专利名称：abl基因多态性的检测用探针和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测与白血病相关的abl基因的多态性的探针和其用途。
背景技术：
白血病是由骨髓中的造血干细胞癌化而引起的疾病。已知其中慢性粒细胞白血病 (chronic myeloid leukemia =CML)的发病原因在于9号染色体和22号染色体的易位而形成的bcr-abl融合基因，其治疗中广泛使用作为ABL激酶抑制剂的伊马替尼等。然而，该 abl基因(包括前述融合基因中的abl基因)中存在点突变时，存在对伊马替尼表现出耐受性的问题，这种情况下，治疗中需要增加伊马替尼给药量、换成其它治疗药物、改为骨髓移植等等。因此，白血病特别是CML的治疗中，检测abl基因中有无点突变是非常重要的。作为abl基因中的点突变的检测方法，可以列举出对abl基因变异，通过 RT-PCR进行扩增、克隆后进行序列解析的方法(PNAS August 6,2002 vol.99 no. 16 10700-10705)；用PCR-RFLP法对abl基因变异进行检测的方法(Leukemia(2002) 16, 2190-2196)；用DHPLC法对abl基因变异进行检测、序列解析的方法(Clin Cancer Res 2006 ； 12 (24) December 15,2006)等。然而，PNAS 2002中所述的方法在实验操作方面需要专业知识和技能，难以自动化。此外，实验操作方面也需要花费功夫，至获得结果为止需要数天。Leukemia 2002中所述的方法操作也繁杂，至获得结果为止需要1天左右。此外，有扩增产物污染其它反应之虞(发生污染)。且难以自动化。Clin Cancer Res 2006中所述的方法操作也繁杂，难以自动化。此外，DHPLC法难以区别突变型，需要通过测序法等另行对突变型进行检测。由这样的问题出发，近年正在进行利用熔解曲线分析(Tm分析)的检测，来作为基因多态性的检测方法(日本特开2001-286300，日本特开2002_11拟91)。其为如下方法， 即，使用与含有检测目的基因多态性的检测对象序列互补的探针，形成检测试样的目标单链DNA和前述探针的杂交体(双链DNA)，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的测定，来检测随温度上升的杂交体的解离(熔解)，基于该检测结果确定Tm值，从而判断有无目的多态性。在杂交产物的同源性越高时，Tm值越高，在同源性越低时，Tm值越低。因此，对含有目的多态性的检测对象序列和与其互补的探针的杂交产物预先求出Tm值(评价基准值)，测定检测试样的目标单链DNA和前述探针的Tm值(测定值)，若测定值与评价基准值相同则可以判断为匹配，即目标DNA中存在目的多态性，若测定值低于评价基准值则可以判断为错配，即目标DNA中不存在目的多态性。然而，使用这样的Tm分析的检测方法，存在灵敏度低这样的问题。在对白血病患者的血细胞来源DNA进行点突变检测时，这特别成问题(日本特表2004-537992)。S卩，即使是一个CML患者的血液，其血细胞中也包含abl基因发生点突变的基因(变异基因)和未发生突变的基因(正常基因)，两者的不同仅在于点突变即一个碱基的序列。这样，会发生如下现象用于检测点突变的探针与含有点突变的变异序列(检测对象序列)杂交(匹配)， 还与不含点突变的正常序列(非检测对象序列)进行杂交(错配)。这种情况下，利用Tm分析制作表示信号强度和温度的关系的熔解曲线时存在如下问题匹配的变异序列所对应的高温侧的峰由于错配的正常序列所对应的低温侧的峰的存在而难以检测。即，就现有的探针而言，即使在含有变异的变异序列存在的情况下，也由于不含变异的正常序列的存在而变得难以检测，存在检测灵敏度降低的问题。W02008/018305中记载了在利用Tm分析的检测方法中使用的、对abl基因中的点突变即 A758T(Y253F)、G756C(Q250E)、G763A (E255K)、和 A758T(Y253F)进行检测的探针。 此外，日本特开 2008-199965 中记载了对 A730G(M244V)、G749A(G250E)、A943G(T315A)、 C944T(T315I)、C951G(F317L)、T1052C (M351T)、A1064G(E355G)、T1075G(F359V)、禾口 A1187G (H396R)进行检测的探针。然而，对 T1076G (F359C), T757C (Y253H), A764T (E255V)、 和G895C/T(V299L)进行检测的探针在所有文献中均没有记载。
发明内容
本发明的课题在于确立一种对于检测ab 1基因中的点突变T1076G (F359C)、 T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和G895C/T(V299L)有效的检测用探针，提供对abl基因中的点突变 T1076G(F359C)、T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和 G895C/T(M99L)进行检测的方法、以及用于该检测的试剂盒。本发明人发现，通过基于abl基因中的含有点突变T1076G(F359C)、 T757C(Y253H)、A764T (E255V)、和G895C/T (V299L)的特定区域设计探针并进行使用该探针的Tm分析，能够检测该变异位点的多态性，从而完成了本发明。S卩，本发明包括以下发明。(1) 一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测abl基因的多态性的探针，由选自下述Pl P9的至少1种荧光标记寡核苷酸构成。(Pl)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号1或2所示的碱基序列中的包含碱基号125 133的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号125 对应的碱基为胞嘧啶；(P2)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135 146的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146 对应的碱基为胞嘧啶；(P3)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144 对应的碱基为胞嘧啶；(P3’ )为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144 对应的碱基为胞嘧啶；(P4)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号134 135的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134 对应的碱基为胞嘧啶；(P5)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号138 142的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶；(P6)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 153的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153 对应的碱基为胞嘧啶；(P7)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 150的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150 对应的碱基为胞嘧啶；(P8)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6 8所示的碱基序列中的包含碱基号126 135的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶；(P9)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6 8所示的碱基序列中的包含碱基号126 129的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号1 对应的碱基为胞嘧啶。(2)根据(1)所述的探针，Pl的寡核苷酸在从3’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号 125对应的碱基，P2的寡核苷酸在从5’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号 146对应的碱基，P3和P3’的寡核苷酸在从5’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号144对应的碱基，P4的寡核苷酸在从3 134对应的碱基，P5的寡核苷酸在从3 138对应的碱基，P6的寡核苷酸在从5 153对应的碱基，P7的寡核苷酸在从5 150对应的碱基，P8的寡核苷酸在从3 135对应的碱基，P9的寡核苷酸在从3 1 对应的碱基。(3)根据(1)所述的探针，Pl的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号125对应的碱基，P2的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号146对应的碱基，P3和P3’的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号144对应的碱基，P4的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号134对应的碱基，P5的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号138对应的碱基，P6的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号153对应的碱基，
’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号 ’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号 ’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号 ’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号 ’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号 ’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号
P7的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号150对应的碱基，P8的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号135对应的碱基，P9的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号1 对应的碱基。(4)根据(1) C3)中任一项所述的探针，前述荧光标记寡核苷酸未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少或增加。(5)根据(4)所述的探针，前述荧光标记寡核苷酸未杂交到目标序列时发出荧光， 杂交到目标序列时荧光强度减少。(6)根据(1) (5)中任一项所述的探针，PU P3、P3’、P4、P5、P7、P8和P9的寡核苷酸的碱基长为10 30，P2和P6的寡核苷酸的碱基长为12 30。(7)根据⑴ (6)中任一项所述的探针，前述探针为熔解曲线分析用探针。(8) 一种abl基因中的多态性的检测方法，其特征在于，使用(1) (7)中任一项所述的探针。(9) 一种abl基因中的多态性的检测方法，其特征在于，包括下述工序(I) (IV)(I)在含有DNA的试样中添加(1) (7)中任一项所述的探针使前述探针杂交到前述DNA的工序；(II)改变温度而使前述DNA和前述探针的杂交产物解离并测定基于杂交产物的解离的信号变动的工序；(III)解析前述信号变动而确定Tm值的工序；和(IV)由前述Tm值确定有无目的多态性或具有多态性的碱基序列的存在比的工序。(10)根据(9)中所述的方法，还包括在⑴工序之前或与⑴工序同时地扩增DNA 的步骤。(11)对抗白血病药的耐受性或抗白血病药的药效的判断方法，其包括根据 (8) (10)中任一项所述的方法检测abl基因中的多态性的工序、和基于有无多态性而判断对抗白血病药的耐受性或抗白血病药的药效的工序。(12) 一种用于检测abl基因中的多态性的试剂盒，其含有⑴ (7)中任一项所述的探针。(13)根据(12)中所述的试剂盒，其还含有用于扩增abl基因的下述区域的引物， 所述区域为序列号1所示的碱基序列中的、包含Pi的寡核苷酸所杂交的序列的区域，序列号3所示的碱基序列中的、包含？2、？3、？3’、？4』5、？6或？7的寡核苷酸所杂交的序列的区域，或序列号6所示的碱基序列中的、包含P8或P9的寡核苷酸所杂交的序列的区域。予以说明，在上述中，abl基因的多态性还包括该基因的附近区域的多态性。根据本发明的探针，即使是具有检测目的变异的abl基因(包括bcr-abl融合基因中的abl基因。以下同样。)(变异基因)和未发生变异的abl基因(正常基因)共存的情况下，也能够检测发生了前述目的变异的检测对象序列。Tm分析中，探针与仅一个碱基不同的变异基因和正常基因这两者杂交时，熔解曲线中两者的信号重叠，检测变异基因的存在是非常困难的。与此相对，本发明的探针虽与变异基因和正常基因这两者杂交，但熔解曲线中两者的信号能够充分分离。因此，根据本发明能够以比以前更优异的灵敏度对变异基因进行检测。若预先将本发明的探针添加到PCR等基因扩增体系中，则基因扩增反应结束后仅进行Tm分析即能够以高灵敏度进行多个基因变异型的分型。进而，由于能够直接检查全血、口腔粘膜悬浮液等，因此能够减少功夫和成本。本发明的探针特异性高，检测灵敏度高。通过使用本发明的方法，即使是进行PCR的情况下，也不必取出扩增产物，因此几乎不存在污染的危险性。此外，本发明的方法步骤简单，因此容易自动化。
图1中，(A)是表示核酸混合物的熔解曲线的一个例子的图，(B)是表示微分熔解曲线的一个例子的图。图2是表示标准曲线的一个例子的图。图3A表示的是实施例1的对含有T1076G(F359C)的质粒(变异含有率2. 5% ) 使用序列号9(3’末端标记)的探针的Tm分析中的每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量 (d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量 /t)，横轴为温度(0C)0图;3B表示的是比较例1的对含有T1076G(F359C)的质粒(变异含有率2. 5% )使用序列号9(5’末端标记)的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)， 横轴为温度CC )。图4A表示的是实施例2-1的对含有T757C(Y253H)的质粒(变异含有率0% (I)、 10% (11),20% (III))使用序列号10的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(0C)0图4B表示的是实施例2-2的对含有T757C(Y253H)的质粒(变异含有率10% )使用序列号11的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度 (°C )。图4C表示的是实施例2-3的对含有T757C(Y253H)的质粒(变异含有率10% )使用序列号12的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度 (°C )。图5A表示的是实施例3-1的对含有A764T (E255V)的探针的互补链(变异含有率 10% )使用序列号13的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(°C )。图5B表示的是实施例3-2的对含有A764T (E255V)的探针的互补链(变异含有率 10% )使用序列号14的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(°C )。图5C表示的是实施例3-3的对含有A764T (E255V)的探针的互补链(变异含有率 10% )使用序列号15的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(°C )。图5D表示的是实施例3-4的对含有A764T (E255V)的探针的互补链(变异含有率 10% )使用序列号16的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(°C )。图6A表示的是实施例4-1的对含有G895C(V299L)的质粒(变异含有率5% )使用序列号17的探针的Tm分析中每单位时间的BODIPY FL的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(°C )。图6B表示的是实施例4-2的对含有G895C(V299L)的质粒(变异含有率5% )使用序列号18的探针的Tm分析中每单位时间的BODIPY FL的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(°C )。图6C表示的是实施例4-3的对含有G895T (V299L)的质粒(变异含有率5% )使用序列号19的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度 (0C)0图6D表示的是实施例4-4的对含有G895T (V299L)的质粒(变异含有率5% )使用序列号20的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度 (0C)0
具体实施例方式本发明中，以下也将具有检测目的变异的abl基因称为“变异基因”，将具有检测目的变异的序列称为“变异序列”，将未发生检测目的变异的abl基因称为“正常基因”，将未发生检测目的变异的序列称为“正常序列”，将检测有无变异的试样中的DNA称为“目标 DNA "ο本发明中，作为所检测的多态性，可以列举出例如单核苷酸多态性(SNP)等。此外，本说明书中，T1076G(F359C)是指abl基因的1076位的碱基由T(野生型) 变为G (变异型)的变异，括号内是指随着碱基的变异，359位的氨基酸由F变成C。其它变异的记载也同样。予以说明，abl基因的碱基序列已经登录为美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)登录号 No. NG_012034。下述所示的序列号1、3、6的序列均包含于该序列中。以下对本发明的探针进行说明。
< 探针 >如前所述，本发明的探针特征在于，其为用于检测abl基因的多态性的探针，由选自前述Pl P9组成的组中的至少一个寡核苷酸构成。(Pl)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号1或2所示的碱基序列中的包含碱基号125 133的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号125 对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号125对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号1和 2的碱基号125的g(鸟嘌呤)对应的互补碱基c (胞嘧啶)。Pl探针中，优选该c存在于从 3’末端数第1 3位的位置，更优选该c存在于3’末端。由Pl的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号1的碱基序列中的133位碱基的多态性的探针。该碱基相当于T1076G变异的碱基，若为野生型则为T，若为变异型则为G。 将包含T1076的区域的序列示于序列号1 (野生型133位为T)和2 (变异型133位为G)。用于检测该多态性的探针的长度优选为10 30碱基长，更优选为15 25碱基长。予以说明，由Pl的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号1所示的碱基序列中的包含碱基号 125 133的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号125对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号2所示的碱基序列中的包含碱基号125 133的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号 125对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号9的碱基序列的探针。5，-cctgtggatgCagtttttc*_3，(序歹[J 号 9)这里，c*表示在3’侧进行了荧光标记的c (以下同样)。予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的C为A。(P2)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135 146的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146 对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号146对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和 4的碱基号146的g对应的互补碱基c。P2探针中，优选该c存在于从5’末端数第1 3 位的位置，更优选该c存在于5’末端。由P2的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的135位的碱基的多态性的探针。该碱基相当于T757C变异的碱基，若为野生型则为T，若为变异型则为C。 将包含T757C的区域的序列示于序列号3 (野生型135位为T)和4(变异型135位为C)。用于检测该多态性的探针的长度优选为12 30碱基长，更优选为15 30碱基长，进一步优选为15 25碱基长。予以说明，由P2的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号 135 146的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号4所示的碱基序列中的包含碱基号135 146的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号 146对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号10的碱基序列的探针(大写字母表示变异碱基，以下相同)。5，-*cacctccccgtGctg_3，(序歹[J 号 10)这里，*c表示在5’侧进行荧光标记的c (以下同样)。予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的G为A。(P3)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144 对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号144对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和 4的碱基号144的g对应的互补碱基c。P3探针中，优选该c存在于从5’末端数第1 3 位的位置，更优选该c存在于5’末端。由P3的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的135位的碱基的多态性的探针。用于检测该多态性的探针的长度优选为10 30碱基长，更优选为15 25碱基长。予以说明，由P3的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号 135 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号4所示的碱基序列中的包含碱基号135 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号 144对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号11的碱基序列的探针。5，-cctccccgtGctggc-3，(序歹[J 号 11)予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的G为A。(P3’ )为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144 对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号144对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和 5的碱基号144的g对应的互补碱基c。P3’探针中，优选该c存在于从5’末端数第1 3 位的位置，更优选该c存在于5’末端。由P3’的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的142位的碱基的多态性的探针。该碱基相当于A764T变异的碱基，若为野生型则为A，若为变异型则为T。 将包括A764T的区域的序列示于序列号3 (野生型142位为A)和5 (变异型142位为T)。用于检测该多态性的探针优选为10 30碱基长，更优选为15 25碱基长，可以是下述中的任意一者或两者被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号 3所示的碱基序列中的包含碱基号142 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号5所示的碱基序列中的包含碱基号142 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号16的碱基序列的探针。5，-*ccAccccgtactggcc_3，(序歹[J 号 16)予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的A为T。(P4)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号134 135的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134 对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号134对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和 4的碱基号134的g对应的互补碱基c。P4探针中，优选该c存在于从3’末端数第1 3 位的位置，更优选该c存在于3’末端。由P4的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的135位的碱基的多态性的探针。用于检测该多态性的探针的长度优选为10 30碱基长，更优选为15 25碱基长。予以说明，由P4的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号 134 135的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号4所示的碱基序列中的包含碱基号134 135的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号 134对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号12的碱基序列的探针。5，-gtacacctccccgtGc*_3，(序列号 12)予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的G为A。(P5)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号138 142的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138 对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号138对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和 5的碱基号138的g对应的互补碱基c。P5探针中，优选该c存在于从3’末端数第1 3 位的位置，更优选该c存在于3’末端。由P5的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的142位的碱基的多态性的探针。用于检测该多态性的探针的长度优选为10 30碱基长，更优选为15 25碱基长。予以说明，由P5的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号 138 142的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号5所示的碱基序列中的包含碱基号138 142的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号13的碱基序列的探针。5，-cctcgtacaccAcccc*_3，(序列号 13)予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的A为T。(P6)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 153的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153 对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号153对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和 5的碱基号153的g对应的互补碱基c。P6探针中，优选该c存在于从5’末端数第1 3 位的位置，更优选该c存在于5’末端。由P6的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的142位的碱基的多态性的探针。用于检测该多态性的探针的长度优选为12 30碱基长，更优选为15 30碱基长，进一步优选为15 25碱基长。予以说明，由P6的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号 142 153的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号5所示的碱基序列中的包含碱基号142 153的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号 153对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号14的碱基序列的探针。5，-*cctcgtacaccAcccc_3，(序列号 14)予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的A为T。(P7)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 150的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150 对应的碱基为胞嘧啶这里，“与碱基号150对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和 5的碱基号150的g对应的互补碱基c。P7探针中，优选该c存在于从5’末端数第1 3 位的位置，更优选该c存在于5’末端。由P7的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的142位的碱基的多态性的探针。用于检测该多态性的探针的长度优选为10 30碱基长，更优选为15 25碱基长。予以说明，由P7的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号 142 150的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号5所示的碱基序列中的包含碱基号142 150的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号 150对应的碱基为胞嘧啶。
优选列举变异型检测用的具有下述序列号15的碱基序列的探针。5，-*cgtacaccAccccgta_3，(序列号 15)予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的A为T。(P8)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6 8所示的碱基序列中的包含碱基号126 135的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号135对应的碱基”是指前述序列中，序列号6 8的碱基号135 的c。P8探针中，优选该c存在于从3’末端数第1 3位的位置，更优选该c存在于3’末端。由P8的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号6的碱基序列中的1 位的碱基的多态性的探针。该碱基相当于G895C/T变异的碱基，若为野生型则为G，若为变异型则为 C或T。将包含G895C的区域的序列示于序列号6 (野生型1 位为G)、序列号7 (变异型 126位为C)和8 (变异型1 位为T)。用于检测该多态性的探针的长度优选为10 30碱基长，更优选为15 25碱基长。予以说明，由P8的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者或三者 被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有序列号6所示的碱基序列中的包含碱基号1 135的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135 对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有序列号7所示的碱基序列中的包含碱基号126 135的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有序列号8所示的碱基序列中的包含碱基号1 135的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号17或19的碱基序列的探针。5，-cctgCtgcagctcc-3，(序列号 17)5，-aacctgTtgcagctcc*_3，(序歹[J 号 19)予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的C或T为G。(P9)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6 8所示的碱基序列中的包含碱基号126 129的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号1 对应的碱基为胞嘧啶。这里，“与碱基号129对应的碱基”是指前述序列中，序列号6 8的碱基号1 的c。P9探针中，优选该c存在于从3’末端数第1 3位的位置，更优选该c存在于3’末端。由P9的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号6的碱基序列中的1 位的碱基的多态性的探针。用于检测该多态性的探针的长度优选为10 30碱基长，更优选为15 25碱基长。予以说明，由P9的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者或三者 被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有序列号6所示的碱基序列中的包含碱基号126 129的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号1 对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有序列号7所示的碱基序列中的包含碱基号126 129的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号1 对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有序列号8所示的碱基序列中的包含碱基号1 129的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号1 对应的碱基为胞嘧啶。优选列举变异型检测用的具有下述序列号18或20的碱基序列的探针。5，-accctaacctgCtgc*_3，(序歹[J 号 18)5，-tcaaacaccctaacctgTtgc*_3，(序歹[J 号 20)予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的C或T为G。本申请中的“同源”是指相对于特定的碱基序列，具有与碱基序列的互补链或该碱基序列具有80%以上、更优选为90%以上、最优选为95%以上的同源性的序列的碱基序列。本发明的探针优选为未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸探针。其中，更优选未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸探针。这类利用了荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针通常被称为鸟嘌呤淬灭探针，已知有所谓的QProbe (注册商标)。其中，优选以将寡核苷酸设计为3’末端或5’末端为C而使得该末端的C接近G 时发光变弱的方式用荧光染料进行标记的探针。予以说明，本说明书中，“从5 ’末端数第1 3位”的情况下，将5 ’末端数作第1 位，“从3’末端数第1 3位”的情况下，将3’末端数作第1位。前述荧光染料没有限制，可以列举出例如荧光黄、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等，市售的荧光染料可以列举出例如BODIPY FL(商标名，Molecular Probe公司制)、FluorePrime (商品名，FluAmersham Pharmacia 公司制)、Fluoredite (商品名， Millipore 公司制)、FAM (ABI 公司制)、Cy 3 和 Cy5 (FluAmersham Pharmacia 公司制)、 TARMA (Molecular Probe公司制)等。探针的检测条件没有特别限制，可根据所使用的荧光染料适当决定，例如就I^acific Blue而言，可以在检测波长445 480nm下检测，就TAMRA 而言，可以在检测波长585 700nm下检测，就BODIPY FL而言，可以在检测波长520 555nm下检测。使用这样的探针可以根据信号的变动而容易地确认杂交和解离。此外，本发明的探针例如可以在3’末端添加磷酸基。如后所述，用于检测有无变异的DNA(目标DNA)可以通过PCR等基因扩增法而制备，此时可以使本发明的探针共存于基因扩增反应的反应液中。这种情况下，若预先在探针的3’末端添加磷酸基则能够充分防止探针自身因基因扩增反应而伸长。此外，也可以通过在3’末端添加前述那样的标记物而获得同样的效果。具有上述碱基序列且5’末端或3’末端的C被荧光染料标记的探针的具体例子如下述表1所示(大写的碱基表示变异点，P表示磷酸基)。但本发明的探针并不限于以下探针。表1
权利要求
1.一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测abl基因的多态性的探针，由选自下述Pl P9的至少1种荧光标记寡核苷酸构成，(Pl)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号1或2所示的碱基序列中的包含碱基号125 133的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号125对应的碱基为胞嘧啶；(P2)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135 146的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146对应的碱基为胞嘧啶；(P3)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶；(P3’ )为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 144的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶；(P4)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号Π4 135的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134对应的碱基为胞嘧啶；(P5)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号138 142的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶；(P6)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 153的12 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153对应的碱基为胞嘧啶；(P7)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142 150的10 50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150对应的碱基为胞嘧啶；(P8)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6 8所示的碱基序列中的包含碱基号1 135的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号 135对应的碱基为胞嘧啶；(P9)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6 8所示的碱基序列中的包含碱基号126 129的10 50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号1 对应的碱基为胞嘧啶。
2.根据权利要求1所述的探针，Pl的寡核苷酸在从3’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号125 对应的碱基，P2的寡核苷酸在从5’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号146 对应的碱基，P3和P3’的寡核苷酸在从5’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号144对应的碱基，P4的寡核苷酸在从3’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号134 对应的碱基，P5的寡核苷酸在从3’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号138 对应的碱基，P6的寡核苷酸在从5’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号153 对应的碱基，P7的寡核苷酸在从5’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号150 对应的碱基，P8的寡核苷酸在从3’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号135 对应的碱基，P9的寡核苷酸在从3’末端数第1 3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号1 对应的碱基。
3.根据权利要求1所述的探针，Pl的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号125对应的碱基， P2的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号146对应的碱基， P3和P3’的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号144对应的碱基， P4的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号134对应的碱基， P5的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号138对应的碱基， P6的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号153对应的碱基， P7的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号150对应的碱基， P8的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号135对应的碱基， P9的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号1 对应的碱基。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的探针，前述荧光标记寡核苷酸未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少或增加。
5.根据权利要求4所述的探针，前述荧光标记寡核苷酸未杂交到目标序列时发出荧光，杂交到目标序列时荧光强度减少。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的探针，PI、P3、P3’、P4、P5、P7、P8和P9的寡核苷酸的碱基长为10 30，P2和P6的寡核苷酸的碱基长为12 30。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的探针，前述探针为熔解曲线分析用探针。
8.—种abl基因中的多态性的检测方法，其特征在于，使用权利要求1 7中任一项所述的探针。
9.一种abl基因中的多态性的检测方法，其特征在于，包括下述工序(I) (IV)(I)在含有DNA的试样中添加权利要求1 7中任一项所述的探针使前述探针杂交到前述DNA的工序；(II)改变温度而使前述DNA和前述探针的杂交产物解离并测定基于杂交产物的解离的信号变动的工序；(III)解析前述信号变动而确定Tm值的工序；和(IV)由前述Tm值确定有无目的多态性或具有多态性的碱基序列的存在比的工序。
10.根据权利要求9中所述的方法，还包括在(I)工序之前或与(I)工序同时地扩增DNA的步骤。
11.对抗白血病药的耐受性或抗白血病药的药效的判断方法，其包括根据权利要求 8 10中任一项所述的方法检测abl基因中的多态性的工序、和基于有无多态性而判断对抗白血病药的耐受性或抗白血病药的药效的工序。
12.一种用于检测abl基因中的多态性的试剂盒，其含有权利要求1 7中任一项所述的探针。
13.根据权利要求12中所述的试剂盒，其还含有用于扩增abl基因的下述区域的引物， 所述区域为序列号1所示的碱基序列中的、包含Pi的寡核苷酸所杂交的序列的区域，序列号3所示的碱基序列中的、包含？2』3、？3’、？4、？5、？6或？7的寡核苷酸所杂交的序列的区域，或序列号6所示的碱基序列中的、包含P8或P9的寡核苷酸所杂交的序列的区域。
全文摘要
本发明涉及医疗和诊断领域。具体而言，本发明涉及abl基因多态性的检测用探针和其用途。本发明公开了一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测abl基因的多态性的探针，由选自P1～P9的至少1种荧光标记寡核苷酸构成。本发明还公开了利用本发明探针的检测方法和试剂盒。本发明的探针特异性高，具有优异的检测灵敏度。采用本发明探针的检测方法步骤简单，容易自动化。
文档编号C12N15/11GK102329857SQ20111020111
公开日2012年1月25日 申请日期2011年7月12日 优先权日2010年7月12日
发明者细见敏也 申请人:爱科来株式会社