，在转空载体的植株中未见扩增条带见附图4。5.转基因拟南芥的表型鉴定 (1)拟南芥的种植
T3代单拷贝纯合拟南芥株系的种子用7. 5%次氯酸钠溶液(包括7. 5%次氯酸钠和 0.01% Triton-X 100)消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5 6次，点播于MS平板上，于4° C 春化2 3天，然后移植到营养钵中(营养土与蛭石按等比例混合)，23° C培养，16/8 h光周期，光强 30 40μπιο1·πΓ2 · s-1。(2) NaCl和干旱胁迫处理
NaCl处理将萌发2天的拟南芥幼苗(对照及转基因株系)小心移至含有50mM NaCl的 MS培养皿中，竖直培养一周观察表型，结果表明转TaMYB33基因的拟南芥植株的根长明显长于野生型对照植株的根长(附图5A)。干旱处理将萌发一周的拟南芥幼苗(对照及转基因株系)移植培养土中，培养10 天后开始控水(不浇水)干旱处理。干旱处理15天后观察表型。结果表明干旱处理15天后，作为对照的野生型拟南芥植株开始萎蔫，一些株系的叶子变得干枯，而转化TaMYB33外源基因的拟南芥植株长势旺盛附图5 B。复水处理3天后再次观察表型，发现对照拟南芥植株枯萎死亡，而转化的拟南芥植株长势良好，如附图5中C所示，说明本发明的小麦基因TaMYB33具有很好的抗旱性。
权利要求
1.小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33，其CDNA序列是序列表SEQID No. 1的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33，其编码蛋白是下述氨基酸序列之(1)序列表中SEQID No. 2序列；(2)将序列表中的SEQID No. 2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控耐盐、抗旱复苏能力的蛋白质。
3.如权利要求2所述的小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33的编码蛋白，其特征在于，所述的蛋白是序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
4.含有权利要求1所述基因的表达载体。
5.含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求1所述基因TaMYB33在培育耐盐、抗旱植物中的应用。
7.如权利要求6中所述基因TaMYB33在培育耐盐、抗旱植物中的应用，所述的植物为小麦或拟南芥。
8.提高含有权利要求1中所述小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，是将小麦基因TaMYB33导入宿主植物的细胞、组织或植株个体，得到具有耐盐、抗旱性能的植株。
9.如权利要求8中所述的提高含有权利要求1中所述小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，其特征在于，所述的小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33通过含有所述小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33的植物表达载体pCAMBIA-superl300/TaMYB33导入细胞、植物组织或植物个体，用于构建所述植物表达载体的出发载体为pCAMBIA-Superl300。
10.如权利要求8或9中所述的提高含有权利要求1中所述小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，其特征在于，所述的植物宿主为小麦或拟南芥。
全文摘要
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用。小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33，是序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列。本发明的有益效果在于，首次克隆得到了小麦MYB转录因子基因TaMYB33，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，与野生型拟南芥植株相比，含有本发明的TaMYB33基因的转基因拟南芥植株的耐盐、抗旱能力明显提高。
文档编号C12N1/15GK102234653SQ201110177708
公开日2011年11月9日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者夏光敏, 秦余香 申请人:山东大学, 济南大学