专利名称：肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种肺炎支原体检测技术领域，具体涉及一种肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，以及采用该试剂盒检测肺炎支原体的检测方法。
背景技术：
肺炎支原体(myeoplasmapneumoniae, Mp)是介于细菌和病毒之间、兼性厌氧、能独立生活的最小微生物，经呼吸道传播，是呼吸道感染的主要病原体，其引起的支原体肺炎占非细菌性肺炎的1/3以上。临床检测肺炎支原体(MP)感染的方法有以下几种
I、检测血清中的Mp抗体本法快速简便，阳性率高,但Mp抗体是人体受Mp感染刺激的产物，感染后数周才能检出，可维持数月至数年。因此，Mp抗体阳性结果与Mp感染不同步；2、简单鉴别培养本法培养基中含葡萄糖，仅靠分解葡萄糖产酸使指示剂变色原理对Mp进行鉴别，因许多微生物(包括非致病支原体)也能葡萄糖产酸，故检测假阳性常见；3、选择鉴别培养本法培养基中加有美兰和葡萄糖，因只有Mp等极少数微生物能在含美兰的培养液中生长而分解葡萄糖产酸，故结果较准确，故国外实验室多推荐采用；4、Mp基因检测(PCR法)本法直接检测Mp的基因，为临床提供Mp感染的直接依据，但对人员、环境、设备、试剂要求高，稍不慎则易出现假阳性及假阴性；简单培养+药敏试验法如专利CN101748187A、CN101555517A，由培养液和药敏微孔板组成。培养液属简单鉴别培养液，抑菌成分单一；药敏微孔板参照检测泌尿系统感染支原体(解脲支原体、人型支原体)使用的方法制备，不含选择鉴别(如美兰还原耐受)功能，难于无法避免细菌、真菌、其它支原体引起的假阳性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种检测周期短、且能够避免假阳性的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒以及检测方法。为实现上述发明目的，本发明所采用技术方案如下一种肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括培养管，在所述培养管内盛装有为Mp生长提供基本营养的基础液、提高Mp生长速度的促生长剂、指示MP生长进度的生长指示剂、以及抑制其他杂菌生长的杂菌抑制剂；药敏鉴别板，该药敏鉴别板包括鉴别区和药敏试验区；所述鉴别区包括四个鉴别微孔，所述四个鉴别微孔分别盛装有干燥的精氨酸(Arg)、氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)、美兰(MB)、以及β-内酰胺类药物(β-Lac);所述药敏试验区包括14组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔，在各组药敏检测单元内分别盛装有红霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、四环素、强力霉素、米诺环素、罗红霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、克拉霉素、斯帕沙星、环丙沙星、以及壮观霉素，其同一组药敏检测单元的两个药敏微孔中盛装的药物浓度不相同；以及盛装有无菌矿物油的容器单元。所述肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述基础液为支原体培养基基础、Hayflick培养基、改良马丁培养基中的任一种。所述肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述促生长剂包括主成分和添加成分；所述主成分为浓度5% 20%的马血清或小牛血清；所述添加成分为酵母浸出粉、丙酮酸钠、半胱氨酸、异抗坏血酸、卵黄液中的一种或几种。所述肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述生长指示剂包括葡萄糖、酚红、以及脱氢酶色原底物。
所述肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述杂菌抑制剂包括万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B、以及甲氧苄氨嘧啶(TMP)。一种使用所述试剂盒检测肺炎支原体的检测方法，包括以下步骤将样本拭子放入培养管的培养液中充分洗脱挤干；再将培养液以100微升每孔(ul/孔)的量加入至药敏鉴别板的微孔中；将矿物油以I滴每孔的量添加至各个微孔中；将试剂盒放置在35°C 37°C的环境下培养24 72小时，根据微孔颜色变化判定结果。结果判断如下鉴别区Arg-TTC-MB_ β -Lac表现为黄-红-黄绿-黄为Mp，否则为其它支原体；药敏区同种药物低浓度(L)孔、高浓度(H)孔均红，判敏感；低浓度(L)孔变黄、高浓度(H)孔红，判中敏；低浓度(L)孔、高浓度(H)孔均黄，判耐药。本发明的有益效果如下I、本发明通过培养液配方中杂菌抑制剂的设计，解决了细菌和真菌引起的假阳性问题；2、本发明通过培养液配方中促生长剂、生长指示剂的设计，解决了检测时间过长问题；3、本发明通过鉴别区的设计，解决了其它支原体引起的假阳性问题；4、本发明通过药敏区的设计，解决了快速准确的Mp药敏试验问题。
具体实施例方式下面将结合具体实施方法来详细说明本发明，在本发明的示意性实施及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。本发明的试剂盒由培养管、鉴别药敏板、无菌矿物油组成；其中，培养管指装在西林瓶内的培养液，由基础液、促生长剂、生长指示剂、杂菌抑制剂组成，具体是基础液目的是为Mp生长提供基本营养。可选市售的支原体培养基基础、Hayflick培养基(PPL0培养基)、改良马丁培养基中任一种，比例按说明书进行；促生长剂目的是提高Mp生长速度，缩短检测时间。主成分可选马血清、小牛血清中任一种，浓度在5% 20%间；添加成分可选用酵母浸出粉、丙酮酸钠、半胱氨酸、异抗坏血酸、自制卵黄液等成分，可单一或组合添加；生长指示剂由葡萄糖、酚红、脱氢酶色原底物组成，目的是使Mp稍有生长，培养液即出现颜色变化，从而缩短检测时间；杂菌抑制剂由万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶(TMP)等组合而成L ;可各种非支原体的杂菌生长，避免细菌、真菌引起的假阳性。药敏鉴别板有32个微孔，前4孔为鉴别区，后28孔为药敏试验区鉴别区孔内分别含干燥的精氨酸(Arg)、氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)、美兰(MB)、β-内酰胺类药物(β-Lac)，因Mp不分解精氨酸、还原TTC、耐受 并还原美兰、耐受β-内酰胺类药物，表现为特殊的颜色谱，从而能确认检出物是否为Mp ；药敏区共28微孔，2微孔/组，用于盛装14种不同的药物进行敏感性试验，同一组的两个微孔分别盛装不同浓度的相同药物。具体14种药物为红霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、四环素、强力霉素、米诺环素、罗红霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、克拉霉素、斯帕沙星、环丙沙星、壮观霉素。该试剂盒的具体制备如下I、培养管的制备先分别配制各组分，后将各组分混合，3. 6ml/瓶分装到西林瓶内即得。各组分制法为基础液称Hayflick培养基干粉38g，加蒸馏水750ml，溶解，调节ρΗ7· 4±0· 2，
O.22um孔径的微孔滤膜过滤；促生长剂酵母浸出粉3g溶于IOml蒸馏水中，O. 22um孔径的微孔滤膜过滤，与自制卵黄液20ml、小牛血清200ml混合；生长指示剂葡萄糖5g、脱氢酶色原底物50mg、0. 4%酚红10ml、蒸馏水20ml混合溶解，O. 22um孔径的微孔滤膜过滤；杂菌抑制剂取万古霉素10mg、二性霉素B5mg、多粘菌素B 25000U、甲氧苄氨嘧啶5mg溶解于IOml蒸懼水中，O. 22um孔径的微孔滤膜过滤；2、鉴别药敏板的制备准备溶液鉴别微孔液以甲醇为稀释剂，按浓度要求分别配制Arg、TTC、MB、β -Lac溶液，按IOOul/ 孔计算，终浓度 Arg 为 O. 5%，TTC 为 O. 05%，MB 为 O. 2%，β -Lac 为 100mg/L ；药敏微孔液以国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)公布的判定药物敏感MIC值为低浓度标准(L)、耐受MIC值为高浓度标准(H)，以甲醇为稀释剂，分别配制14种药物的28种相应浓度的溶液；包被50ul/孔加至特定微孔中；干燥25°C避光干燥；封装装入铝箔袋封口。使用该试剂盒检测肺炎支原体的检测方法，包括以下步骤将样本拭子放入培养管的培养液中充分洗脱挤干；再将培养液以100微升每孔(ul/孔)的量加入至药敏鉴别板的微孔中；
将矿物油以I滴每孔的量添加至各个微孔中；将试剂盒放置在35°C 37°C的环境下培养24 72小时，根据微孔颜色变化判定结果。结果判断如下鉴别区Arg-TTC_MB- β -Lac表现为黄-红-黄绿-黄为Mp，否则为其它支原体；药敏区同种药物低浓度(L)孔、高浓度(H)孔均红，判敏感；低浓度(L)孔变黄、高浓度(H)孔红，判中敏；低浓度(L)孔、高浓度(H)孔均黄，判耐药。以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例 对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式
以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
权利要求
1.一种肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括 培养管，在所述培养管内盛装有为肺炎支原体(Mp)生长提供基本营养的基础液、提高肺炎支原体(Mp)生长速度的促生长剂、指示肺炎支原体(Mp)生长进度的生长指示剂、以及抑制其他杂菌生长的杂菌抑制剂； 药敏鉴别板，该药敏鉴别板包括鉴别区和药敏试验区；所述鉴别区包括四个鉴别微孔，所述四个鉴别微孔分别盛装有干燥的精氨酸(Arg)、氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)、美兰(MB)、以及β-内酰胺类药物(β-Lac);所述药敏试验区包括14组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔，在各组药敏检测单元内分别盛装有红霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、四环素、强力霉素、米诺环素、罗红霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、克拉霉素、斯帕沙星、环丙沙星、以及壮观霉素，其同一组药敏检测单元的两个药敏微孔中盛装的药物浓度不相同；以及 盛装有无菌矿物油的容器单元。
2.根据权利要求I所述的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于 所述基础液为支原体培养基基础、Hayflick培养基、改良马丁培养基中的任一种。
3.根据权利要求I所述的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于 所述促生长剂包括主成分和添加成分； 所述主成分为浓度5% 20%的马血清或小牛血清； 所述添加成分为酵母浸出粉、丙酮酸钠、半胱氨酸、异抗坏血酸、卵黄液中的一种或几种。
4.根据权利要求I所述的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于 所述生长指示剂包括葡萄糖、酚红、以及脱氢酶色原底物。
5.根据权利要求I所述的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于 所述杂菌抑制剂包括万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B、以及甲氧苄氨嘧啶(TMP) ο
6.一种使用权利要求I所述试剂盒检测肺炎支原体的检测方法，其特征在于包括以下步骤 将样本拭子放入培养管的培养液中充分洗脱挤干； 再将培养液以100微升每孔(ul/孔)的量加入至药敏鉴别板的微孔中； 将矿物油以I滴每孔的量添加至各个微孔中； 将试剂盒放置在35 V 37 °C的环境下培养24 72小时，根据微孔颜色变化判定结果O
全文摘要
本发明涉及一种肺炎支原体检测技术领域，具体公开了一种肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括培养管、药敏鉴别板、以及盛装有无菌矿物油的容器单元，在培养管中盛装有基础液、促生长剂、生长指示剂、以及杂菌抑制剂，药敏鉴别板包括鉴别区和药敏试验区。本发明通过培养液配方中杂菌抑制剂的设计，解决了细菌和真菌引起的假阳性问题；本发明通过培养液配方中促生长剂、生长指示剂的设计，解决了检测时间过长问题；本发明通过鉴别区的设计，解决了其它支原体引起的假阳性问题；本发明通过药敏区的设计，解决了快速准确的Mp药敏试验问题。因此，本发明能够有效避免假阳性，且检测周期更短。
文档编号C12Q1/18GK102888441SQ20111020320
公开日2013年1月23日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者农高惠 申请人:农高惠