专利名称：一种检测黄牛fgf21基因单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测成纤维细胞生长因子 21 (fibroblast growth factor 21，FGF21)基因单核苷酸多态性(SNP)的 RFLP(限制性片段长度多态性)方法，具体地说，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判； 而直接测序技术成本又较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。 PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。成纤维细胞生长因子21 (fibroblast growth factor 21，FGF21)是一种主要的脂肪代谢调节因子，具有调控能量代谢的作用，在动物模型中作为一个代谢调控子的发现引起了研究者的关注。FGF21在肝脏中特异的表达，可通过作用于脂肪组织及胰腺来降低血糖和甘油三酯含量，从而预防饮食诱导的肥胖及胰岛素抵抗。对于黄牛育种来讲，分析FGF21 基因在牛脂肪代谢及能量平衡中的机制，对于提高黄牛的育肥效率、提高肉品质具有重要的理论意义。国内外未见关于FGF21基因遗传变异的研究，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如体重等)关联的研究仍是空白。由于FGF21基因功能涉及体重等生长性状，本发明提供的检测方法为FGF21基因的SNP与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
发明内容
本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛FGF21基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明是通过以下技术方案来实现一种快速检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，以包含FGF21基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛TOF21基因(全长1459bp，含 3个外显子和2个内含子)，发现4个SNP位点；针对这4个SNP位点分别设计引物对F159、 F297、F940、Fl 151，依次人为引入Sal I、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，进行PCR扩增，用限制性内切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分别酶切该四对引物的PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、 第940位、第1151位的单核苷酸多态性。所述的引物对Pl为上游引物5'ATGGGCTGGGACGAGGCCAAGTTC 3'，下游引物5‘ CAAACCAAGCCTGACCAACATCAAA 3 ‘；所述的引物对P2为上游引物5‘ GGAAGCTGTACGGATCGGTGAG 3 ‘，下游引物5,CTCCTTTCTCAGCTTTATCGTCTAGG 3'；所述的引物对P3为上游引物5'CCTGCCTCCGTGGTTTTGAG 3'，下游引物5‘ TCAAGAAGTGTAGCTGGGGCTTCG 3 ‘。将该三对引物的PCR产物送测序，根据测序结果及突变情况，在黄牛FGF21基因第 159位、第297位、第940位和第1151位处重新设计引物，并依次人为引入SalI、XhoI、XbaI、 MspI酶切位点，以引物对F159、F297、F940、F1151为引物，PCR扩增黄牛FGF21基因所述的引物对F159为上游F159-Sall :5' CCGCCAGCGGTACCTCTACACGGTCGA 3'，下游Rl59:5' TCCAAGAGACCTGAGGGGAGAAAGTGGG 3'；所述的引物对F297为上游F262-XhoI :5' CCTGAAGCAGTAGGGAATTGGGGCCTCG 3'，下游R262:5' CACCGATCCGTACAGCTTCCCATCTGGC 3'；所述的引物对F940为上游F940:5' CCTGGCTCATGCTGGGCGAAGGGTC 3'，下游R940-Xbal :5' CGGAGGCAGGTCCCTCCTTAACCTCTAG 3'；所述的引物对Fl 151为上游Fl 151:5' AGACCTAGACGATAAAGCTGAGAAAGGAGG 3'，下游R1151-Mspl :5' AAAGTGCAGCTGCGGGGATGAGAGCC 3'。 用限制性内切酶Sail、XhoI, XbaI、MspI分别酶切上述四对引物的PCR扩增产物， 再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定中国黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第1151位的单核苷酸多态性。所述的PCR扩增反应程序为95°C 预变性 5min ；30 34 个循环 94°C变性 30s，66. 8°C 退火 30s，72°C 延伸 40s ； 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5%。所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位的单核苷酸多态性为TT基因型表现为244bp条带；TC基因型表现为244bp、221bp和23bp条带；CC基因型表现为221bp和23bp条带。第297位的单核苷酸多态性为CC基因型表现为205bp条带；CG 基因型表现为205bp、180bp和25bp条带；GG基因型表现为180bp和25bp。第940位的单核苷酸多态性为CC基因型表现为207bp条带；CT基因型表现为207bp、179bp和28bp条带；TT基因型表现为179bp和28bp。第1151位的单核苷酸多态性为CC基因型表现为151bp 和27bp条带；CT基因型表现为178bp、151bp和27bp条带；TT基因型表现为178bp。本发明根据FGF21基因的序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛FGF21基因的完整序列。与NCBI 公布的序列进行比较，发现在第159位、第297位、第940位和第1151位存在SNP多态性。针对上述4处SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增，特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。本发明对5个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛部分生长性状(如体重等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。
图1为牛FGF21基因的结构图及突变位点所在的位置。图2为黄牛FGF21基因SNP多态性测序图，其中图2a、2b、2c、2d中双峰分别为黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位SNP位点。 图3为黄牛FGF21基因包含F159位点的PCR产物电泳图及酶切结果图，其中图3a 为PCR产物电泳图，3b为酶切结果图。图4为黄牛FGF21基因包含F297位点的PCR产物电泳图及酶切结果图，其中图4a 为PCR产物电泳图，4b为酶切结果图。图5为黄牛FGF21基因包含F940位点的PCR产物电泳图及酶切结果图，其中图5a 为PCR产物电泳图，5b为酶切结果图。图6为黄牛FGF21基因包含F1151位点的PCR产物电泳图及酶切结果图，其中图 6a为PCR产物电泳图，6b为酶切结果图。图7为本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计示意图，图7a、7b、7c、7d分别检测是黄牛FGF21基因包含第159位、第297位、第940位、第1151位多态位点的PCR引物设计方案。其中大写部分为引物序列，斜体部分为引入突变，黑体加粗部分为SNP位点，方框部分为形成的酶切位点。
具体实施例方式本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛TOF21基因第159位、第297位、第940位、第 1151位的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。A、设计黄牛FGF21基因的PCR引物黄牛FGF21基因全长1459bp，包含3个外显子和2个内含子。以NCBI所公布的牛 (NC_007316)序列为参考，利用Primer 5. 0设计3对引物将FGF21基因全长(含3个外显子和2个内含子，共11459bp)分3段扩增，引物如下所述的引物对Pl为上游引物5'ATGGGCTGGGACGAGGCCAAGTTC 3'，
下游引物5 ‘ CAAACCAAGCCTGACCAACATCAAA 3 ‘；所述的引物对P2为上游引物5'GGAAGCTGTACGGATCGGTGAG 3'，下游引物5,CTCCTTTCTCAGCTTTATCGTCTAGG 3'；所述的引物对P3为上游引物5'CCTGCCTCCGTGGTTTTGAG 3‘，下游引物5'TCAAGAAGTGTAGCTGGGGCTTCG 3'。以黄牛基因组为模板，用上述3对引物扩增牛FGF21基因的全长(含3个外显子和 2个内含子，共1459bp)，将PCR产物送测序，结合测序结果和NCBI所公布的牛(NC_007316) 序列发现4处突变第一外显子存在一处同义突变(NC_007316 :159T > C)，第一内含子存在一处突变(NC_007316 :297C > G)，第二内含子存在二处突变(NC_007316 :940C > Τ, 1151C>T)。经过分析，以上4处SNP均不存在天然酶切位点，因此，通过设计引物对F159、 F297、F940、F1151在四个SNP处依次人为引入Sail、XhoI、XbaI、MspI酶切位点。B、以引物对F159、F297、F940、F1151进行PCR扩增待测黄牛的FGF21基因片段1、黄牛样本的采集本发明具体以5个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1 表1黄牛样本的采集
权利要求
1.一种快速检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于以包含FGF21基因的待测黄牛基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛FGF21基因，发现4个SNP位点；针对这4个SNP 位点分别设计弓I物对Fl59、F297、F940、Fl 151，进行PCR扩增，用限制性内切酶SalI、XhoI、 XbaI,Msp I分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于，以包含 FGF21基因的黄牛基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛FGF21基因。将PCR产物送测序，根据突变情况重新设计引物对F159、F297、F940、F1151，依次引入Sail、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，PCR扩增黄牛FGF21基因；所述的引物对F159为上游 F159-Sall :5' CCGCCAGCGGTACCTCTACACGGTCGA 3'， 下游 Rl59:5' TCCAAGAGACCTGAGGGGAGAAAGTGGG 3'； 所述的引物对F297为上游 F262-XhoI :5' CCTGAAGCAGTAGGGAATTGGGGCCTCG 3'， 下游 R262:5' CACCGATCCGTACAGCTTCCCATCTGGC 3'； 所述的引物对F940为上游 F940:5' CCTGGCTCATGCTGGGCGAAGGGTC 3'， 下游 R940-Xbal :5' CGGAGGCAGGTCCCTCCTTAACCTCTAG 3'； 所述的引物对F1151为上游 F1151 5 ‘ AGACCTAGACGATAAAGCTGAGAAAGGAGG 3 ‘， 下游 R1151-Mspl :5' AAAGTGCAGCTGCGGGGATGAGAGCC 3'。用限制性内切酶SalI、XhoI、XbaI、MSpI分别酶切该四对引物的PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第 1151位的单核苷酸多态性。
3.如权利要求1所述的检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3. 5%。
4.如权利要求1所述的检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于，第159位的单核苷酸多态性为TT基因型表现为244bp条带，TC基因型表现为244bp、221bp和23bp条带，CC基因型表现为221bp和23bp条带；第297位的单核苷酸多态性为CC基因型表现为 205bp条带，CG基因型表现为205bp、180bp和25bp条带，GG基因型表现为180bp和25bp ； 第940位的单核苷酸多态性为CC基因型表现为207bp条带，CT基因型表现为207bp、179bp 和28bp条带，TT基因型表现为179bp和28bp ；第1151位的单核苷酸多态性为CC基因型表现为151bp和27bp条带，CT基因型表现为178bp、151bp和27bp条带，TT基因型表现为 178bp。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，以包含FGF21基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FGF21基因，发现4个SNP位点；针对这4个SNP位点分别设计引物对F159、F297、F940、F1151，依次人为引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，进行PCR扩增，用上述四种限制性内切酶分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的单核苷酸多态性。由于FGF21基因功能涉及体重等生长性状，本发明提供的检测方法为FGF21基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
文档编号C12Q1/68GK102296110SQ201110201228
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者孙晓梅, 李明勋, 滑留帅, 王璟, 蓝贤勇, 陈宏 , 马伟 申请人:西北农林科技大学