专利名称：一种针对trappc4基因靶点的小干扰rna及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种小干扰RNA，特别是一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA及用途。
背景技术：
目前大肠癌的治疗主要采用外科治疗、化疗和放射治疗，但是可以接受手术者比例较小，而后两者是副作用大。RNA干扰(RNA interference, RNAi)也称转录后基因静默(post transcriptional gene silencing, PTGS),是小片段双链 RNA (20_30bp) (smallinterfering RNA, siRNA)分子阻断或降低同源基因表达的现象，可涉及到生命各阶段基因表达的关闭和调控。目前RNAi已成为一门独立的技术，作用靶点特异性高、对细胞毒性小、相对安全，主要用于反向功能基因组学研究和特异性基因治疗研究，其临床应用也已经收到越来越广泛的关注。而选择特异有效的靶点，是其疗效的关键。 大肠癌是世界范围内发病率和死亡率均排第三位的肿瘤，随着国人饮食习惯的西化，我国大肠癌的发病率呈上升趋势，目前已占恶性肿瘤发病率的四到六位。鉴于多数大肠癌被发现时已届中晚期，疗效往往不尽人意，故大肠癌的预防至关重要。目前的内镜筛查手段，和现有的药物(C0X-抑制剂等)虽然有一定的效果，但医疗条件、药物副作用等原因使其使用受限。因此，有必要而且有可能在深入研究大肠发生机制的基础上发现新的防治靶点，并进行特异靶向性治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA及用途，所述的这种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA及用途要解决现有技术中的外科治疗、化疗和放疗手段治疗大肠癌效果不佳的技术问题。本发明提供了一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA (本发明的名称为TRAPPC4-siRNA.)，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，反义链的核苷酸序列如SEQID NO 2 所示。本发明还提供了上述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。本发明还提供了上述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因。进一步的，上述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因，其核苷酸序列分别为 5 ' -ccggtgtccattcgatttg-3 ' (SEQ ID NO :4),或 5 ' -caaatcgaatggacaccgg-3' (SEQ ID NO :5)。本发明还提供了上述的编码基因在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。本发明的还提供了一种抑制大肠癌细胞ERK-MAPK信号通路的方法，是将上述的这种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA转染大肠癌细胞，使TRAPPC4的表达沉默，ERK-MAPK信号通路的激活得到抑制。
本发明还提供了一种siRNA的祀向分子运输蛋白微粒复合体(Traffickingprotein particle complex, TRAPPC4)，其喊基序列如 SEQ IDNO 3 所不。本发明还提供了上述的这种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。TRAPPC4，又称Synbindin或HSPC172，属于TRAPPC家族一员。后者是一种大型的多蛋白复合体，涉及内质网_ 闻尔基体以及闻尔基体内的运输。目如发现，TRAPPOi存在于树突，突触，高尔基体，内质网等细胞结构内。它能和多配体聚糖的羟基末端结合，参与蛋白的运输。在海马神经元中TRAPPC4涉及突触膜的运输从而调节树突棘的形成。也有研究发现其在造血细胞中的表达有异常，但是关于其在肿瘤中的作用几乎未见报道。本发明还通过实验证明将本发明TRAPPC4_siRNA转染人大肠癌细胞，使其中的TRAPPC4基因表达沉默，进而可以抑制ERK-MAPK信号通路的激活，从而抑制大肠癌细胞的增殖，诱导其凋亡。因此可以将TRAPPC4作为分子靶点，将TRAPPC4-siRNA的编码基因作为活性成分制备成药物，用于大肠癌的治疗。本发明和已有技术相比，其技术效果是显著的。本发明可以有效且特异的抑制大肠癌细胞的增殖，诱导大肠癌细胞的凋亡，从而起到肿瘤治疗的作用。
图I是免疫共沉淀实验，用于证明TRAPPC4与ERK2的相互结合。图2是GST Pull-down实验，用于证明TRAPPC4与ERK2的相互结合。图3组织芯片结果显示TRAPPC4在正常大肠上皮(a)、大肠腺瘤(b)、大肠腺癌(C)中的表达情况；d为相应的统计图。图4组织芯片结果显示ERK1/2在正常大肠上皮(a)、大肠腺瘤(b)、大肠腺癌(C)中的表达情况；d为相应的统计图。图5组织芯片结果显示pERKl/2在正常大肠上皮(a)、大肠腺瘤(b)、大肠腺癌(C)中的表达情况；d为相应的统计图。图6显示了 TRAPPC4-siRNA干扰大肠癌细胞株SW1116 48小时后，a)总ERK1/2表达没有显著改变而pERKl/2表达水平明显减少；b)凋亡相关蛋白；c)TRAPPC4蛋白表达水平明显下降。图7显示了用CCK-8方法检测细胞增殖情况，发现24、48、72、96小时，细胞增殖能力降低，在第48小时达到最低点。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用小干扰RNA由上海吉玛生物技术公司合成。实施例I TRAPPC4与ERK2的相互作用及其在大肠癌中的特异表达I TRAPPC4与ERK2相互作用的发现与验证I. I TRAPPC4与ERK2相互作用的发现用PCR方法扩增ERK2基因(引物及反应条件见附);酶切及胶回收后行连接反应得到重组质粒，转化入感受态细胞，接菌培养后抽提质粒，采用膜检的方法，检测Laz基因表达情况，即ERK2基因的自激活检测。用400ug人Hela cDNA酵母双杂交文库质粒DNA转化已含有PGB-ERK2的Y190酵母感受态细胞，涂布SC/-Trp-Leu_His+3AT的筛选平板。同时用不同的浓度梯度I 1000，I 10000，I 100000各涂布100 μ I菌液于3个SC/-Trp-Leu培养平板，作为计数板以检测转化效率，生长60h后计数。将转化平板在30°C培养60h后，用绒布对所有筛选平板进行影印清除，至完全看不到菌落为止。再将平板放入30°C培养60h以上，挑取长出的阳性克隆转入SC/-Trp-Leu板上划线培养18h。将平板重新影印到SC/-Trp-Leu-His+3AT平板上以检测报告基因His3的表达与否。挑取该平板上长出的菌体做膜检，检测报告基因LacZ的表达情况。将显色变蓝的克隆送测序，将测序结果进行Blast比对，发现TRAPPC4基因。> PCR 引物ERK2-F 5， -GTA TCG CCG GCC AAT CCG GCC ATG GCG GCG GCG GCG GCG GC-3， (SEQ IDNO 6)·ERK2-R 5， -CGC TGC AGG GCC TCT AAG GCC TTA AGA TCT GTA TCC TGG CTG GCTGGA ATCTAG C-3’ (SEQ ID NO :7)> . PCR反应条件表I. PCR扩增ERK2基因反应程序
权利要求
1.一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA，其特征在于其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.权利要求I所述的一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。
3.权利要求I所述的一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因。
4.如权利要求3所述的一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示。
5.权利要求3或4所述的一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。
6.一种抑制大肠癌细胞ERK-MAPK信号通路的方法，其特征在于将权利要求I所述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA转染大肠癌细胞，使TRAPPC4的表达沉默，ERK-MAPK信号通路的激活得到抑制。
7.—种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体，其特征在于其碱基序列如SEQ IDNO 3所示。
8.权利要求7所述的一种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA，其正义链的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，反义链的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。本发明还提供了上述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。本发明还提供了一种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体及其在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。本发明通过实验证明将针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA转染人大肠癌细胞，使其中的TRAPPC4表达沉默，进而可以抑制ERK-MAPK信号通路的激活，从而抑制大肠癌细胞的增殖，诱导其凋亡，因此可用于大肠癌的治疗。
文档编号C12N15/85GK102899325SQ20111021718
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者赵树靓, 房静远 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院