专利名称：一种利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取食品防腐剂的方法。
背景技术：
随着生活水平的不断提高，消费意识的不断明确，健康问题已经是生活中每天必然谈论的话题，然而目前的食品中主要添加的还是苯甲酸钠、山梨酸钾、亚硝酸盐等化学防腐剂，这些化学防腐剂虽然有较好的防腐保鲜的功效，但是不易代谢消化，随着在体内残留量的不断升高，容易引起机体细胞功能的紊乱，造成机体病变，严重的诱发癌变。目前研究人员在L-乳酸菌发酵的酸菜水中发现了一种可以使未经灭菌的酸菜在常温下存放1.5年之久的物质，这种物质经鉴定是一种在食品中具有高效高活力防腐作用，而在体内可被分解为氨基酸的高安全小肽类物质，它就是小分子肽，抑菌范围、抑菌活力、安全性和适用范围等方面均比化学防腐剂突出。而且在中性条件下仍有很好的抑菌效果，是应用范围更广的天然防腐剂，完全无害。在关于“酸菜水分离提取小肽类天然防腐剂”的报道中，利用相关技术方法和设备初步提取了这种小分子肽，但毕竟是初步初级实验技术提纯手段，整个工艺比较粗糙，导致产品在纯度、颜色、抑菌效果、产率等方面还达不到要求，无法实现广谱抑菌效果。技术缺点①酸菜发酵液45°C下的浓缩液过于浓稠，盐析沉淀效果较差；②盐析(NH4)2S04浓度梯度变化不明显，仅采用了 30%和60%两个浓度；③离心转数不够，仅是15000r/min，不能使有效成分完全沉淀；④冻干粉采用稀盐酸稀释，稀释剂本身就有抑菌效果，因此不能得出产品本身有效的抑菌直径；⑤没有进行抑菌效价鉴定，不能准确确定提纯物质的有效抑菌效力；⑥冷冻干燥技术的使用，导致产品的部分活性变性丧失；⑦凝胶层析洗脱液体积不够， 不能保证有效物质完全被洗脱。食品工业飞速发展，小分子肽将会在二十一世纪具有广阔的应用前景，也必将创造出极大地社会效益与经济效益。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的酸菜水分离提取小肽类天然防腐剂的方法存在工艺不完善，产品的纯度、颜色、抑菌效果和产率不达标的问题，而提供了一种利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法。利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法按以下步骤进行一、取 500ml酸菜水在常温下5000 6000r/min离心处理30min，取上清液，采用抽真空水浴式旋转蒸发仪40°C减压浓缩5倍，得浓缩液；二、向IOOml浓缩液中加入质量浓度为30%的硫酸铵并不断搅拌，盐析沉淀完全后于4°C下静止4h，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为30%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于 4°C下加入质量浓度为40%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下300001·/ min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为40%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为50%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为50%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为60%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下 30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为60%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径；三、收集步骤二中四次盐析抑菌效果最佳的离心管中的沉淀，加入到截留相对分子质量1200 1700的透析袋内，以Tris-H3PO4为透析内液，蒸馏水作透析外液，4°C下透析，同时用氯化钡检测透析袋内没有BaSO4产生，即完成透析，获得透析后样品；四、CM Sephadex C_25层析凝胶经预处理后装入层析柱，将透析后样品用 Tris-H3PO4稀释上样后，洗脱液使用顺序是先用40ml的HAC-NaAC缓冲液，再用60ml浓度为0. 02mol/L的KCl溶液，收集洗脱液；五、将收集的洗脱液在^Onm下测定紫外吸光值，选择紫外吸光值彡0. 2的洗脱液，然后进行喷雾干燥，获得成品干粉，即完成利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂；其中步骤二中测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，抑菌效果不明显的均是指抑菌圈直径小于其空白试验的抑菌圈直径；步骤三中抑菌效果最佳的是指抑菌圈直径大于其空白试验的抑菌圈直径。本发明利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂，所得成品干粉，产率达标，纯度高达92.6%，颜色呈浅乳白色，对革兰氏阳性菌如葡萄球菌、肠球菌、芽孢杆菌、利斯特氏菌、梭状芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性菌如沙门氏菌以及大肠杆菌均具有抑菌效果；本发明所得小肽类天然食品防腐剂避免了大量化学防腐剂的使用对人类健康带来巨大伤害这一本质问题，同时辅助性延长食品包藏时间，避免因保藏时间短过期即销毁的资源浪费严重现象，有利于低碳减排，同时突破以往小分子肽类食品防腐剂的研究方法，更新技术指标，完善技术路线，细化工艺，使产品颜色纯度方面达到市场要求，实现了广谱抑菌效果。本发明利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法，优点①酸菜发酵液40°C下的浓缩液黏度适中，颜色较浅，利于(NH4)2SO4盐析；②盐析 (NH4) 2S04浓度梯度变化明显，采用了 30 %、40 %、50 %、60 %四个浓度，逐级沉淀了相关蛋白代谢产物；③离心转数30000r/min，使有效成分大幅度沉淀；④凝胶层析洗脱液体积加倍， 保证有效物质完全被洗脱；⑤采用喷雾干燥技术，保持产品活性。
图1为具体实施方式
五中凝胶电泳图，其中1泳道表示Nisin标准样品(3500Da)， 2和3泳道表示成品干粉，4泳道表示标准分子量蛋白系列Mark。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法按以下步骤进行一、取500ml酸菜水在常温下5000 6000r/min离心处理30min，取上清液，采用抽真空水浴式旋转蒸发仪40°C减压浓缩5倍，得浓缩液；二、向IOOml浓缩液中加入质量浓度为30%的硫酸铵并不断搅拌，盐析沉淀完全后于4°C下静止4h，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为30%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于 4°C下加入质量浓度为40%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下300001·/ min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为40%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为50%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为50%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为60%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下 30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为60%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径；三、收集步骤二中四次盐析抑菌效果最佳的离心管中的沉淀，加入到截留相对分子质量1200 1700的透析袋内，以Tris-H3PO4为透析内液，蒸馏水作透析外液，4°C下透析，同时用氯化钡检测透析袋内没有BaSO4产生，即完成透析，获得透析后样品；四、CM Sephadex C_25层析凝胶经预处理后装入层析柱，将透析后样品用 Tris-H3PO4稀释上样后，洗脱液使用顺序是先用40ml的HAC-NaAC缓冲液，再用60ml浓度为0. 02mol/L的KCl溶液，收集洗脱液；五、将收集的洗脱液在^Onm下测定紫外吸光值，选择紫外吸光值彡0. 2的洗脱液，然后进行喷雾干燥，获得成品干粉，即完成利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂；其中步骤二中测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，抑菌效果不明显的均是指抑菌圈直径小于其空白试验的抑菌圈直径；步骤三中抑菌效果最佳的是指抑菌圈直径大于其空白试验的抑菌圈直径。本实施方式步骤一中离心的目的是弃除酸菜水下层杂质(主要为酸菜水细泥沙、 大分子量蛋白、纤维素)和死亡菌体(乳酸菌)的泥状混合物。本实施方式步骤一中抽真空水浴式旋转蒸发仪型号为Rotavapor R-210，购买自大连三杰科技发展有限公司。本实施方式步骤二盐析沉淀中的沉淀是指达到等电点后沉淀的蛋白混合物。
本实施方式步骤二中4°C下静止过夜，目的均是为了达到最佳盐析效果。本实施方式步骤四中收集洗脱液采用的标准为Iml/管。本实施方式步骤五中选择紫外吸光值>0.2的洗脱液，这样的洗脱液蛋白含量高，浓度大，不宜透光，光吸收较多。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中取500ml酸菜水在常温下5500r/min离心处理30min。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤三中加入到截留相对分子质量1500的透析袋内。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤四中 CMSephadex C-25层析凝胶经预处理的过程为蒸馏水浸泡lh，然后在80 100°C下加热 2h，再用蒸馏水搅拌洗涤，最后在100°C下加热蒸煮30min。其它步骤及参数与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法按以下步骤进行一、取500ml酸菜水在常温下6000r/min离心处理30min，取上清液， 采用抽真空水浴式旋转蒸发仪40°C减压浓缩5倍，得浓缩液；二、向IOOml浓缩液中加入质量浓度为30 %的硫酸铵并不断搅拌，盐析沉淀完全后于4°C下静止4h，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为30%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于 4°C下加入质量浓度为40%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下300001·/ min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为40%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为50%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为50%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为60%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下 30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为60%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径；三、收集步骤二中四次盐析抑菌效果最佳的离心管中的沉淀，加入到截留相对分子质量1500的透析袋内，以Tris-H3PO4为透析内液，蒸馏水作透析外液，4°C下透析，同时用氯化钡检测透析袋内没有BaSO4产生，即完成透析，获得透析后样品；四、CM Sephadex C_25层析凝胶经预处理后装入层析柱，将透析后样品用 Tris-H3PO4稀释上样后，洗脱液使用顺序是先用40ml的HAC-NaAC缓冲液，再用60ml浓度为0. 02mol/L的KCl溶液，收集洗脱液；五、将收集的洗脱液在^Onm下测定紫外吸光值，选择紫外吸光值彡0. 2的洗脱液，然后进行喷雾干燥，获得成品干粉，即完成利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂；
其中步骤二中测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，抑菌效果不明显的均是指抑菌圈直径小于其空白试验的抑菌圈直径；步骤三中抑菌效果最佳的是指抑菌圈直径大于其空白试验的抑菌圈直径。本实施方式步骤五中所得成品干粉，用浓度为0. 05mol/L的Tris-H3PO4溶解稀释成lmg/ml，以枯草芽孢杆菌为指示菌进行效价及抑菌活性检测，同时浓度为0. 05mol/L的 Tris-H3PO4做空白实验。观察抑菌圈，抑菌圈直径为15. 54mm，可见本实施方式步骤五中所得成品干粉具有纯度高、菌圈透亮、抑菌效果明显等优点；以浓度为IO6CfuAiL的枯草芽孢杆菌为指示菌，测得的小肽类抑菌物质的效价为1.57X 104IU/g，抑菌效力显著；采用上述方法对葡萄球菌、肠球菌、芽孢杆菌、利斯特氏菌、梭状芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌以及大肠杆菌分别进行抑菌活性检测，结果均为抑菌效力显著；本实施方式步骤五中所得成品干粉，使用垂直板稳压稳流电泳仪，结合 toea-SDS-PAGE凝胶电泳法测定分子量，结合制胶药剂配方(配方及用量见表1)分别制取分离胶和浓缩胶，经过电泳分析后，样品出现两条明显谱带，分子量分别为3510Da和 22000Da左右，即图1中黑框所指示谱带；与Nisin(乳链菌肽，它是由乳酸链球菌的某些菌株产生的一种小肽，命名为Nisin。由34个氨基酸组成，分子式为C143H228N42O37S7,但是其抑菌效果有限，只对革兰氏阳性菌有作用，不广谱抗菌)相似，具备蛋白质性质且分子量较小，属于肽类物质，有抑菌活性。表 权利要求
1.一种利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法，其特征在于利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法按以下步骤进行一、取500ml酸菜水在常温下5000 6000r/min离心处理30min，取上清液，采用抽真空水浴式旋转蒸发仪40°C减压浓缩5倍，得浓缩液；二、向IOOml浓缩液中加入质量浓度为30%的硫酸铵并不断搅拌，盐析沉淀完全后于 4°C下静止4h，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为30%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为40%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验， 同时用质量浓度为40 %的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为50%的硫酸铵并不断搅拌，于 4°C下静止过夜，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为50%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，将抑菌效果不明显的离心管中的上清液于4°C下加入质量浓度为60%的硫酸铵并不断搅拌，于4°C下静止过夜，然后4°C下30000r/min离心处理15min，分别标记离心管，然后取每管上清液和沉淀，分别采用琼脂扩散法进行抑菌试验，同时用质量浓度为60%的硫酸铵溶液做空白试验，测定上清液和沉淀的抑菌圈直径；三、收集步骤二中四次盐析抑菌效果最佳的离心管中的沉淀，加入到截留相对分子质量1200 1700的透析袋内，以Tris-H3PO4为透析内液，蒸馏水作透析外液，4°C下透析，同时用氯化钡检测透析袋内没有BaSO4产生，即完成透析，获得透析后样品；四、CMSephadex C-25层析凝胶经预处理后装入层析柱，将透析后样品用Tris-H3PO4 稀释上样后，洗脱液使用顺序是先用40ml的HAC-NaAC缓冲液，再用60ml浓度为0. 02mol/ L的KCl溶液，收集洗脱液；五、将收集的洗脱液在^Onm下测定紫外吸光值，选择紫外吸光值>0.2的洗脱液， 然后进行喷雾干燥，获得成品干粉，即完成利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂；其中步骤二中测定上清液和沉淀的抑菌圈直径，抑菌效果不明显的均是指抑菌圈直径小于其空白试验的抑菌圈直径；步骤三中抑菌效果最佳的是指抑菌圈直径大于其空白试验的抑菌圈直径。
2.根据权利要求1所述的一种利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法，其特征在于步骤一中取500ml酸菜水在常温下5500r/min离心处理30min。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法，其特征在于步骤三中加入到截留相对分子质量1500的透析袋内。
4.根据权利要求1或2所述的一种利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法，其特征在于步骤四中CM Sephadex C_25层析凝胶经预处理的过程为蒸馏水浸泡 lh，然后在80 10(TC下加热2h，再用蒸馏水搅拌洗涤，最后在100°C下加热蒸煮30min。
全文摘要
一种利用酸菜发酵液分离提取小肽类天然食品防腐剂的方法，它涉及一种提取食品防腐剂的方法。它解决了现有的酸菜水分离提取小肽类天然防腐剂的方法存在工艺不完善，产品的纯度、颜色、抑菌效果和产率不达标的问题。方法一、制备酸菜水浓缩液；二、浓缩液盐析沉淀；三、盐析抑菌效果最佳的沉淀，进行透析，获得透析后样品；四、装柱层析后收集洗脱液；五、收集的洗脱液测定紫外吸光值，选择紫外吸光值≥0.2的洗脱液，喷雾干燥获得成品干粉，即完成。本发明突破以往小分子肽类食品防腐剂的研究方法，更新技术指标，完善技术路线，细化工艺，产率达标，纯度高，颜色呈浅乳白色，具有广谱抑菌效果。
文档编号A23L3/3472GK102334721SQ20111020125
公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者原韬, 赵晓龙, 陈兵 申请人:陈兵