专利名称：一种黄牛tmem18基因的单核苷酸多态性检测方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛TMEM18基因第3843位和第3873位单核苷酸多态性的检测方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SWs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs (cSNPs)、基因周边SNPs (pSNPs)和基因间 SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的 1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响， cSNPs又可分为两种一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs 可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见， 故SWs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现 SNPs 即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法， 但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是， PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时， 检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。跨膜蛋白18(TMEM18)基因是通过GWA方法鉴定的与人类肥胖相关的重要基因， 同 FTO 基因和 MC4R 基因一样，TMEM18 基因起源很早(Cristen J Wilier, Elizabeth K Speliotes, Ruth J F Loos, et al. Six new loci associated with body mass index hightlight a neuronal influence on body weight regulation. Nature genetics 2008 ； 41 :25-34.)。TMEM18基因主要是在神经细胞中大量表达，其它组织肝脏，肺，脑垂体以及卵巢附睾中也有表达。黄牛TMEM18基因定位于1号染色体上，由5个外显子和4个内含子组成， 它的⑶S区长419bp，共编码140个氨基酸。TMEM18基因与皮下脂肪调节相关(Funda E. Orkunoglu-Suer，Brennan T. Harmon, et al. MC4R Variant Is Associated With BMI but Not Response to Resistance Training in Young Females. Obesity 2011 ；19 :662-666)。TMEM18蛋白是拥有三个跨膜螺旋结构域的膜蛋白(Markus Sallman Almen, Karl JV Nordstrom, Robert Fredriksson, et al. Mapping the human membrane proteome :a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC biology 2009 ;7 :50.)有关该蛋白功能的报道非常少，Jaana Jurvansuu等(Jaana Jurvansuu, Ying Zhao, Doreen S. Y. Leung, et al ；Transmembrane Protein 18 Enhances the Tropism of Neural Stem Cells for Glioma Cell. Cancer research 2008 ；68 4614-4622.)的研究显示，内源性的TMEM18蛋白对于细胞迁移有重要的作用，该蛋白的过表达将会促进刺激迁移信号途径的应答。现在关于TMEM18基因的研究主要集中在对人类及小鼠肥胖的影响方面(Cathy E Elks，John R B Perry, Patrick Sulem，et al ；Thirty newloci for age at menarche identified by a meta-analysis of genenome-wide association studies. Nature genetics 2010;42:1077-1085)。目前的研究发现，TMEM18基因的多态性对于不同人种、 不同年龄阶段的肥胖都有一定的影响(Cathy E Elks，John R B Perry，Patrick Sulem, et al ；Thirty new loci for age at menarche identified by a meta-analysis of genenome-wide association studies. Nature genetics 2010 ；42 :1077-1085.)，该基因与牛生长性状关联分析研究还未见报道。
发明内容
本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛TMEM18基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记， 从而加快良种选育速度。本发明是通过以下技术方案来实现一种检测黄牛TMEM18基因单核苷酸多态性的方法，以包含TMEM18基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，分别以引物对IF和2F为引物，PCR扩增黄牛TMEM18基因；分别用限制性内切酶XspI和MluI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛TMEM18基因第3843和3873位的单核苷酸多态性；1.所述的引物对IF为:正向上游引物5，-GGCATGTTCATCTCCCTTGT-3，，反向下游引物5，-GCCCTGCACTGCTGTTTGTCC-3，，所述的PCR扩增反应程序为95°C预变性5min ；30个循环94°C变性30s，66°C退火 45s，72°C延伸 45s ；72°C终延伸 IOmin0所述的琼脂糖凝胶电泳的质量浓度为1. 5%。所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛TMEM18基因第3843位的单核苷酸多态性为AA基因型表现为247和的条带；GG基因型表现为412bp的条带；AG基因型表现为412、247和165bp的条带。2.所述的引物对2F为:正向上游引物5，-AGCAGCCTGCTGTCCATACACGC-3，，
反向下游引物5，-GGGAGGGCCCTGCACTGCTGTTAG-3，，所述引物对的上游引物为引入MluI错配的引物。所述的PCR扩增反应程序为94°C预变性5min ；30个循环94°C变性30s，68°C退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C终延伸 IOmin0所述的琼脂糖凝胶电泳的质量浓度为3. 0%。所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛TMEM18基因第3873位的单核苷酸多态性为AA基因型表现为160bp条带；GG基因型表现为143和17bp条带；AG基因型表现为160、 143和17bp条带。与现有技术相比，本发明有以下有益的技术效果本发明提供的黄牛TMEM18基因单核苷酸多态性检测方法，第3843位G到A的转换突变造成一个)(spl自然酶切位点的产生，而针对第3873位G到A的转换突变，通过引物设计人为的在上游引物的5’端引入碱基错配，当由A突变成G时，PCR扩增TMEM18基因后在错配位置形成限制性内切酶MluI识别位点，而突变没有发生时，PCR扩增TMEM18基因后不能形成MluI识别位点；通过电泳检测分型可以准确、快速、方便的同时检测到TMEM18基因在第3843位和第3873位的单核苷酸多态性。与现有技术相比，本发明把测序技术筛查SNP和CRS-RFLP技术结合起来解决了 SSCP的不稳定性和普通RFLP的局限性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用在DNA水平上筛查和检测与黄牛生产性状密切相关的遗传标记，可用于黄牛的分子育种。本发明对5个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛部分生长性状(初生重、体重和日增重)进行关联分析，为TMEM18基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
图1为黄牛TMEM18基因，以引物对IF扩增的包括XspI酶切位点的PCR产物电泳图，目的条带为412bp。图2为黄牛TMEM18基因3843位呈现出多态性的PCR扩增产物测序图；图3为黄牛TMEM18基因XspI酶切的电泳图；AA基因型表现为247和的条带；GG基因型表现为412bp的条带；AG基因型表现为412、247和的条带。图4为黄牛ΤΜΕΜ18基因，以引物对2F扩增的包括引入错配形成的MluI酶切位点的PCR产物电泳图，目的条带为160bp。图5为黄牛TMEM18基因3873位呈现出多态性的PCR扩增产物测序图；图6为黄牛TMEM18基因MluI酶切的电泳图；AA基因型表现为160bp条带；GG基因型表现为143和17bp条带；AG基因型表现为160、143和17bp条带。
具体实施例方式本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛TMEM18基因第3843位和第3873位密码子突变可能产生编码蛋白表达水平发生变化的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。1、黄牛TMEM18基因含第五外显子区域PCR引物的设计以NCBI所公布的牛(NW_003099175. 1)序列为参考，利用I^rimer 5. 0设计能够扩增包含黄牛TMEM18基因第五外显子区域的PCR引物，其引物序列如下正向引物5，-TAGGTCCAGTTCTGACCACG-3，，反向引物5，-GCACTGAAGGGCACAAAGAG-3，，以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛TMEM18基因(NW_001493824. 2 序列)第五外显子区域的基因片段；对扩增的片段进行测序鉴定后，发现当第3843bp的G 突变为A时，导致编码氨基酸密码子由GGC突变为AGC，从而形成了 Gly-Ser的错义突变； 并且这一突变形成了限制性内切酶XspI的酶切位点。而第3873位的突变无自然酶切位点形成，不能通过直接酶切检验，而如果在第3873位处人工设计PCR引物错配，由G错配为 C ；当该位点由A突变成G时，2F引物扩增TMEM18基因产物的第3869bp 3875bp序列为 ACGCGT，形成了限制性内切酶MluI的酶切位点，而突变没有发生时，PCR扩增TMEM18基因后不能形成MluI识别位点；这样就可以对两个位点的SNPs多态性进行检测。2、以引物IF对和2F对分别进行PCR扩增待测黄牛的TMEM18基因片段(1)、黄牛样本的采集本发明具体以5个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1 河南南阳牛025)，陕西秦川牛019)，河南平顶山市郏县红牛(389)；山东鲁西牛(165)； 吉林草原红牛(220)。表1黄牛样本的采集
权利要求
1.一种黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤以包含黄牛TMEM18基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对IF为引物，PCR扩增黄牛TMEM18基因，所述的引物对IF为，正向上游引物5，-GGCATGTTCATCTCCCTTGT-3，，反向下游引物5，-GCCCTGCACTGCTGTTTGTCC-3，，用XspI限制性内切酶消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的TMEM18基因第3843位的单核苷酸多态性；以包含黄牛TMEM18基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对2F为引物，PCR扩增黄牛TMEM18基因，所述的引物对2F为正向上游引物5’ -AGCAGCCTGCTGTCCATACACGC-3，，反向下游引物5，-GGGAGGGCCCTGCACTGCTGTTAG-3，，用MluI限制性内切酶消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的TMEM18基因第3873位的碱基多态性。
2.如权利要求1所述的黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， 以引物对IF为引物进行PCR扩增的反应程序为95°C预变性5min ；35个循环的94°C变性 30s，66°C退火 45s，72°C延伸 45s ；72°C延伸 IOmin0
3.如权利要求1所述的黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， 所述的XspI限制性内切酶识别的酶切位点为第3843位所在的酶切位点。
4.如权利要求1所述的黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， XspI酶切后所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1. 5%。
5.如权利要求1所述的黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， 以引物对2F为引物进行PCR扩增的反应程序为95°C预变性5min ；30个循环的94°C变性 30s，68°C退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C延伸 IOmin0
6.如权利要求1所述的黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， 所述的MluI限制性内切酶识别的酶切位点为第3873位所在的酶切位点。
7.如权利要求1所述的黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， MluI酶切后所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3. 0%。
8.如权利要求1所述的黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， 所述的黄牛TMEM18基因第3843位的单核苷酸多态性为AA基因型表现为247和的条带；GG基因型表现为412bp的条带；AG基因型表现为412、247和的条带。
9.如权利要求1所述的黄牛ΤΜΕΜ18基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， 所述的黄牛ΤΜΕΜ18基因第3873位的单核苷酸多态性为ΑΑ基因型表现为160bp条带；GG 基因型表现为143和17bp条带；AG基因型表现为160、143和17bp条带。
全文摘要
本发明公开了一种检测黄牛TMEM18(transmembrane protein 18)基因单核苷酸多态性的方法，其基因多态性包括在黄牛TMEM18基因第3843位为A或G的碱基多态性；在黄牛TMEM18基因第3873位为G或A的碱基多态性。上述黄牛TMEM18基因的单核苷酸多态性为以包含TMEM18基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对1F和2F为引物，PCR扩增黄牛TMEM18基因；分别用限制性内切酶XspI和MluI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛TMEM18基因第3843位和第3873位的单核苷酸多态性；该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生产性状密切相关的分子遗传标记，以便于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
文档编号C12Q1/68GK102251038SQ201110201229
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者刘栋, 孙晓梅, 李爱民, 胡沈荣, 蓝贤勇, 陈宏 , 马云, 马伟 申请人:西北农林科技大学