专利名称：人鼠嵌合型cd4质粒及其多抗在抑制hiv感染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种嵌合型质粒，具体地说是人鼠嵌合型CD4质粒，以及由该质粒制备得到的多抗。
背景技术：
近20年来，HIV-I疫苗领域研究结果显示，通过对HIV-I，SIV和SHIV的研究强烈显示τ细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫两者缺一不可。抗体可以保护机体免受病毒(如麻疹病毒，肝炎病毒和流感病毒等)感染，但是，对于像HIV-I这样的高度变异的病毒来说，很难通过免疫获得具有广谱中和活性的抗体。HIV-I中和抗体靶点主要是病毒膜蛋白三聚体和易感靶细胞表面受体，以阻止HIV-I病毒感染靶细胞。尽管HIV-I通过膜蛋白突变、糖基化位点的掩盖、蛋白之间的相互作用，以及重要功能区的构象掩盖等方法逃避宿主免疫系统，但是仍然有6个广谱中和抗体通过识别HIV-I膜蛋白相对保守区而产生。与HIV-I膜蛋白高度变异相比较，细胞受体CD4及其辅助受体高度保守的特性将成为临床实验中治疗型抗体的重要靶点，成为HIV-I进入细胞的关键。有报道表明，CCR5抑制剂maraviroc仅阻止R5嗜性HIV-I感染靶细胞，对X4和双嗜性的病毒无效。而针对CXCR4 为靶点的抗体研究则更加困难。在近期HIV疫苗研究过程中，关于CD4单克隆抗体研究表明其具有较强的中和多亚型病毒株的能力。⑶4mAb ibalizumab (即TNX-355和Hu5A8)是人源化IgG4单克隆抗体，在临床I期和II期实验中显示其抗病毒活性。本文通过构建人 CD4及人与鼠嵌合型质粒DNA免疫小鼠，通过多抗血清及单克隆抗体抗病毒能力的筛选，获得具有广谱中和能力的单抗。希望为将来的预防性和治疗性疫苗提供更多的理论及实验基石出。
发明内容
本发明的目的是提供一种人鼠嵌合型CD4质粒。本发明的第二目的在于提供利用上述质粒制备得到的对HIV假病毒具有明显抑制效果的多克隆抗体。本发明的再一目的在于提供所述多克隆抗体的用途。本发明的发明思路为HIV感染靶细胞首先通过与其表面CD4受体和辅助受体结合，因此如果能够阻断HIV与CD4受体的结合，则能有效地抑制HIV感染，我们设计了针对人CD4受体V1V2区域的人鼠嵌合型质粒，通过DNA免疫希望能够获得具有抑制HIV功能的多克隆抗体，为探索HIV疫苗和药物研发新靶点提供理论和实验依据。本发明采用如下具体技术方案一种人鼠嵌合型⑶4质粒，所述质粒的序列如SEQ ID No. 8所示。上述质粒在制备介导HIV病毒感染药物中的应用。上述的人鼠嵌合型CD4质粒的制备方法，所述方法包括如下步骤(1)分别从(ihost细胞和小鼠脾细胞提取总RNA ；(2)利用Pl、P2扩增人总RNA得到人CD4, P3、P4扩增鼠总RNA得到鼠CD4 ；
(3)P3、P10扩增鼠CD4得到鼠CD4信号肽；P1UP7扩增人CD4得到人CD4V1V2区序列；利用P3、P7扩增鼠⑶4信号肽及人⑶4V1V2区获得鼠⑶4信号肽与人⑶4V1V2区嵌合产物；(4)将步骤C3)获得的产物经三轮PCR扩增最终得到人鼠嵌合型CD4质粒；第一轮PCR扩增引物为P3、P8，第二轮PCR扩增引物为P9、P4，第三轮PCR扩增引物为P3、P4。所述步骤(3)中PCR 条件为:94°C 5min ；94°C 30s、55°C退火 40s，72°C 延伸 lmin， 20个循环；72 °C延伸8分钟。所述步骤(4)中PCR 条件为94°C 5min ；94°C 40s、55°C退火 50s，72°C延伸 90s，25 个循环；72 °C延伸8分钟。一种人鼠嵌合型CD4多克隆抗体的制备方法，所述方法包括下述步骤使用上述的人鼠嵌合型⑶4质粒DNA免疫4周龄BALB/C小鼠，分别在第1、21、35、49天小鼠双后肢肌肉注射100 μ L lmg/mL权利要求1所述的质粒DNA，5mm宽双电极针60V电刺激注射部位， 每次电刺激持续50-ms，共6次，免疫后10天收小鼠血清。上述的方法制备得到的人鼠嵌合型CD4多克隆抗体。上述的多克隆抗体在制备抑制HIV假病毒药物中的用途。一种真核表达载体，其是利用上述的质粒与载体pcDNA3. l/V5-His-T0P0构建而成的。本发明的有益效果本发明所述质粒制备方法简便，实验证实本发明所构建质粒通过与辅助受体共转染细胞，可以有效介导HIV病毒感染，免疫小鼠后收集的多抗稀释100倍后对不同亚型的HIV假病毒的抑制率为60-90%，显示出良好的广谱中和能力。本发明的可实施性和突出实质性特点以及积极效果可通过以下实例得以体现，但不限制其范围。
图1为h⑶4、mhDlD2m、mhD2m和mCD4氨基酸序列比对。构建真核表达质粒 pcDNA3. l-hCD4、pcDNA3. l_mhDlD2m、pcDNA3. l_mhD2m 和 pcDNA3. l_mCD4 并测序，将人 CD4、 人鼠嵌合型CD4和鼠CD4氨基酸序列进行比对。图2为人鼠嵌合型质粒DNA免疫制备多克隆抗体对HIV-I假病毒的抑制作用(A) 和对人CD4的特异性结合能力(B)。CD4结合力FACS检测Hela阴性对照细胞与免疫前阴性对照血清反应曲线用黑色表示，Hela阴性对照细胞与人鼠嵌合型质粒免疫后血清反应曲线用红色表示，TZM-bl阳性细胞与免疫前阴性对照血清反应曲线用绿色表示，TZM-bl阳性细胞与人鼠嵌合型质粒免疫后血清反应曲线用蓝色表示。
具体实施例方式实施例1人鼠嵌合型⑶4质粒的构建1.分别从(ihost细胞((ihost细胞为公知细胞，可购买得到，是HOS细胞稳定表达人CD4、CCR5和CXCR4的细胞系)和小鼠脾细胞(细胞源于新鲜的小鼠脾细胞)用TRIzol 提取总RNA ；方法如下
TRIzol法提取细胞总RNA(1)约IO6个细胞，使用无RNase吸头加入ImL TRIzol，使其作用充分后吹打；(2)室温静置5min，将其转入无RNase 1. 5mL离心管中；(3)加入氯仿0. 2mL,吹打15s，室温静置!Min ；下，12000rpm离心，15min，可见到溶液分为三相。上层无色水相，溶有RNA ； 中间相，溶有DNA ；下层红色酚/氯仿相，溶有蛋白质；(5)吸水相至一新1. 5mL离心管中；(6)加0. 5mL异丙醇，4°C下静置lOmin，同时配75%的乙醇10mL，即无水乙醇 7. 5mL 力口无 RNase /K 2. 5mL ；(7)4°C下低于12000rpm离心lOmin，弃尽上清液；(8)加lmL75%乙醇，弹勻沉淀；(9)4°C下低于7500rpm离心5min，弃尽上清液；(10)将含有沉淀的1. 5mL离心管放入37°C温箱中，烘干沉淀；(11)加入 13μ L无 RNase 水，57°C 水浴 lOmin，溶解沉淀；(12)加入 1 μ L 无 RNase 的 DNase，37°C水浴 20min，去除杂质 DNA ；(13)放入4 °C冰箱中备用。利用Pl、P2扩增人总RNA得到人⑶4，P3、P4扩增鼠总RNA得到鼠⑶4 ；RT-PCR第一步反应条件42°C，30min ；第二步反应条件94°C 5min ；94°C变性50s，55°C退火lmin，72°C 延伸2min，35个循环；72°C延伸IOmin0最终得到人CD4核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 最终得到小鼠CD4核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。2.应用引物？3冲10冲11、？7、？8、？9、？4(引物序列见表1)经 overlappingPCR 扩增鼠⑶4信号肽与人⑶4 V1V2区嵌合产物；2. 1以鼠CD4为模板，利用引物P3、PlO PCR扩增鼠CD4信号肽，得到SEQID No. 3 所示序列。PCR反应条件94°C 5分钟；94°C 30s、55°C退火40s，72°C延伸1分钟，20个循环；72 °C延伸8分钟。2. 2以人CD4为模板，利用P11、P7PCR扩增人CD4 V1V2区，得到SEQ IDNo. 4所示序列)；PCR反应体系50 μ 1，见表1 ；PCR反应条件94°C 5分钟；94°C 30秒、55°C退火40s， 72°C延伸1分钟，20个循环；72°C延伸8分钟。2. 3利用P3、P7PCR扩增上述两个步骤获得的产物，得到人鼠嵌合型⑶4，序列如 SEQ ID No. 5所示；PCR反应体系50 μ 1，见表1 ；PCR反应条件94°C 5分钟；94°C 30秒、55°C 退火40s，72°C延伸1分钟，20个循环；72°C延伸8分钟。3.经overlapping PCR获得人鼠嵌合型CD4全长(人CD4的V1V2区替换小鼠CD4 的V1V2区)3. 1P3、P8扩增步骤2. 3获得的鼠⑶4信号肽与人⑶4 V1V2区嵌合产物，得到序列如SEQ ID No. 6所示；PCR反应体系50 μ 1，见表1。PCR反应条件94°C 5分钟；94°C 40s、 55°C退火50s，72°C延伸90s，25个循环；72°C延伸8分钟。3. 2以SEQ ID No. 6为模板，利用P9、P4PCR扩增鼠CD4 V3V4区序列，最终得到序列如SEQ ID No. 7所示；PCR反应体系50 μ 1，见表1。PCR反应条件94°C 5分钟；94°C 40s、 55°C退火50s，72°C延伸90s，25个循环；72°C延伸8分钟。
3. 3以上述两个步骤获得的产物为模板，利用引物P3、P4PCR扩增得到人鼠嵌合型 CD4全长序列，最终得到人鼠嵌合型CD4质粒，所述质粒的序列如SEQ ID No. 8所示。PCR反应体系50 μ 1，见表1。PCR反应条件94°C 5分钟；94°C 40s、55°C退火50s， 72°C延伸90s，25个循环；72°C延伸8分钟。表IPCR 反应体系(5O μ L)
权利要求
1.一种人鼠嵌合型⑶4质粒，其特征在于，所述质粒的序列如SEQ ID No. 8所示。
2.权利要求1所述质粒在制备介导HIV病毒感染药物中的应用。
3.权利要求1所述的人鼠嵌合型CD4质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(1)分别从(^host细胞和小鼠脾细胞提取总RNA；(2)利用PI、P2扩增人总RNA得到人⑶4，P3、P4扩增鼠总RNA得到鼠⑶4； (3P3、P10扩增鼠⑶4得到鼠⑶4信号肽；P11、P7扩增人⑶4得到人⑶4 V1V2区序列；利用P3、P7扩增鼠⑶4信号肽及人⑶4 V1V2区获得鼠CD4信号肽与人⑶4 V1V2区嵌合产物；(4)将步骤C3)获得的产物经三轮PCR扩增最终得到人鼠嵌合型CD4质粒；第一轮PCR 扩增引物为P3、P8，第二轮PCR扩增引物为P9、P4，第三轮PCR扩增引物为P3、P4 ；所述引物Pl序列如SEQ ID No. 9所示，引物P2序列如SEQ ID No. 10所示，引物P3序列如SEQ ID No. 11所示，引物P4序列如SEQ ID No. 12所示，引物P7序列如SEQ ID No. 13 所示，引物P8序列如SEQ ID No. 14所示，引物P9序列如SEQ ID No. 15所示，引物PlO序列如SEQ ID No. 16所示，引物Pll序列如SEQ ID No. 17所示。
4.权利要求3所述的人鼠嵌合型CD4质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中 PCR条件为:94°C 5分钟；940C 30s、55°C退火40s，72°C延伸1分钟，20个循环；72°C延伸8 分钟。
5.权利要求3所述的人鼠嵌合型CD4质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤中 PCR条件为94°C 5分钟；94°C 40s、55°C退火50s，72°C延伸90s，25个循环；72°C延伸8分钟。
6.一种人鼠嵌合型CD4多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤 使用权利要求1所述的人鼠嵌合型CD4质粒DNA免疫4周龄BALB/C小鼠，分别在第1、21、 35,49天小鼠双后肢肌肉注射100 μ L lmg/mL权利要求1所述的质粒DNA，5mm宽双电极针 60V电刺激注射部位，每次电刺激持续50-ms，共6次，免疫后10天收小鼠血清。
7.权利要求6所述的方法制备得到的人鼠嵌合型CD4多克隆抗体。
8.权利要求7所述的多克隆抗体在制备抑制HIV假病毒药物中的用途。
9.一种真核表达载体，其特征在于，其是利用权利要求1所述的质粒与载体pcDNA3. 1/ V5-Hi s-TOPO构建而成的。
全文摘要
本发明公开了一种人鼠嵌合型CD4质粒，所述质粒的序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述质粒制备方法简便，实验证实本发明所构建质粒通过与辅助受体共转染293T细胞，可以有效介导HIV病毒感染，免疫小鼠后收集的多抗稀释100倍后对不同亚型的HIV假病毒的抑制率为60-90％，显示出良好的广谱中和能力。
文档编号C12N15/79GK102321653SQ20111020120
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者刘志英, 史宣玲, 张林琦, 李岚 申请人:清华大学, 首都医科大学附属北京佑安医院